Name: Isolamento de células regenerativas derivadas de adipose para o tratamento da disfunção erétil após a prostatectomia radical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a isolar células regenerativas derivadas de adipose para tratar disfunção erétil após prostatectomia radical. Este protocolo padronizado utiliza lipoaspiração, digestão enzimática e centrifugação para obter ADRCs viáveis.

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Este trabalho foi fundado pelo Hospital Universitário Odense (11/31936), Centro Dinamarquês de Medicina Regenerativa (14/50427) e pela Sociedade Dinamarquesa de Câncer.

Todos os métodos descritos no protocolo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Ética dinamarquês (nº 37054), pela Autoridade Dinamarquesa de Saúde e Medicamentos (EUDRA-CT número 2013-004220-11) e pela Agência Dinamarquesa de Proteção de Dados (2008-58-0035). O estudo foi registrado em ClinicalTrials.gov (NCT02240823). O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque monitorada pela unidade de Boas Práticas Clínicas (GCP) do Hospital Universitário Odense. A preparação da ADRC foi realizada em um estabelecimento de tecidos autorizado para o manuseio de tecidos e células humanas no Hospital Universitário Odense (Autoridade Dinamarquesa de Saúde e Medicamentos, Autorização nº 29035).
1. Recrutamento de pacientes/participantes
<ol><li>Para participar do teste, recrute pacientes que preencham os seguintes critérios de inclusão.<ol>
<li>Recrutar pacientes com mais de 18 anos, sexualmente ativos perante a RP e não infectados com as doenças sexualmente transmissíveis, por exemplo, infecção por vírus da imunodeficiência humana, sífilis ou hepatite.</li>
		<li>Certifique-se de que eles sofrem de disfunção erétil após um RP que foi realizado devido ao câncer de próstata. NOTA: Neste estudo, os pacientes foram inscritos no estudo 5-18 meses após o RP e foram incluídos independentemente do método cirúrgico: aberto/robótico assistido ou nervesparing/non-nervesparing.</li>
		<li>Certifique-se de que o valor do antígeno específico da próstata (PSA) deve ser indetectável no acompanhamento clínico após o RP.</li>
		<li>Certifique-se de que os pacientes eram sexualmente ativos antes do RP, e ainda expressando o desejo de permanecer sexualmente ativo após o RP. Certifique-se de que a intervenção farmacológica com um inibidor fosfodiesterase tipo 5 (inibidor PDE5 ) ou um análogo sintético de prostaglandina E1 (PGE1) tenha sido experimentada antes de participar e considerada insuficiente.</li>
		<li>Além disso, certifique-se de que os pacientes tenham gordura subcutânea suficiente no abdômen ou coxa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exclua os pacientes do ensaio, se houver eventos graves sob a anestesia durante o RP ou se foram tratados com anticoagulantes.</li>
</ol>2. Lipoaspiração
NOTA: A lipoaspiração é uma operação que remove gordura ou lipócitos da área subcutânea. Esta parte do protocolo é realizada como uma lipoaspiração padrão e o procedimento é realizado em condições estéreis em um centro cirúrgico. Todos os instrumentos utilizados no procedimento devem ser estéreis e o cirurgião deve usar esfregões, vestido cirúrgico estéril, luvas estéreis, máscara cirúrgica e chapéu.
<ol><li>Anestesiar o paciente.<ol>
<li>Certifique-se de que o paciente está sob anestesia geral durante o procedimento, e esta parte é realizada por um anestesista.</li>
		<li>Desinfetar a pele do abdômen e do escroto com clorexidina 0,5% (espírito clorhexidine, 96% de etanol medicado clorhexidine digluconate 77% W/W = 83% v/v). Use um marcador cirúrgico para elaborar as áreas do abdômen onde a lipoaspiração será realizada. A área geralmente será a área entre a sífilis e o umbigo.</li>
	</ol></li>
	<li>Faça duas incisões de 6 mm de largura na pele do abdômen com um bisturi (número 11). Coloque as incisões simetricamente e lateralmente da área retraída da lipoaspiração.<ol>
<li>Coloque um pouco de lubrificante como geleia de petróleo nas incisões, para ter certeza de que a canânula de infiltração desliza para dentro e para fora das incisões facilmente durante a lipoaspiração.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduza uma cânula de infiltração tamanho 14 G através das incisões na pele. Injete solução de Kleins modificada subcutânea nas áreas marcadas paralelamente à superfície da pele. Injete tanto da solução que o tecido alvo fique inchado e firme, ou tumescente. NOTA: A solução modificada kleins consiste em uma solução de 1.000 mL Ringers lactato e 1 mg de adrenalina (epinefrina (1:1.000.000)). Não advoe a anestesia local para a solução, pois pode ter um impacto negativo sobre os ADRCs.<ol>
