Name: Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a preparar culturas de fatia organotípica do cerebelo de camundongo para estudo da mielinação e remielinação. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite análise por imunohistoquímica.

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Agradecemos o Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux por valiosos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, ICM, ARSEP subsídios R13123DD, R17127DD ANR (a D.C.) e comunhão FRM, SPF20110421435 (a A.D.), FDT20170437332 (para M.T.). Agradecemos a estrutura de cultura de células CELIS e o icm. Plataforma de imagem Quant.

Todos os trabalhos que envolvam animais respeitadas condições institucionais e orientações estabelecidas pela UPMC, INSERM e o francês e Europeu directiva comunitária 86/609/CEE.
1. preparação do meio de cultura e cultura insere (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)
Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis
<ol><li>Prepare-se 40 mL do meio de cultura, que consiste em 50% BME, equilibrada solução 25% do Hank salina (1x), soro, suplementado com derivado de glutamina 2 mM, 100 UI/mL penicilina-estreptomicina e 4,5 mg/mL, D-glicose 25% inactivadas pelo calor do cavalo. Ajuste o pH para 7,4.</li>
	<li>Filtro-esterilize o meio através de 0,22 μm filtro adaptado em uma seringa de plástico de 50 mL. Nota: Meio de cultura podem ser armazenado a 4 ° C pelo menos uma semana.</li>
	<li>Para uma padrão ninhada de 6 filhotes, use duas placas de alvéolos 6 estéril. Para cada prato, remova a tampa e adicione 1 mL de meio de cultura por bem.</li>
	<li>Inserção de uma cultura local em cada poço individual, segurando a borda plástica com Pinças esterilizadas. Coloque a tampa da placa. Nota: As fatias Cerebelares coletadas de um filhote (6-8) podem ser expedidas em duas membranas (3-4 fatias Cerebelares por inserção de membrana).</li>
</ol>2. preparação de dissecação médio (hands-on tempo ≈ 5 min)
Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis
<ol><li>Prepare 100 mL de meio de dissecação, que consiste solução do Gey salina balanceada suplementado com 4,5 mg/mL x D-glicose e 1 penicilina – estreptomicina (100 UI/mL cada).</li>
	<li>Filtro-esterilize o meio através de uma unidade de filtro 0.22 μm. Nota: O meio de dissecação pode ser armazenado a 4 ° C durante pelo menos um mês.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio de dissecação frio em pratos de cultura de células de 60 mm. Prepare um prato de cultura celular de 60 mm para cada filhote para serem dissecados.</li>
	<li>Mantenha os pratos de dissecação no gelo até o uso.</li>
</ol>3. preparação do material de dissecação (hands-on tempo ≈ 15 min)
<ol><li>Limpe o banco com 100% de etanol.</li>
	<li>Esterilize todos os instrumentos de dissecação, uma lâmina de barbear e plataforma de plástico do helicóptero tecido com 100% de etanol.</li>
	<li>Fixar a lâmina de barbear e a plataforma de plástico no helicóptero do tecido e ajustar a espessura de corte de 300 µm.</li>
	<li>Certifique-se de que todo o etanol evaporou-se antes de iniciar a dissecação.</li>
</ol>4. CerebellumDissection e preparação de secções (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min por animal)
<ol><li>Coloque um dos pratos de cultura 60mm célula contendo o meio de dissecação gelada sob o microscópio binocular e remover a placa superior.</li>
	<li>Limpe a pele da cabeça com etanol a 70% (com cuidado, evitando tocar os olhos do animal) e decapitar o animal com uma tesoura afiada grande, de acordo com o procedimento aprovado. Nota: As fatias Cerebelares são geradas a partir de P9-P10 ratos sem sexo específico ou tensão de polarização.</li>
	<li>Use tesoura pequena para cortar a pele ao longo da linha mediana da cabeça a partir do pescoço e indo até o focinho do rato.</li>
	<li>Para agarrar a cabeça e expor o crânio, dobre a pele ventralmente sob a cabeça e aperte as duas dobras da pele entre os dedos.</li>
	<li>Inserir suavemente a tesoura pequena o foramen magnum e cortar o crânio, tornando um lateral incisão para o lado e em seguida, corte ao redor do cabeça crânio. Mantenha a ponta da tesoura como paralelo e perto do crânio quanto possível durante o corte, para não danificar o tecido cerebral.</li>
