Name: Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda a induzir hepatite autoimune em camundongos BALB/c para estudar mecanismos patogênicos e diferenças sexuais. Este modelo reprodutível permite análises in vivo e in vitro da doença hepática.

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Dr. Njoku gostaria de reconhecer o Dr. Noel R. Rose, PhD, por sua orientação e discussões perspicazes que resultaram na formulação deste modelo.

Todos os procedimentos foram aprovados pela comissão de cuidados e uso de animais.
1. Trifluoroacetilação de proteínas citosocidas hepáticas S-100 ou um epítope CYP2E1
NOTA: Primeiro, prepare o trifluoroacetilado S100 (TFA-S100) e o epítope CYP2E1 trifluoroatilado (TFA-JHDN5). Como as proteínas S100 síndicas são necessárias para imunizações, e os camundongos BALB/c são necessários para produzir o imunogênio. A preparação produz uma grande quantidade de imunogênio; então, antecipar a realização desta porção cerca de quatro vezes por ano. Um método idêntico será usado para fazer o TFA-JHDN5. O epítope CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, pode ser sequenciado ou adquirido.
<ol><li>Isolamento da fração S100 do fígado.
	<ol>
<li>Após a sedação de 5 – 10 camundongos BALB/c com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4 - 6 mg/kg de xilazina, confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de retirada), além da perda de reflexos de retardo e da perda de reflexos palpebrais.</li>
		<li>Usando uma tesoura microcirúrgica, exponha o conteúdo intra-abdominal usando uma incisão midline e faça um pequeno corte na veia cava inferior para remover o sangue.</li>
		<li>Coloque um angiocateter de 24 bitolas na veia portal e perfunde o fígado 10 mL/min com 40 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7.4 em um banho de água a 4 °C. Remova e pese os fígados agrupados e corte-os em pequenos pedaços (10 – 15 mm). NOTA: A eutanásia é induzida pela injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.</li>
		<li>Adicione 4 vezes o peso da sacarose (250 mM) -TRIS (10 mM)- Tampão de homogeneização EDTA (1 mM) (pH 7.4) complementado com comprimidos completos do inibidor de Protease (ver Tabela de Materiais) conforme recomendações dos fabricantes. Homogeneize-se em um tubo de polipropileno de 15 mL, utilizando um homogeneizador geral de tecido laboratorial em velocidade média no gelo até ficar homogêneo. Homogeneize-se no gelo para evitar que o tecido fique quente durante a homogeneização.</li>
		<li>Centrifugar o fígado homogeneiza a 1500 x g por 10 min e, em seguida, despeje o supernante. Centrifugar o supernante por 1 h a 100.000 x g. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C. O supernatante é o Csoúsico S-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Trifluoroacetilação de S100 e JHDN5 NOTA: A trifluoroacetilação dos grupos ε-amino de resíduos de liseina da S-100 será realizada de acordo com o procedimento de Satoh18. Todas as partes deste experimento, com exceção dos últimos dias de diálise, são realizadas no capô da fumaça.<ol>
<li>Determine a concentração proteica total do S-100 citosóico utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA)7. Diluir 20 mgs de rato BALB/c S100 ou JHDN5 a 10 mL com dH2O em um frasco de 70 mL Erlenmeyer. Ajuste o pH para 10 com 1N KOH.</li>
		<li>Adicione 4,7 mmole de S-ethyltrifluorothioacetato (S-ETFA), à solução. Mantenha o pH entre 9,9 e 10,0 com KOH 1N administrando KOH na moda gotícula por aproximadamente 1 h. Registo o volume total de KOH para cada reação.</li>
		<li>Transfira as soluções para fitas diálise separadas (Não enchimento demais). Dique as fitas por 72 h contra 4 L de dH2O com três mudanças por dia. Após a diálise, grave o volume final de TFA-S100 ou TFA-JHDN5 e, em seguida, aliquot em tubos rotulados. Encaixe o congelamento e armazene a -80 °C.</li>
		<li>Uma concentração estimada é determinada dividindo a quantidade inicial de S100 ou JHDN5 (em mg) pelo volume final após a diálise (mL). Para determinar a modificação percentual da proteína nativa19, diluir 1,0 mg de cada proteína nativa e alterada tfa (se a concentração final for superior a 1,0 mg) a 1,0 mL com dH2O em tubos de bala separados e preparar um branco usando 1,0 mL dH2O. Se a concentração da proteína alterada pelo TFA for inferior a 1,0 mg, não dilua<ol>
<li>Para separar os poços de uma placa de 96 poços, adicione 50 μL das proteínas em branco, nativas e alteradas. Adicione 50 μL de 4% NaHCO3 seguido por 50 μL de 0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno ácido sulfônico a cada poço.</li>
