Name: Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a injetar vetores virais de lentivirus diretamente na medula espinhal de ratos para rastreamento retrógrado de circuitos neurais. Este método permite visualizar vias motoras e avançar em terapias gênicas.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso R01 R01NS103481 e o Shriners Hospital para investigação pediátrica concede SHC 84051 e SHC 86000 e o departamento de defesa (SC140089).

Todos os procedimentos de cuidados cirúrgicos e animais a seguir foram aprovados pelo Animal cuidados e uso Comitê da Temple University.
1. pré-cirúrgicas preparações
<ol><li>Prepare-se agulhas de vidro puxado para injeção viral alguns dias antes da cirurgia usando 3,5 nanolitros capilar pipeta de vidro projetada para injetores de nanolitros. Puxe cada pipeta um puxador de agulha de duas etapas de acordo com as instruções do fabricante para criar dois modelos de agulha.</li>
	<li>Refine a dica dos modelos de agulha cortando aproximadamente 1-2 mm do excesso de vidro com micro-tesouras. Tamanho de abertura aproximada de medida sob um microscópio com uma lâmina de microscópio de calibração para isolar as agulhas com aberturas de 30-40 µm.</li>
	<li>Com a agulha posicionada em 30°, use um chanfrador micropipeta para criar uma ponta com um 30-40 µm abertura e um ângulo de 45° chanfrada. Verifique se a largura de abertura com a escala Vernier do slide de calibração. Passe água e etanol através da agulha de vidro usando uma seringa com um acessório de agulha flexível para lavar os restos e marcar a agulha em intervalos regulares com um marcador preto.</li>
	<li>Coloque as agulhas em um prato coberto de Petri previamente limpado com 70% de etanol e esterilizar por 30 min em uma capa de biossegurança sob luz UV.</li>
	<li>Prepare HiRet lentivirus removendo um volume adequado do freezer imediatamente antes do procedimento. Nota: Um volume adequado inclui a quantidade necessária para a injeção (1 µ l por injecção x número de injeções) e mais uma pequena quantidade de volume extra para dar conta pipetagem e perdas de carga. Transportar e armazenar o vírus no gelo quando não estiver em uso.</li>
	<li>Prepare o injector, conectá-lo à microbomba e colocá-lo em um micromanipulador com escala Vernier.</li>
	<li>Para preparar a agulha de vidro, com cuidado, carregar um corante colorido como óleo vermelho com uma seringa, equipado com uma agulha flexível. Certifique-se de que não há bolhas permanecem na agulha. Utilizar técnica asséptica ao manusear a agulha e abster-se de tocar a ponta.</li>
	<li>Insira a agulha de vidro o injector, garantindo que a agulha está encaixada corretamente para as anilhas, tampa do injector é na apertadas e estende-se a agulha de aço injector aproximadamente ¾ do comprimento da agulha vidro. Vírus podem ser carregado na agulha em uma etapa posterior.</li>
</ol>2. anestesia e preparação do local cirúrgico
<ol><li>Pese o animal em uma balança digital. Registro do peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário e para permitir o acompanhamento do pós-operatório de peso. Femininos ratos Sprague-Dawley cerca de 200 – 250 g foram utilizados no presente protocolo.</li>
	<li>Anestesiar o rato usando uma solução de xilazina/cetamina injetada ou inalação de isoflurano (k / x). Aqui, a cetamina é injetada intraperitonealmente em 67 mg/kg de xilazina com uma dose de 6,7 mg/kg.</li>
	<li>Confirme um plano adequado de anestesia por beliscar o pé firmemente. Se ocorrer retirada reflexiva, espere alguns minutos adicionais antes de prosseguir. Nota: Também observe os bigodes, olhos e taxa de respiração de sinais de consciência. Se os bigodes são espasmos, o olho pisca quando tocou suavemente, ou respiração é rápida e superficial, espere até que o plano anestésico é mais profundo para prosseguir com o protocolo. Também monitore estes sinais durante a cirurgia de laminectomia e injeção. Se o animal exibe um plano superficial de anestesia, administrar uma injeção de cetamina somente igual a ½ o original k / x dosagem.</li>