	<li>Recupere a parte dorsal do crânio usando pinça fina-em linha reta. Simultaneamente, levante cuidadosamente a parte dorsal do crânio, cortar as meninges aderente (membrana irrigada translúcida em torno do tecido cerebral) se necessário com uma tesoura pequena para não danificar o tecido cerebral.</li>
	<li>Introduzir cuidadosamente bem reta pinça (ou alternativamente, usar uma espátula) entre o cérebro e o crânio ventral, delicadamente pirar o cérebro e corte a óptica e nervos trigêmeo com uma tesoura pequena.</li>
	<li>Ajuda o cérebro a cair por gravidade para o prato de cultura celular 60 mm contendo meio de dissecação gelada, girando a cabeça de cabeça para baixo logo acima do prato e liberação das aderências ontem com tesouras pequenas se necessário.</li>
	<li>Usando a pinça fina, Oriente o cérebro com o lado dorsal, virado para o pesquisador e o lado ventral deitado no fundo do prato.</li>
	<li>Sob o microscópio binocular, use a pinça fina reta para imobilizar o cérebro do lado do prosencéfalo e evite tocar o rombencéfalo, como ele pode ficar danificado. Separar o rombencéfalo do resto do cérebro (frente - e mesencéfalo, ver esquema na Figura 1Aa), usando a pinça fina-em linha reta. Para separar o cerebelo do resto do rombencéfalo, use a pinça fina para cortar os pedúnculos cerebelares por baixo do cerebelo (ver esquema na 1Aa figura ').</li>
	<li>Uma vez que o cerebelo é isolado, cuidadosamente rasgar as meninges usando pinça fina-reto (ver esquema na 1Aa figura ').
</li>
	<li>Mantenha o cerebelo suavemente com a pinça curva bem e coloque-a com o lado dorsal acima sobre a plataforma plástica perpendicularmente para a lâmina de barbear de helicóptero (ver esquema na Figura 1Bb).</li>
	<li>Aspire o excesso de meio de dissecação em torno do cerebelo usando uma ponteira de pipeta estéril de ponta fina, adaptada em um 1 mL pipeta (ver esquema na Figura 1Bb).</li>
	<li>Certifique-se que o cerebelo estabelece plana, mas não esticada, uma vez colocado na plataforma para obter fatias sagitais ideais durante o corte (ver esquema na Figura 1Bb).</li>
	<li>Fatia de 300 μm de espessura seções sagitais do cerebelo com o helicóptero do tecido (ver esquema na Figura 1Bb'). A força e a velocidade da lâmina tem que ser otimizado no site.</li>
	<li>Delicadamente adicione uma gota de meio de dissecação para o cerebelo fatiado. Usando uma ponta de pipeta de largo diâmetro colocada uma pipeta de 1 mL, lentamente, Aspire o cerebelo fatiado e transferi-lo de volta para o prato de cultura de células de 60 mm contendo meio de dissecação gelada (ver esquema na Figura 1Bb ').</li>
	<li>Limpe a plataforma de plástico do helicóptero tecido com 100% de etanol entre cada corte do cerebelo. Deixe o etanol evaporar antes de colocar o cerebelo próximo à plataforma.</li>
	<li>Use duas belas reta pinça (ou alternativamente agulhas de titânio) para separar as fatias individuais e selecione o vermis 6-8 fatias (ver esquema na Figura 1Cc e 1Cc').</li>
	<li>Pegue uma placa de 6 com inserções de cultura e transferir até 4 fatias selecionadas para inserir uma cultura junto com algum meio de dissecação, usando uma ponta de pipeta de largo diâmetro adaptada em uma pipeta de 1 mL (ver esquema na Figura 1Cc').</li>
	<li>Coloque as fatias no meio de inserção da cultura usando a dissecação médio ou fórceps para empurrar e puxá-los delicadamente no local certo, evitá-los para estar em contacto com os outros (ver esquema na Figura 1Cc').</li>
	<li>Remova qualquer excesso de meio de dissecação em torno as fatias com uma ponta de uma pipeta de ponta fina. Certifique-se de que as fatias deitado na membrana (ver esquema na Figura 1Cc').</li>
	<li>Coloque a placa de 6-poços em incubadora imediatamente após ter adicionado as fatias na membrana.</li>
</ol>5. fatias de cultura e desmielinização (hands-on tempo ≈ 15 – 20 min)
Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis
<ol><li>Substitua o meio de cultura com 1 mL por bem de meio de cultura fresco pré-aquecido e tamponado em 3 dias após a preparação da fatia.</li>