			<li>Incubar a placa a 40 °C por 2 h. Após a incubação, adicione 50 μL de 10 % SDS a cada poço seguido por 25 μL de 1N HCl.</li>
			<li>Leia em OD de 334 nm e, em seguida, registo absorvente de cada composto de 200 a 600 nm, a fim de confirmar a queda característica na absorvância a 334 nm. Calcule a modificação percentual dos resíduos de lise por TFA, utilizando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imunização de camundongos para induzir hepatite
NOTA: O DIH é modelado em camundongos BALB/c por meio de imunizações com proteínas citosóicas hepáticas que foram alteradas covalentemente por cloreto de trifluoracetil (TFA), um modelo de metabólito de drogas, TFA-S1006 ou um epítope de CYP2E1 covalentamente alterado por TFA9, TFA-JHDN5 que induz hepatite, células T autorativas e autoanticorpos CYP2E1. Os camundongos exibem uma fase de ativação esplênica 2 semanas após a imunização inicial e uma fase hepática por 3 semanas que é caracterizada por inflamação granulócítica. Camundongos BALB/c fêmeas são mais suscetíveis do que os machos à hepatite neste modelo.
<ol><li>No dia 0, imunizar camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas subcutâneos na base do pescoço com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsificadas em volumes iguais de adjuvante completo de Freund (CFA). No dia 0, imunizar os camundongos com 50 ng de toxina de coqueluche, intramuscularmente em uma das patas traseiras. No dia 7, imunizar os camundongos subcutâneamente na base da cauda com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados em volumes iguais de CFA para garantir que cada rato receba duas injeções do mesmo imunogênio. NOTA: Os camundongos são monitorados de hora em hora durante as primeiras 6 horas após a imunização e, em seguida, pelo menos duas vezes por dia durante uma semana. Se os camundongos demonstrarem sinais de dor ou angústia, como postura curvada ou peles de babados, os analgésicos devem ser administrados de acordo com a ACUC local. Se for observado dor ou angústia significativas, os camundongos devem ser avaliados por um veterinário para determinar se a eutanásia é necessária.</li>
	<li>Determinação de respostas imunes de células T CD4+ a auto-proteínas inteiras, epítopos de auto-proteínas ou o hapten TFA usando citometria de fluxo
	<ol>
<li>Após a sedação de camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com xilazina de 4-6 mg/kg via injeção intraperitoneal, confirme a profundidade adequada da anestesia conforme descrito na etapa 1.1.1 e depois identifique o baço após expor a cavidade intra-abdominal usando tesoura microcirúrgica. Corte o baço no pedículo e coloque em uma placa de Petri com soro de bezerro fetal PBS/2% (FCS). NOTA: A eutanásia será induzida nos camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.</li>
		<li>Solte as células usando lâminas de vidro foscos e transfira para um tubo de polipropileno cônico de 50 mL. Lave com PBS/2% FCS, elevando o volume para 50 mL e centrifugando a 335 x g usando uma centrífuga refrigerada no banco. Despeje o supernatante e repita este passo.</li>
		<li>Remova as células vermelhas usando 1 mL de tampão de lysing ACK por 1 min e traga volume de até 50 mL com PBS/2% FCS. Centrifugar a 335 x g e despeje o supernatante.</li>
		<li>Conte as células. Rotule as células com CFSE por 30 minutos no gelo no escuro, de acordo com as instruções do fabricante. Suspender suspensões de célula única em 6 placas de poço de 3x106 células/mL por poço em PBS/2% FCS.</li>
		<li>Estimule as células rotuladas com CYP2E1, JHDN5 ou TFA-OVA (10 μg/mL) por 72 h a 37 °C em 5% DE CO2, 95% de ar (umidificado). Após a incubação, colorigue as células com CD4-APC (1:100) por 30 minutos no gelo e analise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.</li>
		<li>Utilize a seguinte estratégia de gating para identificar células CD4+CFSE+: as células CD4+CFSE+serão identificadas a partir das células vivas fechadas e exibidas como histogramas de células proliferando.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de células imunes infiltradas de camundongos imunizados. 
	<ol>
<li>Para isolar as células imunes infiltradas nos fígados no dia 14 ou dia 21, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina e confirmar a profundidade adequada da anestesia como descrito na etapa 1.1.1. Após laparotomia usando uma incisão midline feita com uma tesoura micro cirúrgica, como descrito em 1.1.2, cannulate a veia portal com uma agulha de calibre 25 e, em seguida, corte a cava vena inferior abaixo das veias renais.</li>
