Name: Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a isolar células B malignas e não-malignas de peixes-zebra lck:eGFP para estudar leucemia linfoblástica aguda. Este método permite analisar células T e B e investigar mecanismos de câncer pediátrico.

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Gostaríamos de agradecer a Megan Malone-Perez para cuidados de zebrafish e o núcleo de citometria de fluxo OUHSC. Este trabalho foi financiado por doações de Hyundai Hope sobre rodas, o centro de Oklahoma para o avanço da ciência e tecnologia (HRP-067), um prêmio de projeto piloto de NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detém o E.L. & Thelma Gaylord dotado cadeira em Hematologia-Oncologia Pediátrica da Fundação do Hospital de crianças.

Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no centro de Ciências da saúde Universidade de Oklahoma.
1. isolando B não-malignas e linfócitos T do transgênico lck:eGFP peixe
<ol><li>Anestesia o peixe usando metanosulfonato de 0,02% (MS-222) no sistema de água de peixes.</li>
	<li>Examine o peixe de 2-6 meses de idade para thymi fluorescente, que estão localizados no aspecto dorsomedial da cavidade branquial de zebrafish e outros teleósteos14. Use um microscópio de epifluorescência (470/40 de comprimento de onda de excitação e emissão de 525/50 filtro) para detectar as boas práticas agrícolas.</li>
	<li>Prepare com antecedência 50 mL de filtro-esterilizados 1 x Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) contendo 1% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina (classificação de mídia). Mídia de classificação não utilizadas pode ser armazenadas a 4 ° C por até 2 meses.</li>
	<li>Eutanásia o peixe, colocando-o em um béquer contendo 0,2% tricaina por aproximadamente 5 min, seguido por imersão de banho de gelo. Confirme morte com a cessação do movimento de odontódios (peixe).</li>
	<li>Coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e dissecar órgãos linfoides de interesse, usando o microscópio fluorescente para dissecar o GFP+ thymi14e configurações de microscopia de campo claro para dissecar o rim para a medula e o baço15. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando a 3 meses de peixes. Proporções de linfócitos e números absolutos variam de acordo com a idade e genótipo (veja a discussão para mais detalhes).</li>
	<li>Coloque cada órgão dissecado em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l de frio a classificação de meios de comunicação.</li>
	<li>Homogeneizar o tecido no gelo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.</li>
	<li>Passe o tecido homogeneizado através de um filtro de malha de 35 µm para gerar uma suspensão de célula única. Manter as células no gelo até análise.</li>
</ol>2. isolar linfócitos malignos de duplo-transgênicos rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafish
<ol><li>
Começando em 2-4 meses, microscopicamente a tela rag2:hMYC; lck:eGFP peixe por padrões anormais de GFP. Nota: as células B são GFPEis no fundo lck:eGFP , B-ALL requer prática para reconhecer; T-tudo é óbvio, porque as células T são GFPOi. Consequentemente, a rag2:hMYC, lck:eGFP linha dual-transgênicos tem dois fenótipos: brilhantemente-fluorescente T-ALL, que geralmente surgem a partir do Timo e estender para o corpo e palidamente fluorescente B-ALL.<ol>
<li>Usando um microscópio fluorescente, tela o peixe usando as configurações de "baixa exposição" (200 ms, ganho x 2,4) para identificar brilhante T-ALL (figura 1A) e "alta exposição" (1,5 s, ganho x 3,4) para identificar dim B-ALL (figura 1A). Controles WT e pre-leucêmicas peixes têm GFP localizada apenas no timo (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesia e examinar o peixe como descrito nos passos 1.1-1.2.</li>
	<li>Categorize os peixes baseados-se na medida da fluorescência de GFP, usando um simples sistema de categoria de três: Nota: Nível 1: Fluorescência aparece como um tumor do Timo com apenas limitada difusão local. Nível 2: Fluorescência aparece além do timo, envolvendo < 50% do corpo. Nível 3: Fluorescência ultrapassa 50% do corpo.</li>
	<li>Separe o peixe com todos do que aqueles sem câncer. Monitore pre-leucêmicas peixe (ou seja, sem tumores GFP+ ) uma vez mensal para o desenvolvimento do novo tudo. Por ~ 9 meses, todos os rag2:hMYC, lck:eGFP peixe desenvolve T-ALL, B-ALL, ou ambos.</li>
	<li>Para isolamento de células B ou T --todos, selecione o peixes de nível 3 (todos envolvendo > 50% do corpo), que rende mais de 2 x 106 todas as células e geralmente muitos mais.</li>