	<li>De desmielinização, remover todos os meio de cultura abaixo a cultura insere após 6 dias in vitro (DIV) e substituí-lo com 1 mL por bem de meio de cultura fresco pré-aquecido contendo 0,5 mg/mL LPC. Incube por 15-17 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, lave as inserções, colocando-os em um prato de petri de 25 mm contendo 1 mL de meio de cultura previamente aquecido. Nota: As pastilhas devem estar em contacto com o meio, mas não por ela abrangidos.</li>
	<li>Transferi imediatamente as inserções de cultura em uma nova 6 placa contendo meio de cultura fresco pré-aquecido.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura com 1 mL de meio de cultura fresco pré-aquecido a cada 2-3 dias até fatias de fixação.</li>
</ol>6. imuno-histoquímica (hands-on tempo ≈ 01:30 – 2 h)
Nota: Realize as etapas 6.1. a 6.3. sob uma coifa. Evitar a exposição ao paraformaldeído (PFA) e consulte a ficha técnica de segurança do produto para a manipulação adequada e proteção.
<ol><li>Uso de fórceps para levantar cada cultura insere segurando a borda do plástica e remove o meio de cultura sob as inserções de membrana de cada poço.</li>
	<li>Corrigir as fatias Cerebelares por 30 min, adicionando 2 mL de 4% PFA em 1 x pH PBS 7.4 para as inserções de membrana. Nota: Ponto de fixação de tempo depende do estágio de mielinização estudada: DIV 4 corresponde ao aparecimento de mielinização, 7 DIV para fatias totalmente mielinizadas. Em caso de tratamento de LPC, DIV 9 corresponde ao pico de desmielinização, 11 DIV ao aparecimento de mielinogênese e 14 DIV para fatias de remyelinated totalmente.</li>
	<li>Lave as inserções com as fatias de três vezes com 2 mL 1X PBS para 10 min.</li>
	<li>Separe as fatias as inserções de membrana sob o microscópio binocular usando um x 25 para ampliação de 30x, empurrando suavemente-los usando um bisturi ou um pincel. Como alternativa, para evitar o risco de danificar as fatias enquanto eles desanexação da membrana, use um bisturi para cortar a membrana com as fatias ainda ligadas.</li>
	<li>Transferi as fatias flutuantes para os poços de uma placa 4 contendo 1X PBS, usando um pincel.</li>
	<li>Aspirar a PBS de cada poço e incubar as fatias em pre-cooled etanol 100% a-20 ° C por 15 a 20 min. Este passo facilita a penetração de anticorpo em fibras mielinizadas.</li>
	<li>Aspirar o etanol 100% e lave uma vez brevemente com 1 x PBS, em seguida, duas vezes em PBS 1x durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar a PBS e incubar as fatias por 30 a 45 min com uma solução contendo 1X PBS, 5% NGS, 0,3% de detergente não-iônico em temperatura ambiente para bloquear sites de fixação do anticorpo específico.</li>
	<li>Aspire a solução do bloqueio. A lavagem não é necessária.</li>
	<li>Incubar as fatias durante a noite com os anticorpos primários diluídos no bloqueio de solução a 4 ° C. Para visualizar a mielina em fatias organotypic cerebelar, use MBP (frango, 1/150 ou Mouse IGg2b, Smi99, 1/200) ou PLP (rato, hibridoma, 1/5 a 1/10) anticorpos. Nota: Para revelar a expressão de mais de um antígeno na mesma fatia, executar um duplo ou triplo que mancham o procedimento (veja a Figura 1 como um exemplo). Para realizar a incubação simultaneamente, certifique-se de anticorpos primários são produzidos em diferentes espécies. Em seguida, use seus anticorpos correspondentes secundários acoplados ao diferente fluorophores (ver Tabela de materiais para nodal e paranodal marcador18 anticorpos).</li>
	<li>No segundo dia, lave as fatias três vezes em PBS 1x por 10 min.</li>
	<li>Incube durante 3h com os anticorpos secundários diluídos em solução (diluição de 1/500) no escuro à temperatura de bloqueio. Nota: Otimização do tempo de diluição e incubação do anticorpo pode ser necessária ao usar outros anticorpos do que os descritos aqui.</li>
	<li>Lave as fatias três vezes em PBS 1x por 10 min no escuro.</li>
	<li>Sob um microscópio binocular, monte as fatias numa lâmina de vidro. Coloque 100 µ l de PBS 1x no slide e transfira as fatias para a PBS, usando um pincel. Desdobrar as fatias se necessário e achate-os no slide. Remova qualquer excesso de PBS. No caso do immunolabeling é realizada com as fatias ainda ligadas às membranas, monte com as fatias enfrentando a lamela, com a membrana sobre a lâmina de vidro.</li>
	<li>Coloque uma gota de meio de montagem diretamente no sentido do lamela de vidro e cubra delicadamente as fatias. Slides montados podem ser armazenadas por vários meses a 4 ° C, no escuro.</li>
</ol>

