Name: Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda a usar ensaios de híbrido um de levedura aprimorados para identificar fatores de transcrição que se ligam a sequências de DNA humano em alta escala. Este método permite rastrear mais de 1.000 TFs simultaneamente.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].

1. preparações
<ol><li>
Placas −H de −U de SC (pratos de Petri 150 mm) Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo de cepas de leveduras a DNA-isca.<ol>
<li>Dissolva a mistura de abandono, base de nitrogênio levedura (YNB), adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de mídia; ver tabela 2 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.</li>
		<li>Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).</li>
		<li>Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.</li>
		<li>Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C em banho-maria.</li>
		<li>Adicione a leucina e o triptofano para a mídia. Misture bem em um prato Misture e despeje em pratos de Petri estéril de 150 mm (~ 80 mL por prato). Seco por 3 – 5 dias à temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar em temperatura ambiente por até 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Placas retangulares de YAPD Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo do gramado para a cepa de DNA-isca e para acasalamento com a coleção de matriz TF.<ol>
<li>Dissolver o pós (ver quadro 3 para composição), com exceção de ágar, em 950 mL de água em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.</li>
		<li>Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).</li>
		<li>Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.</li>
		<li>Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão.</li>
		<li>Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e legal a 55 ° C. Despeje as placas retangulares de mídia (ver Tabela de materiais; ~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 6 meses. Nota: Embora o volume de mídia sugerida é 70 mL por placa, 50 – 80 mL por placa pode ser usado. As três questões críticas a considerar quando derramando placas são 1) que eles são redistribuídos para que os meios de ágar tem a mesma espessura em toda a placa (usar uma tabela nivelada ou superfície para placa derramar e não despeje em pilhas de mais de sete placas) 2) para garantir a ausência de bolhas no agar mídia (bolhas devem ser exibidas usando uma agulha esterilizada) e 3) as placas de secagem para apenas um dia e envolvendo as placas em sacos de plástico para evitar falhas na fixação de levedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
−Trp SC e Sc −U −Trp retangulares placas Nota: Estas placas serão usadas para a coleção de matriz TF (−Trp Sc) crescente e selecionar levedura diploide após o acasalamento (Sc −U −Trp).<ol>
<li>Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com NaOH 5m (cerca de 1 mL por litro de mídia) (ver tabela 4 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.</li>
		<li>Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).</li>
		<li>Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.</li>
		<li>Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.</li>
		<li>Adicione a leucina, histidina e uracil (omitir o uracil para as placas de −Trp −U de Sc).</li>
		<li>Misture bem em um prato Misture e despeje em placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg) e tubulação de 6 mm. Secar por 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe as placas em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + retangulares placas X-galão Nota: estas placas serão usadas como placas de leitura para ensaios eY1H.<ol>
<li>Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 850 mL de água (ver tabela 5 para composição). Fazer não pH. Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.</li>
		<li>Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar a 850 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).</li>
		<li>Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.</li>
		<li>Prepare-se 10 x sais BU (1L) pela combinação de 900 mL de água, 70 g de Na2HPO4∙7H2O e 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. Mix usando uma barra de agitar para dissolver o pó e ajustar o pH a 7,0 usando 5 M de NaOH. Adicione água a 1 L e autoclave.</li>
		<li>Prepare a solução de X-galão, adicionando 3,5 g de pó X-galão para um tubo de plástico de 50 mL contendo 42,5 mL de dimetil formamida. Adicionar o pó de X-galão de dimetil Formamida a dissolver mais facilmente (isso leva 30 min). Manter a solução no escuro (tubo opaco 50ml de uso ou cobertura na folha). Loja a-20 ° C.</li>
		<li>Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose e a 10x BU sais (ver tabela 5 para composição), misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.</li>
		<li>Adicione a leucina, 3AT e X-gal (ver tabela 5 para composição).</li>
		<li>Misture bem em um prato Misture e despeje as placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar na sala fria, coberta de papel alumínio (3AT e X-gal são sensíveis à luz) até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mancha uma matriz TF
<ol><li>
Descongelar a matriz TF-presa
	<ol>
<li>Descongele as placas de estoque de glicerol de fermento com a matriz de TF-presa no gelo. Nota: TF-rapina matrizes podem ser gerados como publicado anteriormente10,12,13,18.</li>
		<li>Ressuspender o fermento utilizando uma pipeta de 12 canais dentro de 1 – 3 min antes da próxima etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Manchando o fermento em Sc −Trp placas retangulares
	<ol>
<li>No robô HDA (ver Tabela de materiais), selecione multi bem 96 placas como fonte, 96 placas de ágar como alvo e almofadas de 96 pino longo. Nota: PIN pads não são reutilizáveis e devem ser descartados.</li>