<li>Injete um volume de solução modificada de Kleins que corresponde à razão 1:1 ao tecido adiposo.</li>
		<li>Aguarde 10 minutos para maximizar o efeito da adrenalina e reduzir a quantidade de sangue no tecido adiposo colhido.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize uma lipoaspiração padrão usando uma lipoaspiração de infusão de jato para colher 200-300 mL de tecido adiposo. Use cânulas cegas que são ocas, às quais um tubo de infusão e um bocal são integrados. Conecte a cânula a um dispositivo de sucção para lipoaspiração. NOTA: Uma infusão contínua de água em forma de ventilador solta o tecido adiposo em fragmentos que podem ser facilmente aspirados através da abertura na cânula.<ol>
<li>Introduza uma seringa de 3 mm com uma ponta cega através das incisões no abdômen</li>
	</ol></li>
	<li>Colete o tecido adiposo em um coletor de lipoaspirato para preservar a lipoaspirata em um ambiente estéril. A lipoaspirata começará a se separar da fase da água.</li>
	<li>Use seringas estéreis de 50 mL para sugar o lipoaspirato do coletor de lipo.<ol>
<li>Minimize o volume de água sugado nas seringas e enrosque em um plugue na ponta das seringas para manter o tecido adiposo estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque seringas com ponta para baixo em um saco plástico estéril para iniciar a separação da lipoaspirata da fase da água. Coloque o saco em recipiente estéril ainda com as pontas voltadas para baixo para continuar a separação.<ol>
<li>Cubra o recipiente com cortina estéril para proteger o ambiente estéril durante o transporte. NOTA: De acordo com o manual do usuário da máquina usada para o isolamento, a lipoaspirata pode ser armazenada por até um máximo de 4h antes do isolamento dos ADRCs, no entanto, sempre processá-lo imediatamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Feche as incisões da pele com o material de sutura preferido dos cirurgiões. Coloque uma peça de compressão, uma pasta abdominal, ao redor do abdômen para reduzir o edema pós-operatório.</li>
	<li>Faça um bloco peniano injetando 20 mL bupivacaína 5 mg/mL contendo 5 μg de adrenalina.<ol>
<li>Use uma seringa de 20 mL e aplique com uma agulha de 23 G, 11/4 polegadas de comprimento.</li>
		<li>Aplique 5 mL de bupivacaína em cada quadrante no subcutis.</li>
		<li>Injete a bupivacaína em dois locais, um colocado ventrally o outro dorsalmente. Introduza a agulha em todo o seu comprimento no tecido subcutâneo apontando a agulha lateralmente para a direita e injete a anestesia à medida que a agulha é retraída. Repita a injeção apontando a agulha para a esquerda. NOTA: O paciente agora pode ser despertado da anestesia geral pelo anestesista.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento de ADRCs
NOTA: O processo de isolamento dos ADRCs é realizado conforme descrito detalhadamente no manual do usuário seguindo o dispositivo (ver Tabela de Materiais). É importante que o procedimento seja realizado em condições estéreis para garantir que o lipoaspirato não seja exposto a nenhum contaminante durante a purificação dos ADRCs. O tempo necessário para o isolamento dos ADRCs depende do volume de lipoaspirato, mas todo o procedimento levará aproximadamente 2,5 h usando o dispositivo semiautomático como descrito aqui.
<ol><li>Coloque todos os consumíveis e enzimas asepticamente sobre uma mesa coberta por uma toalha cirúrgica descartável estéril. NOTA: Um kit de procedimento contém todos os materiais de consumo necessários e enzimas necessárias para o isolamento dos ADRCs de um paciente. Além disso, três sacos de infusão de um litro de 37-39 °C devem estar disponíveis, juntamente com roupas estéreis, luvas e toalhas e etanol para desinfecção. Observe todos os lotes de consumíveis e enzimas e também a temperatura dos Ringers Lactated, quando conectados ao sistema.<ol>
<li>Limpe o dispositivo com etanol e seguindo as instruções do fabricante</li>
		<li>Carregue o conjunto consumível no dispositivo e conecte um saco de Ringers Lactated ao sistema.</li>
		<li>Realize a série de testes semiautomáticos (teste de verificação e vazamento do sistema) antes de adicionar o lipoaspirato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe a lipoaspirata ficar em tubos de 50 mL enquanto as etapas em 3.1 são realizadas. Isso permitirá que a gordura se separe da fase líquida. Observe a quantidade total (em mL) do tecido adiposo e use-o para garantir que a quantidade de gordura carregada estará na faixa da capacidade do dispositivo.</li>