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<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Aqui, detalhamos um protocolo para gerar um ex vivo modelo correspondente para as culturas de fatia de rato organotypic cerebelar, adaptado de anteriormente métodos publicados15,16,19 e a mielina subsequente immunostaining dessas preparações. Esta estratégia oferece a possibilidade de visualizar os componentes da mielina com uma alta resolução em Estados saudáveis e patológicos.
Organotypic cerebelar ...

Os neurônios são células altamente polarizadas, que compõem um compartimento somato-dendríticas que recebe entradas do seu ambiente e um axônio que garante a geração e a propagação de impulsos elétricos para outras células. Propagação rápida e entrega oportuna de informações é essencial para o bom funcionamento do sistema nervoso. Nos vertebrados, isto é facilitado pela mielinização, que permite aumentar a velocidade de condução axonal1. Mielina é uma estrutura especializada, formada por camadas compactadas de membrana de plasma gerada pela microambiental glia, nomeadamente oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Tanto no SNC e o SNP, interações axoglial conduzir a formação de domínios axonal especializados: os nós de Ranvier e sua envolvente domínios, paranodes e juxtaparanodes2. Os segmentos axonal isolados por mielina, ou entrenós, alternadas com os nós de Ranvier, que correspondem a pequenos domínios amielínicas enriquecidos em canais de sódio voltagem-dependentes (atv). A alta concentração e ativação rápida de canais dev at aos nós de Ranvier permitir a regeneração dos potenciais de ação e em conjunto com as propriedades de isolamento das bainhas de mielina, assegurar a condução eficiente e rápido insulada do impulso nervoso ao longo do axônio3.
Além de seu papel em acelerar a velocidade de condução do impulso nervoso, microambiental glia fornece suporte metabólico para o axônio, preservando sua integridade a longo prazo e participando de sua sobrevivência4,5. Além disso, é evidente em anos recentes que a mielina é modulada dinamicamente ao longo da vida, assim, presumivelmente participando de regulamento e plasticidade das várias funções do sistema nervoso. Ajustes da distribuição, número, comprimento e espessura das bainhas de mielina ao longo do axónio, portanto, podem representar uma nova maneira para ajustar finamente várias redes6,7,8. Portanto, a aquisição evolutiva de mielina é um processo chave para funções sensoriais, motoras e cognitivas e a perturbação da interação entre axônios e glia é cada vez mais considerada como contribuindo para o desenvolvimento ou adquirida neurológica doenças9.
Composição de mielina tem sido caracterizada, com a característica específica de uma elevada percentagem de lípidos (70%) em comparação com as proteínas (30%) em contraste com outras membranas celulares10. No entanto, ao contrário de lipídios de mielina, a maioria das proteínas da mielina é específica para mielina, incluindo a proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), 2', glicoproteína de 3'-fosfodiesterase (CNP), associada a mielina de nucleotídeos 3'-cíclico (MAG), glicoproteína mielina-oligodendrocyte (MOG), PMP-22 e P010. Histológicos existem vários métodos para manchar a mielina com base na sua composição de lipídios, tais como Luxol rápido azul11, Sudão negro B12, Baker hematina ácida método13, bem como prata coloração de14. No entanto, essas abordagens não sempre permite um contraste adequado e resolução para visualizar as fibras individuais. Uma abordagem alternativa para detectar mielina é através de imuno-histoquímica dirigido contra as proteínas da mielina. Vários anticorpos antígenos específicos de mielina de destino com uma alta especificidade e podem ser usados rotineiramente para detectar estruturas mielinizadas. A interação antígeno-anticorpo pode ser revelada ainda mais usar um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo dirigido contra o anticorpo primário e visualizado com microscopia de fluorescência adequada. Aqui, descrevemos um protocolo imunoquímico para manchar a mielina em ex vivo cerebelar fatias, um modelo que permite uma boa preservação da arquitetura do tecido nervoso. Além disso, a organização e o tamanho das células de Purkinje (o único neurônio mielinizada do cerebelo) torná-los um modelo clássico para Estudos eletrofisiológicos e eles são da mesma forma ideais para realizar estudos fixos ou imagens ao vivo.
As fatias Cerebelares são geradas a partir de ratos P9-P10, um tempo correspondente do início da célula de Purkinje mielinização, um processo que é principalmente alcançado por uma semana ex vivo (6-7 dias in-vitro, DIV)15. Além disso, este modelo é adaptado para investigar distúrbios desmielinizantes como esclerose múltipla (MS), como uma desmielinização extensa pode ser induzida em fatias Cerebelares usando o myelinotoxic composto lysophosphatidylcholine (ou lysolecithin, LPC), Qual é seguida por um espontâneo como16,17. Como endógeno ocorre dois dias após a remoção de LPC, meio de cultura e é quase completo de um tratamento de post da semana.
A conclusão do presente protocolo leva cerca de 3 semanas, incluindo a metade de um dia para a preparação de culturas cerebelar fatia, uma semana para obter fatias totalmente mielinizadas, seguidas por 2 dias para atingir o pico de desmielinização e mais uma semana para seu pleno mielinogênese. Além disso, a imuno-histoquímica pode ser concluído em 2 dias. O protocolo descrito aqui é adaptado um padrão ninhada de 6 filhotes de ratos e precisa ser adaptado em relação ao número de animais utilizados para o experimento planejado.