	<li>Raspe o rato ao longo da linha média dorsal dos quadris para o ângulo inferior das escápulas. Puxe a pele do animal esticada para um barbear mais fácil e mais preciso.</li>
	<li>Aplica a pomada oftálmica de ambos os olhos.</li>
	<li>Aplica anti-séptico para a área depilada para esterilizar o local. Para o esfoliante primeiro, embeba gaze estéril com uma solução de iodo 5% e limpe afastado todo o cabelo e detritos. Siga isto com um furto unidirecional com gaze estéril embebida em álcool 70%, para que nenhuma área é contactada duas vezes. Use essa mesma técnica com a alternância de iodo e gaze embebida em álcool etílico mais duas vezes.</li>
</ol>3. cirúrgico campo e instrumento de preparação
<ol><li>Prepare um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave que incluem um bisturi, ruginas, pinça dente de rato, tesoura de mola, hemostatos, fórceps de ponto médio curvado e retractores ou ganchos ponderados por desembrulhar o envoltório estéril para criar um campo estéril.</li>
	<li>Abrir um pacote de luvas cirúrgicas estéreis e colocar o envoltório da luva estéril sobre a mesa. Use isto como um campo estéril adicional para ferramentas usadas para evitar a contaminação do envoltório estéril.</li>
	<li>Solte uma lâmina de bisturi de #10 no campo estéril. Fixe a lâmina de um identificador com hemostatos. Soro fisiológico estéril de posição, 4,0 sutura catgut crómico e materiais para controle do sangramento como um cauterizador, gaze estéril, estéril aplicadores com ponta de algodão (para hemorragias musculares), ou gelfoam ou bonewax (para sangramentos de osso), em local acessível.</li>
	<li>Recuperar o animal e defini-la em um pano estéril. Coloque gaze por baixo da bexiga para coletar a urina. Escorar a área do alvo com uma toalha enrolada sob o abdômen. Se estiver disponível, coloque uma compressa cirúrgica por baixo do pano estéril, especialmente para procedimentos mais longos. Nota: A esterilidade é importante durante a cirurgia de sobrevivência. Mantenha uma garrafa de spray de etanol a 70% na mão para manter a esterilidade de mãos enluvadas e um esterilizador de grânulo de uso se a esterilidade do instrumento está comprometida, ou entre cirurgias individuais.</li>
</ol>4. expor a coluna vertebral e identificando o site laminectomia
<ol><li>Identifica a área onde uma incisão de pele será feita pressionando suavemente os dedos da última costela para localizar a vértebra L1. Usando isto como um marco, faça uma incisão de pele de 3-4 cm com um bisturi cirúrgico #10 terminando apenas inferior ao L1 para expor o músculo. Estique a pele espalhando suave e pressione firmemente com a lâmina de bisturi para garantir uma incisão limpa.</li>
	<li>Corte e espalhar a gordura superficial com fórceps e a tesoura, se necessário. (Dependendo da vértebra alvo, lá pode ou não ser um grande do tecido superficial ao músculo).</li>
	<li>Sente-se para os processos espinhosos com o apartamento de um dedo ou a lâmina de bisturi. Muitas vezes a área de linha média vai ser esboçada por um "V" da fáscia branco em ambos os lados. Fazer um pequeno corte rostral para permitir espaço agarrar firmemente um processo superior com pinça dente de rato e, em seguida, fazer 2 cortes longas e profundas mais próximo dos processos quanto possível. No ponto mais profundo do corte, a superfície dorsal das vértebras pode ser sentida com a lâmina de bisturi.</li>
	<li>Mantenha os músculos laterais lado com retractores ou ganchos ponderados para melhorar a visibilidade. Clara muscular em torno dos processos com um bisturi, tesoura de mola ou ruginas para determinar a forma de suas cabeças. Nota: Lembre-se que a medula espinhal não abrange todo o comprimento da coluna vertebral, como paradas de tecido de medula espinhal crescendo mais cedo no desenvolvimento do osso. Isto significa que o nível da coluna vertebral do alvo pode ser por baixo de uma forma diferente nomeada vértebra.</li>