	<li>Carregue o tecido quando solicitado pelo dispositivo. A máquina agora drenará o excesso de fluido e pesará a quantidade de tecido adiposo carregado antes de ser lavada com Ringers Lactated.<ol>
<li>Quando o tecido for lavado e drenado novamente, conecte um novo saco de infusão com ringers lactados de 37-39 °C quando solicitado pela máquina.</li>
		<li>Reconstitua a enzima comercialmente disponível contendo colagenase e mistura de protease em Ringers Lactated de 5 mL (um frasco de enzima é suficiente para quantidades de gordura de até 270 mL).</li>
		<li>Certifique-se de que o dispositivo exibe a quantidade de enzima (baseada no peso do tecido) para injetar no recipiente com o tecido adiposo. Uma vez injetada, a digestão enzimática que é realizada sob agitação durará cerca de 20 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a digestão do tecido, deixe o agitador parar e verifique se o conteúdo está separado em duas fases: uma fase superior que contém lipídios, uma fase amarela e uma camada rosa inferior que contém os ADRCs. Deixe que esta última camada seja drenada para a câmara de processamento de células (que entra na centrífuga incorporada do dispositivo) do conjunto consumível, deixando a camada lipídica para trás.</li>
	<li>Deixe os ADRCs se concentrarem na câmara de processamento celular durante várias rodadas de centrifugação. Agora adicione 10 mL de Intravase (contém DNase, que ajuda a evitar a aglomeração na suspensão final do ADRC) reconstituída em Ringers Lactated. A reação enzimática dura 10 minutos após a qual os ADRCs são lavados. NOTA: Esta etapa é totalmente automática, e a máquina informará quando o processo é feito.</li>
	<li>Quando o isolamento dos ADRCs estiver concluído, resuspenque as células em 5 mL de Ringer Lactate. Aspire a solução em uma seringa de 5 mL.</li>
	<li>Monte uma torneira de 3 vias luer-lock fêmea na seringa de 5 mL contendo os ADRCs, e aspire 4 mL de ADRCs em outra seringa estéril de 5 mL.</li>
	<li>Transfira os últimos 1 mL para uma seringa de 1 mL. Use este 1 mL para caracterização ADRC, por exemplo, contagem de células, viabilidade celular, análise de marcadores de superfície por citometria de fluxo e capacidade de diferenciação do ADRC.</li>
	<li>Coloque uma agulha de 25 G na seringa de 5 mL contendo os 4 mL de ADRC antes de ser embalada em uma cortina estéril. Use os ADRCs para injeção no receptor. Neste caso, a solução dos ADRCs conterá, em média, 8,4-32,7 milhões de células.</li>
</ol>4. Implantação dos ADRCs em corpora cavernosum
NOTA: Este é um procedimento estéril. Todos os instrumentos devem ser estéreis, e a pessoa que injeta a solução contendo as células-tronco no cavernoso corpora deve usar luvas estéreis. O paciente está acordado durante este procedimento e receberá suas próprias células-tronco. Os ADRCs são injetados sem contar as células antes da injeção.
<ol><li>Mantenha a solução de ADRCs homogênea, inclinando a seringa suavemente até que ela seja injetada no corporatório.</li>
	<li>Coloque uma cortina de abertura sobre o pênis. Coloque um torniquete na raiz do pênis usando um laço de vaso de silicone. Aperte o laço e fixe-o com peã curvado. Faça o torniquete apertado o suficiente para parar o fluxo sanguíneo do pênis.</li>
	<li>Use duas trocas antissépticas para desinfetar a pele peniana no local da injeção (local lateral da corpora cavernosum). Injete 1 mL da solução contendo ADRCs, em um ângulo direto no cavernoso corporador no lado direito em dois lugares diferentes, repita este passo depois no corporarnoso esquerdo. O volume total de ADRCs injetados é de 4 mL.</li>
	<li>Espere por 30 minutos e depois remova o torniquete.</li>
	<li>Alta do paciente após 2h de observação após a injeção de ADRCs, para garantir que o paciente esteja bem recuperado após a anestesia.</li>
</ol>5. Cuidados pós-operatórios
<ol><li>Recomendo que o paciente não faça qualquer desempenho físico que possa elevar a pressão arterial na primeira semana, para evitar o desenvolvimento de hematomas.</li>
	<li>Recomendo que o paciente use a pasta abdominal por 24h nos primeiros 14 dias após a cirurgia e daqui para cá por 14 dias durante o dia.</li>
	<li>Tratar dor pós-púsplica com acetaminofeno oral (por exemplo, paracetamol; 1.000 mgs, 4 vezes por dia) e anti-inflamatório oral (por exemplo, ibuprofeno; 400 mgs 3 vezes por dia).</li>
</ol>