		<li>Perfunda cada fígado a uma taxa de fluxo de 10 mL/min com 40 mL de PBS em um banho de água 37 °C. Após a perfusão, usando uma tesoura micro cirúrgica, corte o fígado no pediculo hepático, remova a vesícula biliar e corte o fígado no hilum.</li>
		<li>Interrompa o fígado em uma peneira de aço inoxidável de malha usando um pilão de seringa estéril de 20 mL e PBS frio. Filtre a suspensão celular resultante em tubos de centrífuga pré-esterilizados de 50 mL usando uma tela de malha de 300. Leve cada suspensão a 50 mL usando PBS frio e depois lave a suspensão por centrifugação por 10 min a 370 x g.</li>
		<li>Descarte o supernasce e, em seguida, acumule cada pelota por tratamento em novos tubos de 50 mL (recomenda-se um tubo por rato; no entanto, se as amostras forem agrupadas, 2-4 pelotas/tubo são recomendadas). Suspenda as pelotas agrupadas em 45 mL Percoll 35% (em PBS) e 100 UI/mL heparina.</li>
		<li>Gire cada tubo a 500 x g por 10 min a 20 °C. Descarte o supernascimento e suspenda a pelota em 5 mL de PBS e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise ACK a cada pelota por 10 minutos no gelo.</li>
		<li>Leve cada tubo a 50 mL com PBS e lave por centrifugação por 10 min a 370 x g. Descarte o supernasce e depois lave as células com PBS/2% FCS por centrifugação por 10 min a 370 x g. Conte as células.</li>
		<li>
Análise do tipo celular usando citometria de fluxo NOTA: Aqui está um exemplo de como foxp3+tregs induzidos podem ser detectados.<ol>
<li>Incubar células 1x106 com reagente de bloqueio fcr e mancha com diluições de 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP por 30 minutos no gelo. Em seguida, colora as células intracelularmente com FoxP3-APC.</li>
			<li>Fixar as células com 250 μL de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) e armazenar a 4 °C até a análise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.</li>
			<li>Recomenda-se a seguinte estratégia de gating para detectar Foxp3+Tregs induzidos em suspensões de células únicas de fígado, baço ou linfonodos usando citometria de fluxo: Identifique células vivas usando o kit de manchas Aqua Dead Cell Live/Dead Fixable. Em seguida, portão em células hepáticas que são CD45+ (PerCP, clone RA3-6B2) e células gate CD4+ (FITC, cloneGK1.5) do portão CD45+. Das células CD4+, identifique as porcentagens das células CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise histológica dos tecidos hepáticos para hepatite
	<ol>
<li>No dia 21, fixar as seções hepáticas (5 μm de espessura) em formalina tamponada 10% neutra e mancha com Hemaoxilina &amp;Eosin.</li>
		<li>Determine as pontuações de histologia primeiro em baixa potência (40X) em uma média de 2 visualizações e confirme em 64X. Escore as seções teciduais da seguinte forma: Grau 0=sem inflamação ou necrose; Grau 1= inflamação lobular menor sem necrose; Grau 2= inflamação lobular envolvendo &lt;50% da seção; Inflamação grau 3=lobular envolvendo ≥ 50% da seção; e grau 4=inflamação com necrose.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação dos níveis de citocina tecidual em baços e fígados. 
	<ol>
<li>No dia 14 ou dia 21, homogeneize as amostras de fígado ou baço (1 g) de cada rato em 1 mL de RPMI/2% FCS até suavizar usando um homogeneizador de laboratório geral em configuração média. Mantenha a amostra fria no gelo.</li>
		<li>Centrifugar o homogeneizado por 15 min a 1455 x g a 4 °C usando uma centrífuga de desktop refrigerada. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C até ficar pronto para uso. Os níveis de citocina e quimiocina podem ser medidos com kits comerciais elisa, conforme instruções do kit. Padronize os níveis de citocinas convertendo os níveis (em mL ou μL) em pg/g de tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de anticorpos de soro para CYP2E1, o epítope CYP2E1 JHDN5 e o metabólito da droga TFA.
	<ol>
<li>Nos dias 14 ou 21, sedeia os camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de abstinência), além da perda de reflexos de direito e perda de reflexos palpebrais. Utilize uma agulha de 25 G presa a uma seringa tuberculina e aproxime-se do coração avançando lentamente a agulha para a cavidade torácica sob as costelas e imediatamente lateral ao processo xifoide. Coletar sangue usando punção intracardiac.</li>
		<li>Uma vez coletado o sangue, deixe-o coagular à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras de sangue a 295 x g por 20 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a sera, aliquot a sera e escor ao congelamento de encaixe a -20 °C.</li>
		<li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></ol>