	<li>Eutanásia o peixe como na etapa 1.4. Nota: Existem dois métodos para obter todas as células: corpo inteiro homogeneização e uma técnica de lavagem peritoneal16. Os métodos diferem no número absoluto de células coletadas para classificação, e assim, os montantes de FACS tempo necessário e custo (veja a discussão para mais detalhes).</li>
	<li>Para qualquer método, primeiro coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e usando uma lâmina de barbear, retire a cabeça, incluindo a região do timo. Isto pode ser processado separadamente, se desejado, ou usado para coloração histológica.</li>
	<li>
Método de lavagem peritoneal
	<ol>
<li>Usando uma pipeta P1000, lave a cavidade peritoneal de peixe com 500 µ l de frio classificação mídia, coletando as células e a mídia em um tubo de 5 mL.</li>
		<li>Utilize uma ponta de pipeta fresco, injete um μl 200 – 300 adicionais de classificação criogênicos na cavidade do corpo. Em seguida, usando a ponta da pipeta, aplique uma pressão suave para o corpo do peixe para expulsar as células fora da cavidade do corpo. Recolher esta mídia e adicionar ao tubo de 5 mL.</li>
		<li>Repita a etapa 2.8.2 2 – 3 vezes. Manter as células coletadas na classificação de mídia no gelo.</li>
		<li>Filtre a suspensão de células, apesar de uma malha de 35 µm filtro antes da citometria de fluxo/FACS e manter as células no gelo até análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homogeneização de corpo inteiro
	<ol>
<li>Depois de retirar a cabeça do peixe, coloca o corpo em um tubo de 1,5 mL contendo 200 µ l de classificação de meios de comunicação.</li>
		<li>Homogeneizar o corpo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.</li>
		<li>Adicione um adicionais 300 μL de frio a classificação de meios de comunicação. Filtre a suspensão de células, apesar de um filtro de malha de 35 µm. Adicione mídia classificação conforme necessário para lavar todas as células através do filtro, até que apenas os restos de tecido permanecem no filtro. Manter as células no gelo até análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cytometric Analysis dos linfócitos B Normal ou maligno
<ol><li>Conjunto de análise de fluxo cytometric e/ou parâmetros de FACS, de acordo com o guia do fabricante.</li>
	<li>
Adquira o número desejado de eventos inicialmente caracterizar a amostra. Analise a 1 x 104 a 5 x 104 eventos antes da classificação para determinar a portas específicas para as etapas subsequentes de classificação.
	<ol>
<li>Determinar os portões: definir linfócitos e progenitoras portões de célula usando forward scatter (FSC) e parâmetros de dispersão (CCD) de lado, excluindo os restos celulares (Fig. 2A-C)17. FSC e CCD correspondem a célula tamanho/diâmetro e granularidade, respectivamente. Nota: GFP–, GFPEise GFPOi células diferem 10-para-100-fold em termos de sua intensidade de fluorescência de GFP, tornando a separação destas populações simples (figuras 2-5). Discriminação de morto-vivo pode ser avaliada neste ponto usando iodo propidium (PI) ou 7-aminoactinomycin D (7-Agostinho) viabilidade coloração. Experiências anteriores com PI geralmente demonstram > 95% de viabilidade de células GFP+ após FACS.</li>
		<li>Exclua as parelhas de célula, de acordo com os parâmetros da máquina FACS sendo usado.</li>
		<li>Dentro dos portões linfoides e/ou precursor, determine o número e a percentagem de células GFP+ .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir portão de GFP– vs GFPEis vsOi células GFP. Nota: As células B apresentam fluorescência ofuscante de GFP e células T mostram GFP brilhante nas linhas de lck:eGFP . Muitos órgãos linfoides ou tumor amostras contêm ambas as populações GFP+ . B-linhagem células/B-todos são GFPEis e T-linhagem de células/T-ALL são GFPOi. Definir portas para distinguir entre GFP–, GFPEiseOi células GFP e coletar estas populações separadamente (Fig. 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A e Figura 5a).</li>
	<li>Classificar cada população de células em tubos de polipropileno de diferentes 15 mL contendo 2 mL de classificação de meios de comunicação, ou diretamente em tubos de diferentes 1,5 mL, contendo um amortecedor apropriado para análises mais adicionais (por exemplo, RNA, DNA ou extração da proteína, allo-transplante, etc.).</li>
	<li>Manter células purificadas no gelo antes de novas análises.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflito de interesses.