	<li>Localize a T11 e os processos de T12 e T13 adjacentes. Nota: A assistência no direcionamento corretos níveis vertebrais pode ser encontrada em anteriores estudos delineando Marcos no mouse, que tem um muito semelhante e um atlas da medula espinhal de ratos estrutura vertebral6,33. Um processo espinhoso rostral como T9 deixe intacta a dar um marco na linha média.</li>
</ol>5. executar uma laminectomia
<ol><li>Uma vez que o alvo foi identificado corretamente, execute laminectomies aspectos dorsal do T11-T13. Espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrais, que são bons locais para inserir ruginas para a mordida inicial do osso. Segure as ruginas numa posição semi-cerrados para aumentar o controle fino.</li>
	<li>Remova os processos espinhosos e a face dorsal das vértebras, tendo pequenas mordidas com as ruginas. Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal ou perturbar a dura-máter. Levante ligeiramente com a pinça dente de rato para ajudar a puxar a medula espinhal, longe das vértebras e diminuir a tendência de bater o tecido da medula espinhal.</li>
	<li>Limpe osso fora da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média pode ser observado. Deixe uma janela que claramente mostra o tecido da medula espinhal e é livre de detritos.</li>
	<li>Toca suavemente a medula espinhal com fórceps. Alguns animais podem pular reflexivamente mesmo se seu plano anestésico é profundo. Aplica algumas gotas de um anestésico como a lidocaína diretamente para a medula espinhal para evitar saltar durante o procedimento de injeção.</li>
	<li>Prenda o animal em um suporte da coluna vertebral, estabilização fórceps para processos espinhosos rostrais e caudais para a janela de laminectomia de fixação. Levante o abdômen do animal usando o titular da coluna vertebral para anular o efeito de movimentos de respiração. Isto aumentará a agulha estabilidade e garantir a adequada profundidade de injeção.</li>
</ol>6. carregar vírus e posicionamento do injector
<ol><li>Carregar vírus para o injector de pipetagem aproximadamente 5 µ l em um pedaço de parafilm e posicionando a agulha para que a ponta está dentro da gota.</li>
	<li>Use a microbomba para retirar até 4 µ l do vírus a uma taxa de 20-100 nL/s.</li>
	<li>Coloque o controlador para injetar e liberar uma quantidade pequena de vírus da agulha para garantir que a ponta da agulha não está bloqueada. Limpe o excesso vírus com uma limpeza de laboratório. Nota: Uma seringa com uma agulha de aço de Hamilton pode ser usada como uma alternativa para pipetas de vidro puxado.</li>
	<li>Posicione o micromanipulador, de modo que a escala Vernier é visível e posicione a agulha à linha média da medula espinhal. Nota: A linha média às vezes pode ser localizada por um grande vaso sanguíneo, correndo na superfície anterior da medula espinhal. No entanto, isso pode variar em ratos individuais e direcionamento da linha média deve ser confirmada por comparação com um processo espinhoso intacto.</li>
	<li>Direto da agulha lateralmente por 0,8 mm, utilizando a escala Vernier sobre o micromanipulador.</li>
	<li>Abaixe a agulha até a medula espinhal até é recuo, mas não à punção, a dura-máter. Usando um rápido movimento de torção, perfure a dura-máter com a agulha até que tem afundado a uma profundidade de 1,5 mm.</li>
</ol>7. injectar vírus da medula espinhal
<ol><li>Quando a agulha estiver em vigor, programa o injector para injetar a uma taxa de 400 nL/min. confirmar que o vírus está entrando a medula espinhal, observando o andamento da parte dianteira de tintura. Deve haver nenhum escapamento óbvio ou abaulamento do tecido da medula espinhal. Se for observado vazamento, isso às vezes pode ser atenuado, reduzindo a velocidade de injeção para 200 nL/min.</li>