<table><tbody><tr><td>Meio BME</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução Salina Balanceada (10x HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo Inativado por Calor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; Estreptomicina (10.000 UI/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s Solução salina balanceada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de D-glicose (45%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lisofosfatidilcolina (LPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)Ciências de</td> <td>Microscopia Eletrônica</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto (100% etanol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.330</td><td>Resfriado a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Tritão&reg; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10% Soro de Cabra Normal (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td> Solução Tampão <td>de Fosfato de 500622</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-GFP (Policlonal, Frango)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>Diluição 1/300</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Mielina Proteína Básica (MBP) (Policlonal, Frango)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>Diluição 1/150</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Proteína Básica de Mielina (MBP) (Monoclonal, IgG2b de Camundongo)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>Diluição 1/200</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-PLP (Rato, Hibridoma)</td><td>Presente do Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japão</td><td></td><td>Diluição 1/5 a 1/10</td></tr><tr><td>Canal Anti-Sódio, Anticorpo Pan (Monoclonal, IgG1 de camundongo, clone K58/35)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8809</td><td>Diluição 1/150</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Caspr (Policlonal, Coelho)</td><td>Abcam</td><td>ab34151</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Cabra Anticorpos Secundários conjugados a Alexa Fluor 488, 594, 647 ou 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tecidos</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de</td><td></td><td></td><td></td>barbear</tr><tr><td>Tesoura grande</td><td>FST</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta fina</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina curva</td><td>F.S.T</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (60 mm e 100 mm)</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 4 e 6 poços</td><td>TPP</td> Pastilhas de cultura de células TPP <td></td><td></td></tr> (<tr><td>0,4 &micro; m, 30 mm de diâmetro)</td> <td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> de cultura de células <td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de ponta fina</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de furo largo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079G</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 ou 50 mL</td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéril</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>Escova</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>RS França</td><td></td><td>76 mm x 26 mm x 1,1 mm</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>RS França</td><td></td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences Limpadores de tecido</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> <td>binocular</td></tr></tbody></table>

preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental organotypic

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

No sistema nervoso, mielina é uma estrutura complexa membrana gerada pela microambiental glial cells, que ensheathes de axônios e facilita a condução elétrica rápido. Alteração da mielina foi mostrada para ocorrer em várias doenças neurológicas, onde é associado com déficits funcionais. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um ex vivo modelo consiste em fatias cerebelar organotypic do mouse, que podem ser mantidas em cultura por várias semanas e ainda mais ser rotulado para visualizar a mielina.

Exemplos de mielina representante immunostainings em organotypic cerebelar fatias obtidas P9 P10 C57black6 tipo selvagem (WT) (Figura 2A), bem como ratos transgénicos PLP-GFP (Figura 2B), juntamente com células de Purkinje coloração. Myelinate de substância branca Cerebelares fatias faixas região das fatias em direção a periferia da folia e mielinização das células de Purkinje é principalmente alcançada depois de 6 a 7 DIV. Na DI...

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Este método permite estudar o mecanismo básico da mielinação e remyelinação no nível celular e tissular. Esta técnica está na encruzilhada entre culturas primárias e abordagens in vivo. É um modelo rápido e acessível com a principal vantagem de preservar a arquitetura tecidual.Demonstrando o procedimento estarão Melina Thetiot, pesquisadora de pós-doutorado e Remi Ronzano, doutoranda do meu laboratório. Para começar, insira uma pequena tesoura suavemente no foie magnum e corte o crânio fazendo uma incisão lateral em direção ao lado, e depois corte tudo ao redor do crânio da cabeça. Para recuperar a parte dorsal do crânio, use um fórceps fino e reto para levantar cuidadosamente a parte dorsal do crânio.Em seguida, introduza cuidadosamente os fórceps entre o crânio ventral e o cérebro. Gentilmente solte o cérebro e corte os nervos ópticos e trigêmeos com uma tesoura pequena. Em seguida, vire a cabeça ou a parte dorsal do crânio de cabeça para baixo um pouco acima de um prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada para ajudar o cérebro a cair pela gravidade.Usando fórceps finos, oriente o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e o lado ventral deitado. Sob o microscópio binóculo, use as fórceps retas para imobilizar o cérebro no lado do cérebro. Então, separe o cérebro traseiro do resto do cérebro.Corte os peduncles cerebelares sob o cerebelo para separar o cerebelo do resto do cérebro traseiro. Uma vez que o cerebelo esteja isolado, use fórceps finos e retos para arrancar cuidadosamente as meninges. Segure o cerebelo suavemente com as fórceps finas e curvas e coloque-o com o lado dorsal sobre a plataforma de plástico, perpendicularmente à lâmina de barbear do helicóptero.Em seguida, com uma ponta de pipeta estéril e fina presa a uma pipeta de um mililitro, aspire qualquer acesso de meio de dissecção ao redor do cerebelo. Em seguida, com um helicóptero de tecido, corte 300 micrômetros de seções sagita grossas do cerebelo. Em seguida, adicione uma gota de meio de dissecção no cerebelo fatiado suavemente.Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, aspira lentamente o cerebelo fatiado e transfira-o de volta para o prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada. Em seguida, use dois fórceps finos e retos para separar fatias individuais. Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, transfira até quatro fatias selecionadas dos vermis, juntamente com algum meio de dissecção em uma inserção de cultura de uma placa de seis poços.Remova qualquer acesso do meio de dissecção ao redor das fatias usando uma ponta de pipeta fina. Para desmielinização, remova todo o meio de cultura abaixo das pastilhas de cultura após seis dias in vitro, e substitua-o por um mililitro por poço do meio de cultura pré-aquecido e fresco contendo 0,5 miligramas por mililitro LPC. Incubar por 15 a 17 horas a 37 graus Celsius em ambiente de 5% de dióxido de carbono.Após a incubação, lave as pastilhas colocando-as em uma placa de Petri de 25 mililitros contendo um mililitro de meio de cultura pré-aquecido. Em seguida, transfira imediatamente as pastilhas de cultura em uma nova placa de seis poços, contendo meio de cultura fresco e pré-aquecido. Para começar a imunohistoquímica, primeiro use fórceps para levantar