Desenvolvemos e fornecer um protocolo para isolar as células B de lck:eGFP zebrafish transgênicos, adicionando isso para outros modelos de d. rerio com B-linhagem rótulos3,4. Surpreendentemente, a identificação de GFPEis B células nesta linha passou despercebida desde sua descrição em 2004. Geralmente, lck é considerado de células T específicas6, mas os estudos recentes encontraram expressão inesperada...

Zebrafish oferecer atributos poderosos, como manipulability genética, alta fecundidade, translucidez óptico e desenvolvimento rápido que facilitam o desenvolvimento de vertebrados estudando usando abordagens genéticas. Estas vantagens, juntamente com os recursos compartilhados de teleósteos e mamíferos hematopoiese, fazem d. rerio ideal para análises in vivo da função linfopoiese e linfócitos, de sua aparência mais antiga em larvas em toda a idade adulta. Desenvolvimento de sangue no zebrafish assenta bem conservados processos genéticos que são compartilhados com mamíferos, e estes se prolongam para o sistema imune adaptativo. Além disso, os mecanismos moleculares que regem o desenvolvimento linfoide são notavelmente conservados entre zebrafish e mamíferos1.
Nas últimas 2 décadas, transgénicos d. rerio linhas que linhagens de sangue específico de rótulo e linhas mutantes deficientes nestas linhagens foram criadas2,3,4,5. Um destes, a lck:eGFP linha de transgénicos, usa o promotor zebrafish linfócito proteína tirosina quinase (lck) para direcionar a GFP expressão6. Este gene, que é altamente expressa por ambos precursores de T-linhagem e linfócitos T maduros, permite em vivo, monitoramento do desenvolvimento do timo de células T e ex vivo da purificação de células T-linhagem por FACS7. Anteriormente, usamos esta linha em uma tela de mutagénese ENU para diante-genética para identificar germline mutantes propensos a T-ALL e estudar adquiridas somaticamente genéticos eventos ligados à célula T mixomas8,9.
Recentemente, nosso laboratório alargado a utilidade do lck:eGFP zebrafish. Em duplo-transgênicos rag2:hMYC (MYC humana), lck:eGFP D. rerio que são conhecidos por desenvolver T-tudo 10, descobrimos que B-linhagem todos também ocorrem11. Ao contrário de T-tudo neste modelo, que fluorescem brilhantemente devido a alta expressão de GFP, B-ALL são palidamente fluorescentes devido aos baixos níveis GFP, permitindo peixe com B-tudo a ser distinguida grosseiramente aqueles com T-ALL por microscopia fluorescente. Esta expressão diferencial de GFP também permite a separação de GFPEis B-todas as células de GFPOi células T-ALL usando FACS11. Além disso, baixa lck expressão não é exclusivo do zebrafish B-ALL, como humanos B-ALL também expressam os baixos níveis de LCK11,12. Da mesma forma, as células normais de B-linhagem de d. rerio, camundongos e humanos também expressam níveis baixos de lck/Lck/LCK, com as células B imaturas, tendo a mais alta expressão11,13. Em uma base por célula, as células B-linhagem em linhas de zebrafish ou derivado de lckeGFP expressam 1-10% tanto GFP como linfócitos T. Estes GFPEis células expressa característica mRNAs de células B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze outros e podem ser purificado a partir da medula, timo, baço ou periférico sangue,11. Portanto, ambos linhagem B - e T-células podem ser isolado de lckeGFP zebrafish e no caso de rag2hMYC, lckeGFP animais, células B e T-tudo bem como11.
Aqui, apresentamos nosso protocolo para eficientemente FACS-purificar não-malignas células B de lck:eGFP zebrafish e não-malignas ou malignas de células B de rag2hMYC; lck:eGFP peixe, usando vários tecidos de origem. Tais células da mesma forma podem ser quantificadas por citometria de fluxo, sem isolamento de FACS, se desejado. Descoberta de baixo lck expressão- e consequentemente, baixa expressão de GFP-por B células abre novas portas de possibilidades experimentais para lckeGFP zebrafish, tais como estudos do desenvolvimento de células vivo em B. Assim, esta linha de transgénica, relatada pela primeira vez em 2004, tem vida nova como buscamos para utilizá-lo para recolher ideias frescas relativa imunidade adaptativa zebrafish.