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</ol>

O autor Søren P. Sheikh é CEO da Blue Cell Therapeutics, Copenhague, Dinamarca.

O procedimento apresentado para isolar ADRCs não se limita a ser utilizado apenas para terapia de ED, mas pode ser usado em várias outras formas de tratamento e experimentos. Nosso estudo mostrou que ADRCs autólogos e recém-isolados são seguros de usar, e o tratamento é bem tolerável em um acompanhamento de 12 meses.
Antes do procedimento ser utilizado, existem algumas considerações a serem feitas. Uma desvantagem deste procedimento é que o paciente deve estar sob anestesia geral durante a lipoaspiração. A lipoaspiração é possível de realizar sob anestesia local, mas um estudo anterior mostrou que uma combinação de anestésicos locais e adrenalina pode ter um impacto negativo no crescimento celular dos fibroblastos20. O risco de estar sob anestesia geral é geralmente baixo, mas um resultado negativo ainda é visto. Esse risco deve ser levado em conta quando os pacientes são selecionados para o tratamento. A lipoaspiração é um procedimento cirúrgico e, portanto, sempre terá risco de complicações. Como em todos os outros procedimentos cirúrgicos, há risco de hemorragia pós-operatória resultando em formação de hematomas e risco de infecção. Alguns de nossos pacientes também relataram uma redução transitória da sensibilidade da pele abdominal. Uma complicação imediata da lipoaspiração é sangramento. Sabe-se que os pacientes correm o risco de ter complicações sistêmicas quando grandes quantidades de tecido são removidas. A lipoaspiração neste procedimento foi relativamente pequena e, portanto, não considerada um fator de risco.
Complicações para a injeção de células são relatadas como vermelhidão transitória, ternura e hematomas.
O dispositivo utilizado para o isolamento dos ADRCs, foi escolhido porque o sistema é aprovado pela CE. Na Dinamarca, é obrigatório usar equipamentos aprovados pela CE porque as autoridades classificam o tratamento com células-tronco como um teste de drogas, quando o ADRC é usado para injeção em humanos.
O dispositivo tem vantagens como todo o procedimento sendo padronizado e realizado em ambiente fechado estéril sem exigir um laboratório altamente classificado. O risco de contaminação é, portanto, reduzido. Isso garante que o procedimento seja uniforme e reprodutível, e que a qualidade do produto final seja sempre a mesma de cada vez (no entanto, também depende da qualidade do tecido de entrada). Realizar o isolamento no dispositivo é fácil e não requer operadores especialmente educados.
Uma limitação do dispositivo é que a entrada mínima na máquina é lipoaspirata drenada de 100 g. Como a lipoaspiração é completamente concluída antes do início do processamento celular (e no nosso caso, em um local diferente, não no OR) em nossa experiência, isso exigirá que a quantidade de lipoaspirato seja de pelo menos 125 mL usando a medida aproximada das seringas de 50 mL. Caso contrário, há o risco de não haver material suficiente para a máquina prosseguir. Além disso, usar o limite superior (entrada máxima é de 425 mL) resultaria em um procedimento de isolamento muito longo.
Células-tronco adultas tanto do tecido adiposo quanto da medula óssea parecem ter capacidade de auto-renovação e diferenciação como células-tronco embrionárias. Uma das vantagens dos ADRCs sobre células-tronco hemopoiéticas é um rendimento 100-500 vezes maior por volume de tecido em comparação com a medula óssea 21,22, e, portanto, os ADRCs não precisam ser cultivados. Além disso, as células-tronco hemopoiéticas são mais difíceis e mais dolorosas de colher do paciente do que o tecido adiposo. Em muitas situações, o tecido adiposo é apenas um produto de resíduo após a cirurgia. É possível cultivar células-tronco para dar um rendimento maior adequado para angiogênese, porém os ADRC's recém-isolados podem ter um potencial angiogênico maior do queo cultivado 23.