pastilhas culturais e remover o meio de cultura abaixo deles.Em seguida, adicione dois mililitros de 4%PFA em 1x PBS, ph 7.4, nas pastilhas de membrana para fixar as fatias cerebelares. Após 30 minutos, lave as fatias três vezes com dois mililitros de 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, sob o microscópio binóculo, usando uma ampliação de 25x a 30x, use um bisturi ou um pincel para separar suavemente as fatias das pastilhas de membrana.Em seguida, use um pincel para transferir as fatias flutuantes para os poços de uma placa de quatro poços, contendo 1x PBS para limitar o consumo de anticorpos. Em seguida, aspire o PBS de cada poço e incuba as fatias em 100% de etanol pré-resfriado a menos 20 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Após a incubação, aspire o etanol 100% e lave as fatias brevemente com 1x PBS.Em seguida, lave-os duas vezes à temperatura ambiente com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Para bloquear locais de fixação de anticorpos não específicos, aspire o PBS e incuba as fatias em uma solução contendo 1x PBS, 5%NGS e detergente não iônico de 0,3% à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Em seguida, adicione anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio e incubar as fatias a quatro graus Celsius durante a noite.Após a incubação durante a noite, lave as fatias três vezes com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, adicione os anticorpos secundários, diluídos na solução de bloqueio, em uma proporção de diluição de 500 e incubar as fatias à temperatura ambiente no escuro por três horas. Após a incubação com o anticorpo secundário, lave as fatias três vezes em 1x PBS no escuro por 10 minutos cada lavagem.Em seguida, sob um microscópio binóculo, coloque 100 microletadores de 1x PBS no slide e com um pincel, transfira as fatias para o PBS e achate-as no slide. Remova qualquer acesso do PBS. Por fim, coloque uma gota de meio de montagem diretamente sobre o deslizamento da tampa de vidro e cubra delicadamente as fatias.Imunostainings de mielina em fatias organotípicas cerebelares, obtidas nos dias de pós-natal 9 a 10 C57 preto seis camundongos do tipo selvagem foram observados em 11 dias in vitro com nós de ronviae enriquecidos em canais de sódio fechados de tensão, ladeados pelo domínio de junção axoglial paranodal. Os mesmos resultados foram observados para camundongos transgênicos PLP-GFP. A mielinação das células parkengy é alcançada principalmente após uma semana na cultura.O tratamento LPC desmyelinas totalmente as fatias, que remyelinate espontaneamente e são totalmente mielinados seis dias após a demyelinação. Este procedimento deve levar 25 minutos no máximo. É realmente o ponto mais crítico.A cultura de fatias organotípicas são adequadas para o estudo de imagem ao vivo da dinâmica da mielinação. Também pode ser usado para direcionar experimentos de triagem de drogas. Esta técnica permite uma abordagem fácil e quantitativa para estudar os processos de mielinação e remyelinação.Os experimentadores devem seguir os procedimentos básicos de segurança aplicados ao bem-estar animal, mielinização excessiva e afiada.

preparation-immunostaining-myelinating-organotypic-cerebellar-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este método descreve a geração de organotípicas culturas cerebelar eo efeito de determinados estímulos apoptóticos sobre a viabilidade de diferentes tipos de células do cerebelo.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

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A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Este vídeo descreve um método para gerar fatias de tecido a partir do cerebelo do camundongo. As fatias cerebelares podem ser usadas para cultura organotípica que fornece informações sobre os mecanismos de neurodesenvolvimento, incluindo a dinâmica da mielinização.

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Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

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A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

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Aprenda a preparar culturas de fatia organotípica do cerebelo de camundongo para estudo da mielinação e remielinação. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite análise por imunohistoquímica.

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