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<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A força deste protocolo repousa em sua reprodutibilidade; por isso, é fundamental aderir às etapas sugeridas. A formulação do imunogênio pode ser uma barreira para alguns; no entanto, reproduzimos nosso modelo usando o epítope descrito em nosso documento, que remove a necessidade de isolar a fração S100 do fígado. É provável que epítopos adicionais ou proteínas possam ser alterados e induzir hepatite após as imunizações; no entanto, descrevemos essas proteínas que usamos com resultados confiáveis. Várias proteínas foram ...

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos. DIH é o processo de hipersensibilidade hepática mais comum, observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatiteautoimune 1. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres 2,3,4. Um tipo de DIH desenvolve-se em indivíduos suscetíveis após a administração de anestésicos voláteis halogenados, como isoflurano, sevoflurano, desflurano ou halotano. Esses anestésicos se ligam covalentemente a proteínas hepáticas com produtos reativos de seu metabolismo, criando assim novos autoantigens capazes de provocar respostas alérgicas ou autoimunes5.
O estudo de mecanismos patogênicos envolvidos no desenvolvimento de anestésicos e qualquer forma de DIH tem sido previamente dificultado pela falta de um modelo animal que imita de perto a indução da doença humana. Desenvolvemos um modelo experimental de murina de DIH com características semelhantes à DILI mediada imunológica em pacientes. A hepatite é induzida pela imunização com um dos dois autoantígenos que foram covalentemente modificados pelo metabólito de cloreto de trifluoroacetil (TFA) que é formado seguindo o metabolismo oxidativo do anestésico pelo citocromo enzimático P450 2E1 (CYP2E1)5. Um autoantígeno é a fração hepática cística cística hepótica S100, que é uma mistura de várias proteínas6, e o segundo autoantígeno é um epítope de CYP2E1 que é reconhecido por soro de pacientes com DILI7 anestésico imuno mediado. Ao usar camundongos BALB/c, que são relativamente resistentes à hepatite autoimune experimental, distinguemos nosso modelo do modelo de imunização induzido pelo S100 de hepatite autoimune em camundongos C57Bl/6J8.
Devido às suas diversas apresentações clínicas, o DIH é difícil de estudar em pacientes. Modelos experimentais translacionais oferecem a capacidade de avaliar a patogênese da doença in vivo e in vitro. Atualmente, não existem outros métodos alternativos para induzir DIH que examinem totalmente as respostas imunes in vivo ou in vitro adaptativas ou inatas sem o uso de animais. Além disso, como a trifluoroacetilação do S-100 ou do epítope CYP2E1 não parece produzir um imunogênio irritante, e estamos induzindo o DIH pela imunização com proteínas alteradas pelo TFA, esses animais não receberão éter, qualquer anestésico halogenado, barbiturado ou álcool antes da imunização ou outros procedimentos, considerando que esses agentes podem alterar os parâmetros que estamos estudando. Mesmo assim, diminuímos o uso do nosso mouse utilizando simulação de computador para confirmar as preferências vinculantes do nosso epítope CYP2E1descoberto 9 e espelhamos o DIH humano implicando sexo feminino, demonstrando que ratos BALB/c fêmeas desenvolvem um DIH10 mais severo.
Apesar das diversas apresentações de DIH em pacientes e desafios no estudo da doença clínica, a modificação pós-translacional de proteínas nativas por metabólitos reativas é um mecanismo-chave aceito na patogênese DIH que segue anestésicos halogenados11. Os investigadores também aceitam que o CYP2E1 é um grande autoantígeno neste processo12,13. O papel das células CD4+T regulamentadas (IL)-4-upregulated que reconhecem um CYP2E1 pós-translacionada e outras proteínas hepáticas é um iniciador aceito de DIH anestésico, atraindo neutrófilos, eosinófilos e células de mastro para o fígado14, e este mecanismo foi confirmado em muitas formas de DIH15,16. As células CD4+CD25+T (Tregs) induzidas a expressar o FoxP3 reduzem a gravidade do DIH, e deficiências relativas dessas células no baço pioram o DIH 10,7. Assim, a maioria dos avanços na compreensão do DIH têm sido possíveis utilizando modelos de camundongos in vivo para avaliar os mecanismos genéticos, metabólicos e imunológicos do DIH tanto in vivo quanto in vitro.
Como nós e outros investigadores descobrimos papéis para IL-4, neutrófilos e eosinófilos no início do DIH usando diferentes modelos de camundongos, acreditamos que esta observação suporta nossa alegação de que, independentemente do modelo DIH utilizado, hepatite e lesão são induzidas pelo IL-4. A força do nosso protocolo está na utilização da metodologia in vivo, tanto de camundongos masculinos quanto femininos, e na repetição da histologia, ensaios de proliferação de células T CD4+ e citocinas. A força do nosso uso de estudos in vitro é que eles reduzem o número de camundongos necessários, fornecendo a metodologia para isolar as interações celulares que impulsionam o DIH. Recomendamos o uso de camundongos masculinos e femininos, pois isso reduz a possibilidade de viés inconsciente na interpretação dos resultados e fortalece o potencial de tradução de nossos estudos, uma vez que a incidência, prevalência e gravidade do DIH é maior em mulheresde 17 anos. Recomendamos que os camundongos sejam obtidos de um único fornecedor; no entanto, se isso não for possível, obtenha controles de erva-mate ou camundongos do mesmo tipo de fornecedor que os camundongos geneticamente alterados.