As células-tronco têm a capacidade de se diferenciar em diferentes tipos de células, e secretam fatores paracrinos que são pensados para promover o processo de cura no tecido danificado 1,2,3,4. São, portanto, atraentes dentro do campo da medicina regenerativa, pois podem representar um possível tratamento curativo.
A prostatectomia radical (RP) é o tratamento curativo dourado para pacientes com câncer de próstata localizado de baixo/intermediário e uma expectativa de vida > 10 anos. O objetivo da cirurgia é a erradicação do câncer, mas tem vários efeitos colaterais. A prevalência de incontinência pós-prostatectomia varia de 2-60% e disfunção erétil (ED) é experimentada por 20-90% dos pacientes5. A técnica de poupar o nervo é uma opção em alguns pacientes (escore de Gleason < 7, baixo risco de doença extracapsular)5. Essa técnica poupa os nervos responsáveis pela ereção, mas mesmo que isso seja possível, muitos pacientes ainda relatam ED no pós-operatório.
As opções de tratamento para reabilitação peniana após RP consistem principalmente em tratamento com inibidores PDE-5, terapia de injeção ou instilação e bombas de vácuo. Os medicamentos usados para reabilitação peniana diferem farmacologicamente, mas seu mecanismo de ação inclui o relaxamento das células musculares lisas no corpus cavernoso. No entanto, muitos pacientes experimentam falha no tratamento e nunca conseguem um efeito do medicamento que permite a relação sexual6.
Acredita-se que o ED que ocorre após a RP seja devido a alterações estruturalmente irreversíveis7. Essas alterações ocorrem no tecido cavernoso e incluem apoptose das células musculares lisas e endoteliais e fibrose. O mecanismo veno-oclusivo responsável por uma parte central da ereção, é prejudicado pelas mudanças, resultando em pior obturação e dureza do pênis7.
Muitos dos pacientes relatam que o ED que experimentam tem um impacto negativo na qualidade de vida8. Eles não estão prontos para desistir de sua atividade sexual após a cirurgia e, portanto, uma terapia curativa para ED é atraente, quando os outros tratamentos disponíveis para reabilitação peniana falham.
Em ensaios anteriores, incluindo ensaios de animais e pequenas fases 1 em humanos, as células-tronco mostraram resultados promissores como um tratamento alternativo para ed 2,9,10,11,12. Os resultados mostram que é seguro usar ADRCs, e que a função erétil é significativamente melhorada após uma única injeção no corporarnosum 2,9,10,11,12. Acredita-se que as células regenerativas derivadas do adiposo (ADRCs) apoiem a regeneração tecidual por mecanismos paracrinos através da liberação de múltiplos hormônios, fatores neurotróficos e outros fatores de crescimento, citocinas e, possivelmente, micro-RNAs13. Além disso, os ADRCs são capazes de se diferenciar em vários tipos de células maduras, incluindo células musculares endoteliais e vasculares, células de cartilagem, osteocitos e neurônios14,15. Essas propriedades tornam as células-tronco interessantes para o desenvolvimento de um novo tratamento permanente para ED.
As células-tronco são divididas em vários grupos, basicamente aqueles derivados do embrião precoce (células-tronco embrionárias) e aquelas de tecido adulto (células-tronco adultas). As células-tronco adultas incluem células-tronco mesenquimais (MSC) que são multipotentes e podem ser encontradas na medula óssea, tecido adiposo, sangue do cordão umbilical, placenta e polpa dentária17.
Células-tronco do tecido adiposo são fáceis de obter acesso, ao contrário das células-tronco derivadas da medula óssea. A colheita de células-tronco da medula óssea é um procedimento arriscado e doloroso comparado à lipoaspiração. O número de células possíveis de colheita da medula óssea será limitado, enquanto apenas os depósitos de tecido adiposo do paciente estabelecem o limite para o número de células que podem ser colhidas. É possível, portanto, isolar uma grande quantidade de células-tronco do tecido adiposo sem uma necessidade subsequente de cultivar as células para obter uma quantidade satisfatória. As células regenerativas derivadas de adiposos, também frequentemente referidas como a fração vascular estromal (SFV), é composta por muitos tipos de células, incluindo MSCs, células endoteliais, pericítes, células imunes e progenitores a partir de18. Tudo isso pode desempenhar um papel no processo regenerativo.
O objetivo do presente estudo é investigar o efeito das células-tronco em ED após RP usando 4 mL de ADRCs autólogos isolados do tecido adiposo recém-colhido após a injeção no corporarnoso.