<table><tbody><tr><td>35 &micro; m mesh</td><td>Sefar Filter technology</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de poliestireno de fundo redondo com tampa de filtro de célula</td><td>Falcon Corning Marca</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato de metanassulfonato; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>Ver Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>Versão 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizadores de microtubos de pilão</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td></td><td></td><td></td> de transferência de plástico</tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Veja Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

isolando a maligna e as células b não-maligna do lck:egfp zebrafish

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento de linfócitos. Como mamíferos, d. rerio possuem um sistema imune adaptativo que inclui linfócitos B e T. Estudos de zebrafish linfopoiese são difíceis porque os anticorpos reconhecendo d. rerio marcadores de superfície celular geralmente não estão disponíveis, complicando o isolamento e caracterização de populações de linfócitos diferentes, incluindo B-linhagem células. Linhas transgénicas com linhagem específicas fluoróforo expressão são frequentemente utilizadas para contornar esse desafio. A linha de transgênicos lck:eGFP tem sido usada para estudar o desenvolvimento de células T d. rerio e também tem sido utilizada para o modelo de desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Embora lck:eGFP peixe têm sido amplamente utilizados para analisar a linhagem T-, eles não foram usados para estudar as células B. Recentemente, descobrimos que muitos zebrafish B células também expressam lck, embora em níveis inferiores. Consequentemente, lck:eGFP B células da mesma forma expressam níveis baixos de GFP. Baseado nesta constatação, desenvolvemos um protocolo para purificar as células B-linhagem de lck:eGFP zebrafish, que relatamos aqui. Nosso método descreve como utilizar um classificador fluorescente-ativado da pilha (FACS) para purificar as células B de peixe lck:eGFP ou linhas relacionadas, tais como double-transgénicos, rag2:hMYC; lck:eGFP peixe. Nestas linhas, células B, as células B particularmente imaturas, GFP expresso em níveis baixos, mas detectáveis, permitindo que eles sejam distintos de células T, que expressam a GFP altamente. As células B podem ser isoladas da medula, timo, baço, sangue ou outros tecidos. Este protocolo fornece um novo método para purificar as células B d. rerio , permitindo estudos focados em temas como o desenvolvimento de células B e linfócitos B malignidades.

Nós usamos a citometria de fluxo para analisar e FACS para isolar a GFPEis e GFPOi células do timo, medula renal e baço de lck:eGFP zebrafish transgênicos. Análise de peixe 3 meses revelou que o Timo contida principalmente os linfócitos GFP+ . Células GFP+ em grande parte estavam confinadas ao portão linfoide anteriormente descrito pelo Traver et al.17. Duas populações distintas de GFP+ , GFPEis</...

Zebrafish transgênicos lck:eGFP express GFP altamente em linfócitos T e têm sido usados para estudar o desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda. Esta linha pode ser usado para células de estudo B, que expressam lck em níveis inferiores. Este protocolo descreve a purificação das malignas e não-malignas de células B de lck:eGFP zebrafish.

Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Descobrimos recentemente que muitas células B em zebrafish LCK GFP expressam baixos níveis de GFP. Isso faz desta linha uma ferramenta útil para estudar células B, bem como células T. A principal vantagem dessa técnica é que agora podemos estudar células B e células T a partir de zebrafish LCK GFP ou podemos estudar células B-ALL e T-ALL de peixes com câncer.Esses métodos permitem o desenvolvimento de células B e estudos B-ALL em zebrafish. Que são relevantes para entender o sistema imunológico adaptativo e são malignidades comuns no câncer pediátrico. Se você nunca fez essas dissecções antes de querer refinar sua técnica algumas vezes até que você possa obter boas amostras de timo e medula.A demonstração visual ajudará os espectadores a reconhecer fluores e B-ALL em peixes e selecionar as configurações corretas para discriminar células B e T para seu isolamento. Após anestesiar com 0,02% Tricaine no sistema de peixes, use o filtro GFP em um microscópio de epifluorescência para examinar o zebrafish de dois a seis meses de idade para a timmi fluorescente no aspecto medial dorsal da cavidade ramificada. Depois de localizar o timo coloque peixes eutanizados em uma placa de Petri e use o microscópio fluorescente para remover o timmi positivo GFP.E configurações de microscopia brightfield para colher a medula renal e baço. Coloque cada órgão coletado em um tubo de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de meio de triagem fria e use um homogeneizador de microtubo piloso para homogeneizar os tecidos no gelo. Em seguida, coe o tecido homogeneizado através de um filtro de malha de 35 micrômetros para gerar uma única suspensão celular e colocar as células no gelo.A partir de dois a quatro meses, use um microscópio fluorescente para tela de rag2:hMYC LCK EGFP utilizando configurações de baixa exposição para identificar leucemia linfoblástica aguda de células T brilhantes ou T-ALL e configurações de alta exposição para identificar animais B-ALL dim. Controle do tipo selvagem e peixes pré-leucínmicos têm GFP localizado apenas no timo. Categorize o peixe com base na extensão da fluorescência GFP usando um sistema simples de três categorias.Peixes de nível um demonstram um sinal fluorescente como um tumor tilamico com apenas uma propagação local limitada. Peixes de nível dois demonstram um sinal fluorescente além do timo envolvendo menos de 50% do corpo. E os peixes nível três demonstram um sinal fluorescente que se estende além de 50% do corpo.Separe o peixe com ALL daqueles sem câncer. E monitore os peixes pré-leucínmicos sem tumores positivos de GFP uma vez por mês para o desenvolvimento de novos ALL. Para isolamento de células T ou B-ALL use uma lâmina de barbear para remover a cabeça e a região timimática de um peixe de nível três eutanizado e colocar o corpo em uma placa de petri.Use uma pipeta P-1000 para lavar a cavidade peritoneal do peixe com 500 microliters de meio de triagem fria, coletando as células e o meio em um tubo de cinco mililitros. Usando uma ponta de pipeta fresca, injete de 2 a 300 volumes adicionais de 200 a 300 microliter de meio de triagem fria na cavidade corporal e use a ponta da pipeta para aplicar pressão suave ao corpo do peixe para extruir as células da cavidade corporal no tubo de cinco mililitros. Em seguida, coe a suspensão celular através de um filtro de malha de 35 microliter.E coloque as células no gelo até que sua análise por citometria de fluxo. Para a homogeneização do corpo inteiro use um homogeneizador de microtubo pilão para homogeneizar o corpo do peixe e adicionar mais 300 microliters de meio de triagem fria ao tubo. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de malha de 35 micrômetros, lavando o filtro com meio de classificação adicional conforme necessário, até que apenas os detritos de tecido permaneçam no filtro.Em seguida, coloque as células no gelo até sua análise. Para análise citométrica de fluxo das células isoladas, de acordo com as diretrizes do fabricante, as células do fluxo estabelecem os parâmetros do citômetro de fluxo. E adquira 10.000 a 50.000 eventos para definir os parâmetros de dispersão e dispersão lateral para definir os portões celulares linfócitos e progenitores e excluir os detritos celulares.Exclua os dobradores celulares e use os portões linfoides e/ou precursores para determinar o número e a porcentagem das células positivas do GFP. O uso de ficoerthrina e as intensidades GFP definem portões para as células negativas GFP versus GFP baixas versus GFP. Aprender onde colocar os portões para isolar as células altas GFP e GFP é fundamental para obter populações puras de células B e T.Duas populações positivas de GFP distintas, células B baixas GFP e células T altas GFP podem ser obtidas a partir do timo. As células B residentes na medula renal de zebrafish de três meses de idade expressam baixos níveis de GFP. As células altas do GFP são escassas, no entanto, indicando que apenas uma pequena porcentagem de linfócitos T estão presentes na medula aos três meses de idade.Da mesma forma, as amostras esplênicas mostram percentuais mais elevados de GFP baixos do que as células altas de GFP. Em peixes transgênicos duplos que ainda não desenvolveram leucemia linfoblástica aguda, a expressão GFP no timo, medula e baço é semelhante à observada em peixes LCK EGFP uni transgênicos. No entanto, o número de linfócitos por órgão é aumentado.Presumivelmente, devido à expansão impulsionada pelo MYC de populações imaturas de células B e T nas quais o promotor rag2 está ativo. Em peixes transgênicos duplos com B e ou T-ALL que desenvolveram cânceres fluorescentes por seis meses B-ALL são cânceres vagamente fluorescentes contendo principalmente células baixas de GFP. Em contraste, peixes brilhantemente fluorescentes podem abrigar populações isoladas de T-ALL ou mistas de células B-ALL baixas e T-ALL de GFP.De fato, como avaliado pela análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase, as células baixas do GFP expressam níveis mais elevados de transcrições celulares B. E as células altas do GFP expressam níveis mais altos de genes de células T, LCK e o marcador GFP. É fundamental aprender a reconhecer peixes com B-ALL por microscopia.E como definir adequadamente os portões de citometria de fluxo para separar as populações baixas e gfp baixas e gfp. Após este procedimento, você pode isolar DNA, RNA ou proteína de células altas GFP e GFP para PCR, sequenciamento, o que está em experimentos de transplante de sangue ou in vivo. Uma vez que aprendemos que os peixes LCK GFB têm células B fluorescentes, além de células T, poderíamos estudar ambos os tipos de células do mesmo animal para avaliar B e T-ALL.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

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