<table><tbody><tr><td>0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico ácido (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Kit de Substrato</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos BALB/c</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Kit de Proliferação Celular CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloqueador FcR</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento geral</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; células criopreservadas</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Vivo/Morto Fixável Kit de manchas Aqua Dead Cell&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lista de Toxinas Convulsas</td><td>Biologicals</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Tamponamento de Fosfato Salino pH 7.4</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Mini Comprimidos de Inibidor de Protease, Livre de EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)</td>de diálise <td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; Solução SDS, 10%</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, sem vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

indução de hepatite autoimune induzida por drogas em camundongos balb/c para o estudo de seus mecanismos patogênicos

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

A hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é o processo de hipersensibilidade induzida por medicamentos hepáticos mais comum observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres. Os mecanismos subjacentes dessas diferenças sexuais na prevalência não são claros devido à escassez de modelos animais que imitam doenças humanas. Mesmo assim, acredita-se que os mecanismos subjacentes estejam amplamente associados a haplotipos de antígenos leucócitos humanos e hormônios sexuais. Em contraste, usando um modelo de rato DIH, descobrimos que as células CD4+ T iniciadas il-4 contra um epítope de citocromo P450 2E1 induz o fluxo de neutrófilos, macrófagos e células de mastro nos fígados de camundongos BALB/c fêmeas. Usando este modelo, também mostramos que as células T induzidas pelo IL-33+regulamente conferem proteção contra DIH em camundongos femininos e masculinos. Este modelo DIH é induzido pela imunização de camundongos com um epítope de CYP2E1 que foi alterado covalentemente com um metabólito de droga que tem sido associado com DIH. Este epítope é reconhecido por pacientes com DIH. Nosso método induz hepatites robustas e reprodutíveis e autoanticorpos que podem ser utilizados para estudar a patogênese do DIH. Enquanto estudos in vivo podem causar dor e angústia indevidas em camundongos quando feitos de forma inadequada, a vantagem de um modelo in vivo é a capacidade de avaliar a patogênese da doença em um grande número de camundongos. Além disso, os efeitos biológicos das proteínas hepáticas alteradas podem ser estudados por meio de procedimentos invasivos. A adição de estudos in vitro ao projeto experimental permite repetição rápida e análise mecanicista a nível celular. Assim, demonstraremos nosso protocolo de modelo e como ele pode ser utilizado para estudar mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

O calendário de vacinação utilizado para induzir o DIH apresentado na Figura 1 representa as duas imunizações necessárias na base do pescoço (dia 0) e a base da cauda (dia 7). A Figura 2 mostra dados representativos de proliferação obtidos no dia 14 utilizando CFSE em resposta ao CYP2E1, JHDN5, o epítope CYP2E1 e o metabólito trifluoroacetil (TFA) dos anestésicos. A Figura 3 mostra a estratégia de gating e a análise representativa d...