<table><tbody><tr><td><forte>Lipoaspiração</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal</td><td>Binder Tamanho do Dale</td><td></td><td>dependente do paciente</td></tr><tr><td>Adesivo OP-toalha</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Adrenalina 1 mg/ml</td><td>Amgros I/s</td><td>74 44 23</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Suprimentos básicos OP</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>97010873-07</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de aço carbono 11</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhixidina Etanol</td><td>Faarborg Pharma</td><td>5% colorido</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto descartável Lipocollector 3</td><td>Human Med</td><td>670200</td><td></td></tr><tr><td>Mangueiras de extensão</td><td>Extrudan</td><td></td><td>5,8/8,3 mm, Ch 25, 3,5 M de comprimento</td></tr><tr><td>Gaze Rags</td><td>Barrier</td><td>175201</td><td>30x45 cm</td></tr><tr><td>Jelonet</td><td>Smith and Nephew Medical Ltd</td><td>90509225</td><td>10 x 10 cm</td></tr><tr><td>Marcaína 5 mg/ml + Adrenalina 5 microgramas</td><td>Astra Zeneca</td><td></td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Mesorb Bandagem</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>677001</td><td>10x13 cm</td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td>18 G + 23 G</td></tr><tr><td>Sutura monocryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td>04:00</td></tr><tr><td>Ringer-lactat</td><td>Fresinus Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas estéreis</td><td>Gammex</td><td>330052065</td><td></td></tr><tr><td>Bata cirúrgica</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>690103-01</td><td></td></tr><tr><td>Marcador Cirúrgico</td><td>Richard-Allan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara Cirúrgica</td><td>Seringa 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Codan Medical</td><td>6,28,402</td><td>50/60 ml</td></tr><tr><td>ponta de cateterismo Seringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>700016181</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>WAL- Aplicador para cânulas 25/30 cm</td><td>Human</td><td>Med REF 500001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Isolamento de ADRC's</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 303172</td><td></td></tr><tr><td>torneira de 3 vias</td><td>One Med</td><td>REF 10554-01</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo OP-toalha</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care AB</td><td>REF 906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Dispositivo Cytori Celution 800IV</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desinfecção swaps</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>25G (0,5*25 mm)</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Abena</td><td></td><td>Sem pó</td></tr><tr><td>OU cortina Folha, 2 camadas</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>REF 33005</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Lactato</td><td>Fresinus Kabi</td><td>06756 (DK)</td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>estéreis</tr><tr><td>Bata</td><td></td><td></td><td></td>estéril</tr><tr><td>Kit suplementar para Cytori Celution 800IV conceber</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometer</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>rastreável</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Injeção de ADRC's</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cortina de abertura</td><td>One Med</td><td>REF1565-01</td><td>75*90 cm</td></tr><tr><td>Troca de desinfecção</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Pean</td><td>Leibinger</td><td>32-01257</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Vessel Loop</td><td>Purple Surgical</td><td>REF PS3203</td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td> <td>estéreisSempermed</td><td></td><td>ou use o seu favorito</td></tr></tbody></table>

isolamento de células regenerativas derivadas de adipose para o tratamento da disfunção erétil após a prostatectomia radical

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

As células-tronco são usadas em muitas áreas de pesquisa dentro da medicina regenerativa, em parte porque esses tratamentos podem ser curativos e não sintomáticos. Células-tronco podem ser obtidas a partir de diferentes tecidos e vários métodos de isolamento foram descritos. O método apresentado para o isolamento de células regenerativas derivadas de adiposos (ADRCs) pode ser utilizado em muitas áreas terapêuticas porque o método é um procedimento geral e, portanto, não se limita à terapia de disfunção erétil (ED). O ED é um efeito colateral comum e grave para a prostatectomia radical (RP), uma vez que o ED muitas vezes não é bem tratado com terapia convencional. O uso de ADRC's como tratamento para ED tem atraído grande interesse devido aos resultados positivos iniciais após uma única injeção de células no corpora cavernosum. O método utilizado para o isolamento do ADRC é um processo simples e automatizado, que é reprodutível e garante um produto uniforme. Além disso, a esterilidade do produto isolado é garantida porque todo o processo ocorre em sistema fechado. É importante minimizar o risco de contaminação e infecção, uma vez que as células-tronco são usadas para injeção em humanos. Todo o procedimento pode ser feito dentro de 2,5-3,5 horas e não requer um laboratório classificado que elimine a necessidade de envio de tecido para um local fora do local. No entanto, o procedimento tem algumas limitações, uma vez que a quantidade mínima de lipoaspirato drenado para o dispositivo de isolamento funcionar é de 100 g.