	<li>Finalizada a injeção, permitir que a agulha descansar na medula espinhal por 2 – 5 min (dependendo do volume injetado) para facilitar a difusão do vírus.</li>
	<li>Lentamente, retirar a agulha e mover para o próximo local da injeção. Injete 1 µ l de vírus em cada um dos 6 sites uniformemente espaçados aproximadamente 1 mm de distância ao longo do comprimento do tecido na coluna L1-L4. A mesma agulha pode ser utilizada para cada injecção, enquanto continua a funcionar corretamente.</li>
</ol>8. fechamento e pós-operatório cuidados da ferida
<ol><li>Remova o animal do suporte da coluna vertebral e tirar retractores ou ganchos utilizados para espalhar o músculo lateral. Certifique-se de que a ferida é clara de todos os detritos antes de fechar.</li>
	<li>Suture o músculo usando uma sutura catgut crómico 4.0. Corte fios de sutura, perto do nó para reduzir a probabilidade de irritação da pele interna.</li>
	<li>Grampeie a pele fechada usando clipes de 9mm a ferida. Para permitir a cura ideal, alinhe as bordas da pele antes de grampeamento.</li>
	<li>Coloque o animal em uma convecção da água aquecimento pad e monitor até sono.</li>
	<li>Injete 5 – 10 mL de solução salina estéril por via subcutânea para repor líquidos e um antibiótico como a cefazolina para prevenir a infecção. Quando o animal é ambulatório, colocá-lo de volta à sua jaula em casa e fornecer analgésicos iniciais.  Monitorar os ratos para qualquer sinal de dor e angústia e tratar de acordo com seu procedimento IACUC aprovado para alívio da dor.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Manipulação genética de neurônios do cérebro e da medula espinhal tem servido para destaque sensorial, motor e autonômicos caminhos via rastreamento fluorescente e para explorar o potencial de rebrota dos tratos neuronais após lesões27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direto a injeção de um vetor...

Vetores virais são importantes ferramentas biológicas que podem introduzir material genético em células a fim de compensar os genes defeituosos, proteínas de crescimento importante upregulate ou fabricar proteínas marcador que destacam a estrutura e as conexões sinápticas de seus alvos. Este artigo enfoca a injeção direta de um vetor de Lentivirus retrogradely transportável altamente eficiente para a medula espinhal de ratos a fim de destacar os principais vias motoras com rastreamento fluorescente.  Esse método também é altamente adequado para estudos de regeneração e crescimento axonal introduzir proteínas de interesse em diversas populações de neurônios e tem sido usado para silenciar os neurônios para estudos de mapeamento funcional1,2.
Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras da coluna vertebral foram elucidados através de estudos de injeção direta com marcadores clássicos como BDA e fluoro-ouro3,4,5,6,7 , 8. estes marcadores são considerados padrão-ouro, mas podem ter alguns inconvenientes tais como captação por axônios danificados ou axônios na passagem na substância branca em torno de uma injeção local de9,10,11 . Isto poderia levar a interpretações incorrectas de conectividade via e pode ser uma desvantagem em estudos de regeneração onde a absorção de corante por axônios danificados ou cortados poderia ser confundida com regenerar fibras durante a posterior análise12.
Vetores de Lentivirus são populares em estudos de terapia de gene, que proporcionam uma expressão estável, a longo prazo em populações neuronal13,14,15,16,17,18 ,19. No entanto, tradicionalmente embalados vetores Lentivirus pode ter limitado transporte retrógrado e podem desencadear a resposta do sistema imunológico quando usado na vivo4,20,21. Um vetor de transporte retrógrado altamente eficiente, denominado HiRet foi produzido por Kato et al., modificando o envelope viral com uma glicoproteína do vírus da raiva para criar um vetor de híbrido que melhora o transporte retrógrado22,23.