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

A doença hepática e a cirrose são a sexta causa mais comum de morte em adultos entre 25 e 64 anos. A EDIL idiossincrática, às vezes chamada de hepatite induzida por medicamentos, autoimune ou imunomediada, é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos e é o processo de hipossensibilização induzida por medicamentos hepáticos mais comum. Esse processo ocorre em cerca de 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune, e essa forma de hepatite é a razão mais comum pela qual um medicamento é removido do mercado comercial.A esmagadora maioria dos pacientes com hepatite induzida por drogas são mulheres. Este protocolo descreve características críticas observadas em pacientes, como hepatite, autoanticorpos e diferenças de sexo. A principal vantagem dessa técnica é sua reprodutibilidade em um modelo de camundongo in vivo, o que dá aos cientistas a chance de observar o desenvolvimento da doença e suas sequelas.Usando este protocolo, descobrimos um epítopo comum na hepatite anestésica e viral que é um epítopo dominante em pacientes com hepatite anestésica e está significativamente associado à fibrose em pacientes com hepatite viral. Acreditamos que essas informações podem ser usadas para desenvolver testes diagnósticos específicos para hepatite induzida por drogas ou virais ou fibrose associada que, esperamos, possam prever indivíduos em risco de desenvolver esta doença ou suas sequelas. As técnicas escritas podem ser esmagadoras porque sempre usamos vários freios e contrapesos para garantir a reprodutibilidade de nossos resultados.Na primeira vez que você fizer o experimento, dê a si mesmo tempo suficiente. Depois da primeira vez, passa muito rápido. Após a eutanásia do camundongo BALB/c, use uma incisão na linha média para expor o conteúdo intra-abdominal com uma tesoura microcirúrgica e faça um pequeno corte na veia cava inferior para remover o sangue.Em seguida, coloque um angiocateter de calibre 24 na veia porta. Mantenha o PBS em banho-maria a quatro graus Celsius e use uma bomba peristáltica para profundir o fígado com 40 mililitros de PBS a uma taxa de 10 mililitros por minuto. Com uma microtesoura, solte cuidadosamente o fígado do abdômen e pese o fígado em um barco de pesagem.Corte o fígado em pequenos pedaços de 10 a 15 milímetros. Adicione as amostras de fígado, bem como o tampão de homogeneização, quatro vezes o peso de um fígado de camundongo, a um tubo de polipropileno de 15 mililitros e complemente com comprimidos completos de coquetel inibidor de protease, de acordo com o manuscrito. Use um homogeneizador geral de tecidos de laboratório em velocidade média para homogeneizar as amostras no gelo até ficar homogêneo.Centrifugue os homogeneizados hepáticos a 1.500 vezes G por 10 minutos e, em seguida, despeje o S100 citosólico sobrenadante Após centrifugação novamente a 100.000 vezes G, congele o sobrenadante citosólico S100 em gelo seco e congele o tubo a 80 graus Celsius negativos. Para iniciar a trifluoroacetilação, descongele o S100 à temperatura ambiente. Em seguida, em um frasco Erlenmeyer, dilua 20 miligramas de S100 de camundongo para 10 mililitros com água deionizada.Com o medidor de pH, ajuste o pH para 10 com hidróxido de potássio 1-normal. Em uma capela de exaustão, adicione 4,7 milimoles de S-ETFA à solução. Mantenha o pH entre 9,9 e 10,0 administrando hidróxido de potássio 1-normal em forma de gotículas