O procedimento apresentado foi utilizado para um ensaio clínico de fase 1 de rótulo aberto, incluindo 21 pacientes19. O ponto final principal do ensaio foi a segurança do uso de ADRC's em humanos e o ponto final secundário foi o efeito do ADRC na função erétil.
Vinte e um homens foram incluídos no estudo com idade média de 60 anos (faixa 46-69) e uma ereção normal e vida sexual ativa antes do RP devido ao câncer de próstata. Todos sofreram de ED após o RP, sem sinais de recuperação de medicamentos disponíveis para reabilitação peniana. Seis homens sofreram de incontinência como efeito colateral para o RP. Todos os homens receberam uma única injeção intracavernousa de ADRC's isolada com o método apresentado.
Todos os 21 homens foram acompanhados com 4 atendimentos no ambulatório em 1,3,6 e 12 meses após a injeção. A função sexual foi avaliada com questionários validados – o Índice Internacional de Função Erétil-5 (IIEF-5) e escore de Dureza de Ereção (EHS) (Anexados como apêndices).
Não houve eventos graves durante o momento da observação. Oito homens relataram vermelhidão transitória e inchaço nos locais de injeção, três relataram reação na área peniana. Oito eventos reversíveis relacionados à lipoaspiração foram relatados, como desconforto abdominal leve e hematomas abdominais menores. Nenhum paciente relatou desconforto no seguimento de 1 mês. Oito em cada quinze (53%) no grupo continente relataram que a função erétil foi suficiente para a relação sexual aos 12 meses. O grupo de 6 homens incontinentes não mostrou melhora da função erétil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Continente</td>
			<td>Incontinente</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pacientes incluídos</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efeito significativo</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: A tabela mostra as diferenças no efeito significativo do tratamento entre pacientes do continente e do incontinente.

A divulgação precisa de métodos e protocolos é crucial para a absorção em larga escala de terapias com células-tronco. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar células regenerativas derivadas de adipose, usadas para uma única injeção intracavernósia como tratamento de disfunção erétil (ED) após prostatectomia radical (RP).

Isolamento de células regenerativas derivadas de adipose para o tratamento da disfunção erétil após a prostatectomia radical