Rastreamento retrógrado introduz um vetor no espaço sináptico de um neurônio alvo, permitindo que ele seja retomado pelo axônio da célula que e transportados para o corpo celular. Transporte bem sucedido de HiRet foi demonstrada de sinapses neuronais no cérebro de ratos e primatas23,24 e do músculo em neurônios motores22. Este protocolo demonstra injeção na medula espinhal lombar, alvejando especificamente os terminais sinápticos dos propriospinal interneurônios e neurônios do tronco cerebral. PNs recebem conexões de muitos diferentes caminhos da coluna vertebral e, assim, podem ser utilizados para atingir uma população diversa de neurônios na medula espinhal e tronco cerebral. Rotulada de neurônios neste estudo representam circuitos que inervam o neurônio motor piscinas relativas a função motora do membro posterior. Etiquetando robusto é visto na medula espinhal e tronco cerebral, incluindo detalhes de alta fidelidade de mandris dendríticas e axônio terminal. Também usamos este método em estudos anteriores no interior da medula espinhal cervical para rotular propriospinal e tronco cerebral reticulospinal vias25.
Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral na medula espinhal lombar de um rato. Como visto no filme 1, identificando a vértebra L1 localizada da última costela, destina-se a incisão. Isso é usado como um marco de caudal para uma incisão de 3-4 cm que expõe a musculatura ao longo da medula espinhal de L1-L4. Laminectomies dos aspectos dorsais das vértebras T11-T13 são executadas e uma agulha de vidro chanfrado é dirigida a 0.8 mm lateral da linha média e baixou 1,5 mm profundamente na matéria cinzenta para injetar o vírus.

<table><tbody><tr><td>#10 Lâminas de bisturi</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-10</td><td>Para uso com o bisturi.</td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>Para injeção de IP anestésico, possíveis doses de reforço anestésico e injeções de antibióticos.</td></tr><tr><td>Seringas de 10mL</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309604</td><td>Para injetar solução salina no animal, pós-cirurgia.</td></tr><tr><td>4.0 Sutura de categute crômica</td><td>DemeTECH</td><td>NN374-16</td><td>Para religar o músculo durante o fechamento.</td></tr><tr><td>48000 Micropipeta Beveler</td><td>World Precision Instruments</td><td>32416</td><td>Usado para chanfrar as pontas dos tubos capilares de vidro puxados para formar agulhas de vidro funcionais.</td></tr><tr><td>Solução de Iodo a 5%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>L01020-08</td><td>Para uso na esterilização do local cirúrgico.</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para esterilização de agulhas de vidro recém-preparadas, modelos animais durante a preparação cirúrgica e mãos do cirurgião durante a cirurgia, bem como todas as outras pequenas manutenções de esterilidade.</td></tr><tr><td>Anestésico (Solução de Cetamina/Xilazina)</td><td>Zoetis</td><td>240048</td><td>Para manter o animal no plano correto de consciência durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Antibiótico (cefazolina)</td> <td>West-Ward Pharmaceuticals</td><td>NPC 0143-9924-90</td><td>Para ser injetado por via subcutânea para prevenir infecções pós-cirúrgicas.</td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas</td><td>CellPoint</td><td>5-1450</td><td>Para esterilizar instrumentos cirúrgicos por calor.</td></tr><tr><td>Ferramentas de</td><td>Ciência Fina</td> Bonewax <td>19009-00</td><td>Para selar o osso em caso de sangramento ósseo.</td></tr><tr><td>Ferramentas Cauterizer</td><td>Fine Science</td><td>18010-00</td><td>Para selar quaisquer artérias ou veias cortadas durante a cirurgia para prevenir perda excessiva de sangue.</td></tr><tr><td>Balança Digital</td><td>Okaus</td><td>REV.005</td><td>Para pesagem do animal durante o preparo cirúrgico.</td></tr><tr><td>Acessório de agulha flexível</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Para limpar agulhas de vidro e carregar óleo vermelho em agulhas de vidro.</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pfizer</td><td>H68079</td><td>Para selar o osso em caso de sangramento ósseo.</td></tr><tr><td>Instrumentos capilares de vidro</td><td>4878</td> da <td>precisão do mundo</td><td>dos tubos para agulhas de vidro puxadas - deve ser projetado para injetores do nanolitro.