por aproximadamente uma hora.Registar o volume total de hidróxido de potássio para cada reacção. Transfira as soluções para de diálise separados. Coloque os em quatro litros de água deionizada para diálise por 72 horas com três trocas por dia.Após a diálise, registre o volume final de S100 trifluoroacetilado e, em seguida, alíquota em tubos marcados. Congele os tubos em gelo seco e armazene a 80 graus Celsius negativos. Com a concentração de proteína determinada de acordo com o manuscrito, se for maior que um miligrama por mililitro, adicione um miligrama de cada proteína nativa e alterada por TFA a um mililitro de água deionizada em tubos de bala separados.Prepare um espaço em branco no tubo de bala usando um mililitro de água deionizada. Em uma placa de 96 poços, adicione 50 microlitros das proteínas em branco, nativas e alteradas cada, em duplicata. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de bicarbonato de sódio a 4% seguidos de 50 microlitros de ácido sulfônico 0,1%2, 4, 6-trinitrobenzeno a cada poço.Incube a placa a 40 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, adicione 50 microlitros de 10% SDS a cada poço, seguido por 25 microlitros de ácido clorídrico 1-normal. Após a imunização e anestesia do camundongo, use uma tesoura microcirúrgica para expor a cavidade intra-abdominal.Identifique o baço. Corte o baço no pedículo e coloque-o em uma placa de Petri com PBS contendo 2% de soro fetal de bezerro. Para liberar as células, coloque o baço entre duas lâminas de vidro fosco e esfregue-as.Use uma pipeta eletrônica para transferir as células para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros. Para lavar, adicione PBS contendo 2%FCS ao tubo para atingir o volume de 50 mililitros e centrifugue a 335 vezes G usando uma centrífuga refrigerada de bancada. Despeje o sobrenadante e repita a etapa de lavagem.Adicione um mililitro de tampão de lise ACK no tubo para lavar por um minuto para remover os glóbulos vermelhos. Em seguida, repita a etapa de lavagem do PBS suplementado com FCS. Depois de marcar as células com CFSE por 30 minutos, adicione 10 microgramas por mililitro de citocromo-P450 2E1, JHDN5 ou ovalbumina trifluoroacetilada para estimular as células marcadas por 72 horas a 37 graus Celsius na incubadora.Após a incubação, corar as células com CD4 marcado com aloficocianina na proporção de 1:100 por 30 minutos no gelo. Após a laparotomia do camundongo imunizado, conforme descrito no manuscrito, canule a veia porta com uma agulha de calibre 25 e, em seguida, corte a veia cava inferior abaixo das veias renais. Em banho-maria a 37 graus Celsius, perfunda cada fígado com 40 mililitros de PBS a uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.Após a perfusão, usando uma tesoura microcirúrgica, corte o fígado no pedículo hepático, remova a vesícula biliar e, em seguida, corte o fígado no hilo. Em uma peneira de aço inoxidável de 300 malhas, use um pilão de seringa estéril de 20 mililitros e PBS frio para romper o fígado. Com a tela, filtre a suspensão celular resultante em tubos de centrífuga pré-esterilizados de 50 mililitros.Levar cada suspensão a 50 mililitros utilizando PBS frio e, em seguida, lavar a suspensão por centrifugação durante 10 minutos a 370 vezes G Eliminar o sobrenadante e, em seguida, combinar os pellets por tratamento em novos tubos de 50 mililitros. Suspenda os pellets combinados em 45 mililitros de 35% Percoll em PBS e 100 unidades