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Esta técnica de isolamento pode ser usada para explorar se células-tronco adiposas podem ajudar os pacientes a regenerar a função erétil após a prostatectomia radical. Este método não se limita a uma doença específica. Pode ser usado em todas as áreas de pesquisa de células-tronco adiposas.As células-tronco isoladas são usadas para tratar a disfunção erétil, mas a técnica de isolamento é um procedimento geral e as células-tronco podem ser úteis em outras áreas dentro da pesquisa de células-tronco. Comece desinfetando a pele do abdômen e do escroto com 0,5% de clorexidina. Use um marcador cirúrgico para elaborar as áreas do abdômen onde a lipoaspiração será realizada, geralmente a área entre a síntese e o umbigo.Faça duas incisões de seis milímetros de largura na pele do abdômen com um bisturi número 11. Coloque as incisões simetricamente e lateralmente a partir da área de lipoaspiração desenhada. Coloque um pouco de lubrificante sobre as incisões para ter certeza de que a cânula de infiltração desliza para dentro e para fora das incisões facilmente durante a lipoaspiração.Em seguida, introduza uma cânula de infiltração tamanho 14 através das incisões na pele. Injete solução de Klein modificada subcutânea nas áreas marcadas paralelamente à superfície da pele até que o tecido alvo fique inchado e firme ou tumescente. Injete um volume de solução klein modificada em uma proporção de um para um para o tecido adiposo.Aguarde 10 minutos para maximizar os efeitos da adrenalina, e reduza a quantidade de sangue no tecido adiposo colhido. Realize uma lipoaspiração padrão de infusão de jato para colher de 200 a 300 milímetros de tecido adiposo. Use cânulas cegas que são ocas com um tubo de infusão integrado e bocal.Conecte a cânula a um dispositivo de sucção para lipoaspiração. Introduza uma seringa de três milímetros com uma ponta cega através das incisões no abdômen e colete o tecido adiposo no Coletor de Lipo para preservar a lipoaspirata em um ambiente estéril. A lipoaspirata começará a se separar da fase da água.Use 50 seringas estéreis mililitros para sugar o lipoaspirato do LipoCollector, minimizando o volume de água sugado nas seringas. Enrosque um plugue na ponta das seringas para manter o tecido adiposo estéril. Coloque seringas com ponta para baixo em um saco plástico estéril para iniciar a separação da lipoaspiração da fase da água.Em seguida, coloque o saco em um recipiente estéril. Cubra o recipiente com uma cortina estéril para proteger o ambiente estéril durante o transporte. Feche as incisões da pele com o material de sutura preferido do cirurgião.Coloque uma peça de compressão ao redor do abdômen para reduzir o edema pós-operatório. Para fazer um bloco peniano, injete a bupivacaína em dois locais, um colocado ventrally e o outro dorsalmente. Introduza toda a agulha no tecido subcutâneo, apontando-a lateralmente para a direita, e injete a anestesia à medida que a agulha é retraída.Repita a injeção, apontando a agulha para a esquerda. Coloque todos os consumíveis e enzimas asepticamente sobre a mesa coberta por uma toalha cirúrgica descartável estéril. Limpe o dispositivo com etanol e carregue o conjunto de consumíveis.Em seguida, conecte um saco de toques lactados ao sistema. Realize a série de testes semiautomáticos antes de adicionar o lipoaspirato. Enquanto o dispositivo estiver sendo preparado, deixe a lipoaspirata ficar em um tubo de 50 mililitros para permitir que a gordura se separe da fase líquida.Observe a quantidade total de tecido adiposo e use-o para garantir que a quantidade total de gordura carregada estará na faixa da capacidade do dispositivo. Carregue o tecido quando solicitado pelo dispositivo. A máquina vai drenar o excesso de fluido.Pesar a quantidade de tecido adiposo e lavá-lo com toques lactados. Quando o tecido for lavado e drenado, conecte um novo saco de infusão com ringers lactados de 37 a 39 graus Celsius. Reconstitua a enzima comercialmente disponível contendo colagenase e mistura de protease em cinco mililitros lactados.Certifique-se de que o dispositivo exibe a quantidade de enzima para injetar no recipiente com o tecido adiposo. Uma vez injetada, a digestão enzimática durará cerca de 20 minutos. Após a digestão do tecido, verifique se o conteúdo é separado em um lipídio superior contendo fase amarela e uma camada rosa inferior que contém as células regenerativas derivadas de adiposos, ou ADRCs.Deixe a camada rosa drenar para a câmara de processamento celular do conjunto consumível, deixando a camada lipídica para trás. Permita que os ADRCs se concentrem na câmara de processamento celular durante várias rodadas de centrifugação. Em seguida, adicione 10 mililitros de intrabase reconstituídos nos anéis lactados.A reação enzimática dura 10 minutos e os ADRCs são lavados depois. Quando o isolamento dos ADRCs for concluído, suspenda as células em cinco mililitros do lactato de Ringer e aspire a solução em uma seringa de cinco mililitros. Monte uma trava luer fêmea de galo de três vias na seringa e aspire quatro mililitros de ADRCs em outra seringa estéril de cinco mililitros.Transfira o último mililitro de ADRCs para uma seringa de um mililitro. Use esta alíquota para análises de caracterização do ADRC, como contagem de células, viabilidade celular, análise de marcadores de superfície por citometria de fluxo e capacidade de diferenciação do ADRC. Coloque uma agulha de calibre 25 na seringa de cinco mililitros contendo os quatro mililitros de ADRCs.Em seguida, embale-o em uma cortina estéril. Esta solução de ADRCs será injetada no receptor e deve conter, em média, de 8,4 a 32,7 milhões de células. Certifique-se de que a solução de ADRCs permanece homogênea, inclinando a seringa suavemente até que seja injetada no corpora cavernosum.Coloque uma cortina de abertura sobre o pênis. E um torniquete na raiz do pênis com um laço de silicone. Aperte o laço e fixe-o com fórceps, tornando o torniquete apertado o suficiente para impedir o fluxo sanguíneo do pênis.Use dois cotonetes antissépticos para desinfetar a pele peniana no local da injeção. Em seguida, injete um mililitro da solução ADRC em um ângulo direto no cavernoso corpora, no lado direito em dois lugares diferentes. Repita este passo no cavernoso corporativo esquerdo, injetando um volume total de quatro mililitros.Este método foi testado em um ensaio clínico de fase um em 21 homens com idade média de 60 anos e uma ereção normal e vida sexual ativa antes de uma prostatectomia radical. Seis dos homens também sofreram de incontinência. Todos os homens receberam uma única injeção inter cavernosa de ADRCs isolados e foram acompanhados com quatro visitas no ambulatório às 1, 3, 6 e 12 meses após a injeção.Nenhum evento grave ocorreu durante o momento da observação. Oito homens relataram vermelhidão transitória e inchaço nos locais de injeção, e três relataram reação na área peniana. Oito homens experimentaram eventos reversíveis menores relacionados à lipoaspiração, como desconforto abdominal leve e hematomas abdominais leves.Nenhum paciente relatou desconforto no acompanhamento de um mês. Sua função sexual foi avaliada com o Índice Internacional de Função Erétil Cinco e o Ereção Dureza. Oito em cada 15 homens do grupo continente relataram que sua função erétil era suficiente para a relação sexual aos 12 meses.O grupo de seis homens incontinentes não mostrou qualquer melhora da função erétil Ao tentar este protocolo, tenha em mente que as enzimas que são utilizadas durante o procedimento de isolamento devem ser retiradas do freezer ou da geladeira duas horas antes do início do procedimento. Os resultados desta técnica abriram caminho para um RCT onde os efeitos das células-tronco adiposas são explorados em uma escala maior.

isolation-adipose-derived-regenerative-cells-for-treatment-erectile

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

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