Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Este método permite estudar o mecanismo básico da mielinação e remyelinação no nível celular e tissular. Esta técnica está na encruzilhada entre culturas primárias e abordagens in vivo. É um modelo rápido e acessível com a principal vantagem de preservar a arquitetura tecidual.

Demonstrando o procedimento estarão Melina Thetiot, pesquisadora de pós-doutorado e Remi Ronzano, doutoranda do meu laboratório. Para começar, insira uma pequena tesoura suavemente no foie magnum e corte o crânio fazendo uma incisão lateral em direção ao lado, e depois corte tudo ao redor do crânio da cabeça. Para recuperar a parte dorsal do crânio, use um fórceps fino e reto para levantar cuidadosamente a parte dorsal do crânio.

Em seguida, introduza cuidadosamente os fórceps entre o crânio ventral e o cérebro. Gentilmente solte o cérebro e corte os nervos ópticos e trigêmeos com uma tesoura pequena. Em seguida, vire a cabeça ou a parte dorsal do crânio de cabeça para baixo um pouco acima de um prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada para ajudar o cérebro a cair pela gravidade.

Usando fórceps finos, oriente o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e o lado ventral deitado. Sob o microscópio binóculo, use as fórceps retas para imobilizar o cérebro no lado do cérebro. Então, separe o cérebro traseiro do resto do cérebro.

Corte os peduncles cerebelares sob o cerebelo para separar o cerebelo do resto do cérebro traseiro. Uma vez que o cerebelo esteja isolado, use fórceps finos e retos para arrancar cuidadosamente as meninges. Segure o cerebelo suavemente com as fórceps finas e curvas e coloque-o com o lado dorsal sobre a plataforma de plástico, perpendicularmente à lâmina de barbear do helicóptero.

Em seguida, com uma ponta de pipeta estéril e fina presa a uma pipeta de um mililitro, aspire qualquer acesso de meio de dissecção ao redor do cerebelo. Em seguida, com um helicóptero de tecido, corte 300 micrômetros de seções sagita grossas do cerebelo. Em seguida, adicione uma gota de meio de dissecção no cerebelo fatiado suavemente.

Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, aspira lentamente o cerebelo fatiado e transfira-o de volta para o prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada. Em seguida, use dois fórceps finos e retos para separar fatias individuais. Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, transfira até quatro fatias selecionadas dos vermis, juntamente com algum meio de dissecção em uma inserção de cultura de uma placa de seis poços.

Remova qualquer acesso do meio de dissecção ao redor das fatias usando uma ponta de pipeta fina. Para desmielinização, remova todo o meio de cultura abaixo das pastilhas de cultura após seis dias in vitro, e substitua-o por um mililitro por poço do meio de cultura pré-aquecido e fresco contendo 0,5 miligramas por mililitro LPC. Incubar por 15 a 17 horas a 37 graus Celsius em ambiente de 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, lave as pastilhas colocando-as em uma placa de Petri de 25 mililitros contendo um mililitro de meio de cultura pré-aquecido. Em seguida, transfira imediatamente as pastilhas de cultura em uma nova placa de seis poços, contendo meio de cultura fresco e pré-aquecido. Para começar a imunohistoquímica, primeiro use fórceps para levantar pastilhas culturais e remover o meio de cultura abaixo deles.

Em seguida, adicione dois mililitros de 4%PFA em 1x PBS, ph 7.4, nas pastilhas de membrana para fixar as fatias cerebelares. Após 30 minutos, lave as fatias três vezes com dois mililitros de 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, sob o microscópio binóculo, usando uma ampliação de 25x a 30x, use um bisturi ou um pincel para separar suavemente as fatias das pastilhas de membrana.

Em seguida, use um pincel para transferir as fatias flutuantes para os poços de uma placa de quatro poços, contendo 1x PBS para limitar o consumo de anticorpos. Em seguida, aspire o PBS de cada poço e incuba as fatias em 100% de etanol pré-resfriado a menos 20 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Após a incubação, aspire o etanol 100% e lave as fatias brevemente com 1x PBS.

Em seguida, lave-os duas vezes à temperatura ambiente com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Para bloquear locais de fixação de anticorpos não específicos, aspire o PBS e incuba as fatias em uma solução contendo 1x PBS, 5%NGS e detergente não iônico de 0,3% à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Em seguida, adicione anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio e incubar as fatias a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a incubação durante a noite, lave as fatias três vezes com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, adicione os anticorpos secundários, diluídos na solução de bloqueio, em uma proporção de diluição de 500 e incubar as fatias à temperatura ambiente no escuro por três horas. Após a incubação com o anticorpo secundário, lave as fatias três vezes em 1x PBS no escuro por 10 minutos cada lavagem.

Em seguida, sob um microscópio binóculo, coloque 100 microletadores de 1x PBS no slide e com um pincel, transfira as fatias para o PBS e achate-as no slide. Remova qualquer acesso do PBS. Por fim, coloque uma gota de meio de montagem diretamente sobre o deslizamento da tampa de vidro e cubra delicadamente as fatias.

Imunostainings de mielina em fatias organotípicas cerebelares, obtidas nos dias de pós-natal 9 a 10 C57 preto seis camundongos do tipo selvagem foram observados em 11 dias in vitro com nós de ronviae enriquecidos em canais de sódio fechados de tensão, ladeados pelo domínio de junção axoglial paranodal. Os mesmos resultados foram observados para camundongos transgênicos PLP-GFP. A mielinação das células parkengy é alcançada principalmente após uma semana na cultura.

O tratamento LPC desmyelinas totalmente as fatias, que remyelinate espontaneamente e são totalmente mielinados seis dias após a demyelinação. Este procedimento deve levar 25 minutos no máximo. É realmente o ponto mais crítico.

A cultura de fatias organotípicas são adequadas para o estudo de imagem ao vivo da dinâmica da mielinação. Também pode ser usado para direcionar experimentos de triagem de drogas. Esta técnica permite uma abordagem fácil e quantitativa para estudar os processos de mielinação e remyelinação.

Os experimentadores devem seguir os procedimentos básicos de segurança aplicados ao bem-estar animal, mielinização excessiva e afiada.