</td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo</td><td>Oster</td><td>111038-060-000</td><td>Para limpar o local cirúrgico do cabelo.</td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Roboz</td><td>RS-7231</td><td>Para uso geral em cirurgia.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Para uso geral em cirurgia.</td></tr><tr><td>Fórceps Curvo de Ponta Média</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>Para uso geral em cirurgia.</td></tr><tr><td>Micromanipulador com escala de nônio</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td>Para direcionamento preciso durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>Para cortar chiados de vidro de tubos capilares de vidro recém-puxados.</td></tr><tr><td>Microscópio com Luz e Escala Vernier Ocular</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>N/A</td><td>Usado para visualizar e medir o chanfro de tubos capilares de vidro puxados em agulhas de vidro funcionais.</td></tr><tr><td>Controlador de Bomba MicroSyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>62403</td><td>Para controlar a taxa de injeção.</td></tr><tr><td>Nanolitro 2000 Cabeça de Bomba Injetora</td><td>World Precision Instruments</td><td>500150</td><td>Para carregar e injetar vírus de forma controlada.</td></tr><tr><td>Extrator de agulhas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>Para aquecer e separar tubos capilares de vidro para formar agulhas de vidro.</td></tr><tr><td>Pomada oftalâmica</td><td>Dechra Produtos Veterinários</td><td>RAC 0119</td><td>Para proteger os olhos do animal durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Para ajudar no carregamento do vírus no nanoinjetor.</td></tr><tr><td>Agulhas PrecisionGlide (25G x 5/8)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Para uso com as seringas de 1mL e 10 mL para permitir a injeção do modelo animal.</td></tr><tr><td>Fórceps de dente de rato</td><td>Roboz</td><td>RS-5152</td><td>Para processos espinhosos de gripe.</td></tr><tr><td>Óleo Vermelho</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para fornecer uma frente para visualização do vírus que entra no tecido durante a injeção.</td></tr><tr><td>Afastadores</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>Para manter aberta a ferida cirúrgica.</td></tr><tr><td>Comprimidos Rimadyl</td><td>Bio Serv</td><td>MP275-050</td><td>Para controle da dor pós-cirurgia.</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>Para remover o músculo da coluna vertebral durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Cabo de lâmina de bisturi</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Para cortar a pele aberta e a almofada de gordura do modelo animal durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>Para uso geral em cirurgia.</td></tr>Clipes de aço <tr><td>inoxidável CellPoint</td><td></td><td>201-1000</td><td>Para ligar a pele da ferida cirúrgica durante o fechamento.</td></tr><tr><td>Pinça de remoção de grampos</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750347</td><td>Para remover os grampos, caso sejam aplicados incorretamente.</td></tr><tr><td>Produtos de pesquisa estéreis</td><td>BP-989</td> de <td>Phenix</td><td>de pano Para fornecer uma superfície estéril para a operação.</td></tr><tr><td>Aplicadores estéreis com ponta de algodão</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Para absorver o sangue na ferida cirúrgica, mantendo a esterilidade.</td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>Para limpar a área cirúrgica e as ferramentas cirúrgicas, mantendo a esterilidade.</td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>281324</td><td>Para uso na limpeza do sangue e na reposição de fluidos pós-cirurgia.</td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para uso pelo cirurgião para manter o campo estéril durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento cirúrgica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para manter a temperatura corporal do modelo animal durante a cirurgia.</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para uma melhor visualização da ferida cirúrgica.</td></tr><tr><td>Grampeador cirúrgico</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750546</td><td>Para aplicar os grampos.</td></tr><tr><td>Bomba de água de terapia de calor T / Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP500C</td><td>Para bombear água quente para a almofada de aquecimento de convecção de água.</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento de convecção de água</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>L1K018</td><td>Para uso na área de recuperação pós-operatória para manter a temperatura corporal do animal inconsciente.</td></tr><tr><td>Ganchos ponderados</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para manter aberta a ferida cirúrgica.</td></tr></tbody></table>