internacionais por mililitro de heparina. Em seguida, gire cada tubo a 500 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius.Rejeitar o sobrenadante e suspender o sedimento em cinco mililitros de PBS e, em seguida, adicionar um mililitro de tampão de lise ACK a cada sedimento e conservar no gelo durante 10 minutos. Depois de lavar novamente com PBS por centrifugação a 370 vezes G, descarte o sobrenadante e, em seguida, lave as células com PBS suplementado com FCS por centrifugação por 10 minutos a 370 vezes G. Use um hemocitômetro eletrônico para contar as células. Neste experimento, as respostas imunes das células T CD4+ foram determinadas por citometria de fluxo.Dados representativos de proliferação foram obtidos no dia 14 usando CFSE em resposta ao metabólito trifluoroacetil, citocromo-P450 2E1, o epítopo do citocromo-P450 2E1, JHDN5. Poços sem antígeno foram usados como controles. Quando comparados ao controle, os camundongos BALB/c desenvolveram proliferação em resposta à ovalbumina trifluoroacetilada e ao citocromo-P450 2E1, mas não ao JHDN5.Três semanas após o TFA emulsionado na imunização adjuvante completa de Freund, camundongos BALB/c fêmeas desenvolveram mais hepatite autoimune induzida por drogas quando comparados aos camundongos BALB/c machos. A análise histológica dos tecidos hepáticos também mostra inflamação da hepatite mais grave em camundongos fêmeas do que em camundongos machos. O número de células hepáticas CD4+CD8+NK+ e NKT+ foi significativamente maior nas mulheres do que nos homens.embora não houvesse diferenças nas células B observadas entre esses camundongos Lembre-se de que, embora seja um longo dia, essa formulação durará muito tempo. Este procedimento também pode ser realizado para trifluoroacetilar o epítopo. Esse procedimento permitiu que os pesquisadores dissecassem o curso do tempo de desenvolvimento da doença hepática e aumentassem o potencial para novas descobertas de proteínas e vias.O S-etiltrifluorotioacetato é tóxico e deve ser manuseado em uma capela de exaustão. Além disso, boas práticas e técnicas de laboratório são fortemente recomendadas.

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Infecção de camundongos com um Adenovírus expressando o autoantígeno major humano do citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconhecidas pelos soros de pacientes que sofrem a partir de tipo 2 resultados da hepatite auto-imunes em uma forma persistente da auto-imune-mediada doença do fígado caracterizada por extenso hepatite fibrose, e de geração de um CYP2D6 -específica resposta imune.

O modelo animal CYP2D6: Como induzir hepatite auto-imune em ratos

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir inflamação colônica em camundongos por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB singênicas para receptores deficientes em células T e B. As características clínicas e histopatológicas mimetizam as doenças inflamatórias intestinais humanas. Este método permite o estudo do início da inflamação colônica e da progressão da doença.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.

Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Aprenda a induzir hepatite autoimune em camundongos BALB/c para estudar mecanismos patogênicos e diferenças sexuais. Este modelo reprodutível permite análises in vivo e in vitro da doença hepática.

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

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