injeção direta de um vetor de lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introdução de proteínas de interesse em células do sistema nervoso é um desafio devido às barreiras biológicas inatas que limitam o acesso à maioria das moléculas. Injeção diretamente no tecido da medula espinhal ignora estas barreiras, fornecendo o acesso aos corpos celulares ou sinapses onde moléculas podem ser incorporadas. Combinando a tecnologia de vetor viral com este método permite a introdução de genes-alvo no tecido nervoso, com a finalidade de terapia genética ou rastreamento de trato. Aqui um vírus projetado para o transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) é introduzido nas sinapses dos interneurônios propriospinal (PNs) para incentivar o transporte específico de neurônios na medula espinhal e núcleos do tronco cerebral. Direcionamento de PNs tira proveito das inúmeras conexões que recebem de vias motoras como o trato rubrospinal e reticulospinal, bem como a sua interligação com os outros ao longo de segmentos da medula espinhal. Representante rastreamento usando o vetor de HiRet com constitutivamente ativo proteína verde fluorescente (GFP) mostra detalhes de alta fidelidade de corpos celulares, axônios e mandris dendríticas no PNs torácicas e nos neurônios reticulospinal na formação reticular Pontinas. HiRet incorpora bem em vias no tronco cerebral e PNs mas mostra integração dependente de idade nos neurônios do trato corticoespinhal. Em resumo, a medula espinhal injeção usando vetores virais é um método adequado para a introdução de proteínas de interesse em neurônios de extensões específicas.

Bem sucedida injeção e transporte do vetor viral devem resultar na transdução de uma população robusta de unilaterais neurônios na medula espinhal e em certos núcleos do tronco cerebral. A Figura 1 demonstra rotulagem estereotipada dos neurônios e axônios na medula espinhal torácica e na Pontinas formação reticular do tronco cerebral no pós-injeção de quatro semanas. Expressão significativa de GFP é visto nos neurônios na massa cinzenta da medula espinhal torácica no lado...

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Vetores virais podem introduzir material genético nas células para compensar genes defeituosos, para regular proteínas importantes de crescimento, ou para fabricar marcadores que possam rastrear circuitos neurais. Introduzir vetores virais no sistema nervoso é um desafio devido a barreiras biológicas inatas. A injeção direta no tecido medular contorna essas barreiras, permitindo o acesso a corpos celulares ou sinapses.Mirar corretamente os níveis de coluna L1 a L4 pode ser difícil. É importante usar pontos de referência para verificar o alvo e lembrar que esses segmentos se alinham às vértebras T11 a T13. No dia do procedimento, conecte o injetor na microbomba e coloque a microbomba em um micromanipulador com uma escala vernier.Use uma seringa com uma agulha flexível para carregar cuidadosamente um corante colorido em uma das agulhas de vidro e inserir a agulha de vidro no injetor. Em seguida, confirme que a agulha está semeada corretamente nas arruelas, e que a tampa do injetor está aparafusada em apertado, e que a agulha do injetor de aço é estendida aproximadamente três quartos do comprimento da agulha de vidro. Antes de iniciar o procedimento, descongele pelo menos um microliter, além de um pequeno volume de vírus extra por injeção do armazenamento do congelador, e confirme a falta de resposta de beliscão do dedo do pé em um rato anestesiado.Raspe ao longo da linha dorsal dos quadris até o ângulo inferior da escápula do animal, puxando a pele esticada para uma barba mais fácil e precisa, e desinfetar a pele exposta com esfogem sequenciais 5% de iodo e 70% de etanol. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos. Em seguida, coloque o animal em um pano estéril e coloque gaze debaixo da bexiga para coletar qualquer urina.Para identificar o local da incisão da pele, pressione os dedos suavemente na última costela para localizar a vértebra L1. Usando esta vértebra como um marco e segurando a pele esticada por uma leve propagação enquanto pressiona firmemente com o bisturi, use uma lâmina cirúrgica número 10 para fazer uma incisão esfolada de três a quatro centímetros terminando apenas inferior à L1 para expor o músculo. Use fórceps e tesouras para sentir os processos espinhosos.Faça pequenos cortes rostrais para permitir que o espaço agarre com segurança em um processo superior com fórceps de dentes de rato. E fazer dois cortes longos e profundos o mais próximo possível dos processos. Depois de fixar os músculos laterais no lugar, limpe o músculo ao redor dos processos para determinar a forma de suas cabeças.Em seguida, visualize as formas das cabeças dos processos espinhosos, a fim de identificar o local da laminectomia. Os processos T11 e T12 de junção serão o local da laminectomia. Uma vez que a área alvo tenha sido corretamente identificada, espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrales, e use rongeurs para tomar pequenas mordidas dos processos espinhosos e do aspecto dorsal das vértebras.Limpe o osso da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média possa ser observado, deixando uma janela que revela claramente o tecido medular e está livre de detritos. Em seguida, aperte as fórceps estabilizadores aos processos espinhosos rostral e caudal à janela laminectomia para fixar o animal em um suporte espinhal. E levantar o abdômen do animal para negar o efeito dos movimentos respiratórios.Para carregar o vírus no injetor, pipeta aproximadamente cinco microliters do estoque descongelado em um pedaço de Parafilm, e posicione as agulhas de vidro para que a ponta esteja dentro da gota. Use a micro-bomba para retirar até quatro microliters de vírus a uma taxa de 20 a 100 nanoliters por segundo, e defina o controlador para injetar antes de liberar uma pequena quantidade de vírus da ponta da agulha para garantir que ele não seja bloqueado. Limpe qualquer vírus em excesso com uma limpeza de laboratório e posicione os micromanipuladores para que a escala vernier seja visível.Coloque a agulha na linha média da medula espinhal, e use a escala vernier no micromanipulador para direcionar a agulha lateralmente 0,8 milímetros. Em seguida, abaixe a agulha para a corda espinhal até que esteja recuando, mas não perfurando, a dura, e use um movimento de torção rápida para perfurar a dura dura com a agulha até que a ponta da agulha tenha afundado a uma profundidade de 1,5 milímetros. Uma vez que a agulha esteja no lugar, programe o injetor para entregar o vírus a uma taxa de 400 nanoliters por minuto, e confirme que o vírus está entrando na corda espinhal observando o progresso da frente de corante.Uma vez que a injeção esteja concluída, deixe a agulha descansar na medula espinhal por dois a cinco minutos para facilitar a difusão do vírus, antes de retirar lentamente a agulha para posicionamento no próximo local de injeção. Após a última injeção, remova o animal do suporte da coluna vertebral para permitir a remoção de quaisquer dispositivos utilizados para espalhar o músculo lateral. Em seguida, feche o músculo com uma sutura de 4,0 cromica de catgut e grampeie a pele com clipes de ferida de nove milímetros.Quatro semanas após uma injeção bem sucedida, uma expressão de GFP significativa é observada nos neurônios dentro da matéria cinzenta da medula espinhal torácica ao lado, ipsilateral à injeção. Na matéria branca, a expressão GFP é observada nos axônios no cordão ipsilateral, especialmente em áreas típicas dos axônios propriospinais. Uma ampliação mais elevada dos neurônios de matéria cinzenta revela um exemplo de uma expressão típica de sinal em corpos de células neuronais e dendritos.A expressão GFP nos neurônios também pode ser observada em núcleos do tronco cerebral, como dentro da formação reticular pontina. Os principais fatores para um procedimento bem sucedido de injeção da medula espinhal são o direcionamento vertebral correto e garantir que o vírus esteja entrando no tecido Se uma lesão na medula espinhal rostral for realizada antes deste procedimento, a injeção direta pode ser usada para rastrear neurônios que restabelecem conexões ao redor da lesão.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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