		<li>Selecione o programa Replicar muitos para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação de trás das populações de congelados.</li>
		<li>Selecione a opção para rodar em cima e para baixo na fonte de misturar o fermento.</li>
		<li>Saco da matriz manchada e incubar com agar acima a 30 ° C durante 2 a 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerando 384 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp
	<ol>
<li>No robô, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placa de ágar como alvo e 96 almofadas de pino curto.</li>
		<li>Selecione o programa matriz 1:4 . Desta forma, placas de quatro 96 colônia (cada um contendo um TF diferente) serão consolidadas na placa uma 384 colônia. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação entre diferentes placas.</li>
		<li>Saco as placas e incubar o matriz de 384-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C por 2 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração de 1.536 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp Nota: Isso resultará em matrizes contendo quatro colônias para cada TF-presas.<ol>
<li>No robô, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de 1.536 ágar como alvo e 384 almofadas de pino curto.</li>
		<li>Selecione o programa de fonte única de ensaio de 1:4. O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicates. Usar a reciclagem e revisitar as opções como envolve copiar quatro vezes cada colônia.</li>
		<li>Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C durante 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificando a matriz de 1.536 colônia em placas retangulares de Sc −Trp
	<ol>
<li>No robô, selecione 1.536 placas de ágar como fonte, 1.536 placas de ágar como alvo e 1.536 almofadas de pino curto.</li>
		<li>Selecione o programa Replicar muitos para replicar cópias de 3 – 4. Usar a reciclagem e revisitar a opção, mas jogar fora a almofada, ao alternar para um prato diferente da matriz para evitar a contaminação cruzada.</li>
		<li>Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para 30 ° C por 3 dias para usar para acasalamento passos (veja abaixo). Depois disso, manter as placas em temperatura ambiente e copiar novamente depois de 7 dias para uma nova rodada de seleção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H tela
<ol><li>
Preparando os gramados de estirpe de DNA-isca para acasalamento
	<ol>
<li>Manchar o fermento cepas de DNA-isca em uma placa −H de −U de Sc e crescer por 3 dias a 30 ° C.</li>
		<li>Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa diferentes cepas de 12 a 16. Incubar um dia a 30 ° C.</li>
		<li>Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa 4 diferentes cepas. Incubar durante um dia a 30 ° C.</li>
		<li>Raspe o fermento usando um palito esterilizado, certificando-se não raspar qualquer agar e adicionar em um tubo 1,5 com 500 µ l de água estéril.</li>
		<li>Adicione contas de vidro estéril de 10 – 15 num prato retangular YAPD. Adicionar a suspensão de levedura na chapa e agitar cuidadosamente em todas as direções por 1min garantir que o fermento é espalhado através de toda a placa.</li>
		<li>Inverter a placa imediatamente e para que os grânulos de ir para a tampa. Retire e Recicle os grânulos.</li>
		<li>Saco as placas e incubar agar para baixo por 1 – 2 dias a 30 ° C. Então prossiga para a etapa de acasalamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acasalamento de levedura DNA-isca e cepas de matriz TF
	<ol>
<li>Transferi a matriz TF para uma chapa retangular de YAPD com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir para placas YAPD 3-4 (dependendo do número de placas na matriz). As placas de matriz TF usadas para acasalamento devem ser 2-3 dias de idade, mas não mais como acasalamento podem ser ineficiente.</li>
		<li>Transferi o gramado de uma estirpe de DNA-isca para as placas YAPD, já que contém a matriz TF com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Usar um offset aleatório na fonte com um raio de ~0.6 mm para evitar tomar levedura do mesmo lugar e misture no alvo para facilitar o contacto entre cepas de leveduras. Usar o gramado contendo as cepas de DNA-isca (seção 3.1), como fonte, e as placas YAPD que contém a matriz TF visto no passo 3.2.1 como alvo.</li>
		<li>Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C para 1 dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seleção de levedura diploide
	<ol>
<li>Transferi o fermento acasalado das placas YAPD para chapas de −Trp −U de Sc com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar . Misture na origem e no destino.</li>
		<li>Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por 2 – 3 dias (incubação mais tempo leva a atividade de repórter de fundo elevado).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferir para placas de leitura
	<ol>
<li>Transferi a levedura diploide das placas de −Trp −U de Sc para a leitura placas retangulares Sc −U −H −Trp + 3AT 5mm + 0,4 mM X-galão usando o robô. Selecione as placas de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar .</li>
		<li>Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por até 7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagens de placas de leitura
	<ol>
<li>Para linhagens de DNA-isca com atividade de repórter de fundo elevado, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos, nos dias 4 e 7. Interações positivas são identificadas pelo crescimento e azul cor das colônias fúngicas e podem ser determinadas manualmente, ou pode ser determinado usando software de análise de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma tela independente ...

Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.
Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (figura 1A). Em métodos TF-centrado, um TF de interesse é sondada para ligação para regiões de DNA genômicas ou para determinar a sua especificidade de ligação do DNA. Estes métodos incluem imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alta produtividade, microarrays de ligação da proteína e SELEX4,5,6. Em métodos centrado no DNA, uma sequência de DNA de interesse é analisada para determinar o conjunto de TFs que ligam para a sequência do DNA. A mais amplamente aplicada de tais métodos é fermento um híbrido (Y1H) os ensaios, no quais as interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando o repórter genes7,8,9.
Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (por exemplo, promotores, melhoradores, silenciadores, etc) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para repórter gene ativação9,10 (figura 1B). A isca de ADN clonada montante de repórter dois genes (LacZ e HIS3) e ambas as construções do DNA-bait::reporter estão integradas no genoma da levedura para gerar chromatinized 'linhagens de DNA-isca'. A TF-presa, codificada em um plasmídeo que expressa um TF fundido-se ao domínio de ativação (AD) da levedura Gal4 TF, é introduzida a estirpe de DNA-isca para pescar interações TF-DNA. Se o TF-rapina vincula-se à sequência de DNA-isca, o anúncio presente na rapina TF levará para a ativação de ambos os genes repórter. Como resultado, as células com uma interação positiva podem ser selecionadas para o crescimento em placas faltando histidina, bem como a superação de um inibidor competitivo, 3-Amino-1, 2,4-triazole (3-a) e visualizadas como colônias azuis na presença de X-gal. Porque o fermento potente Gal4 AD é usado, os ensaios de Y1H podem detectar interações envolvendo ativadores transcricionais, bem como repressores. Além disso, dado que TF-presas são expressos de um promotor forte de fermento (ADH1), interações podem ser detectadas mesmo para TFs com níveis de baixa expressão endógena, que são um desafio para detectar por ChIP11,12.
Mais protocolos publicados para a realização de ensaios de Y1H são baseados em introduzir as cepas de leveduras DNA-isca TF-presas, transformando-se em pool TF-rapina bibliotecas, seguidas por seleção, colônia escolhendo e sequenciamento para identificar o TF interagindo, ou por transformação individual clones8,9. Estes são protocolos demorados, limitando o número de sequências de DNA que podem ser testados por pesquisador. Uma recente melhoria dos ensaios de Y1H, chamado enhanced Y1H (eY1H), aumentou drasticamente a taxa de transferência de rastreio usando uma plataforma robótica de matriz (HDA) de alta densidade para acasalar cepas de leveduras DNA-isca com uma coleção de cepas de leveduras, cada uma expressando uma diferente TF-rapina10,13 (Figura 1). Estas telas empregam uma 1.536 colônia formato permitindo testar TFs mais humano em quadriplicado usando apenas três pratos. Além disso, dado que as interações TF-DNA são testadas de forma emparelhada, esta abordagem permite comparando interações entre DNA-iscas (como duas variantes de nucleotídeo único não-codificante) e entre diferente TFs ou variantes TF11,12 ,14.
Utilizando ensaios de eY1H, foram delineados os humanos maiores e Caenorhabditis elegans TF centrado no DNA-DNA interações redes até à data. Em particular, nós identificamos 2.230 interações entre 246 potenciadores do desenvolvimento humanos e 283 TFs12. Além disso, nós empregamos eY1H ensaios para descobrir a ligação de TF alterada para 109 variantes não-codificante de nucleotídeo único associados a doenças genéticas como a malformação do desenvolvimento, câncer e doenças neurológicas. Mais recentemente, nós costumávamos eY1H delinear uma rede composta por 21.714 interações entre 2.576 promotores de genes de c. elegans e 366 TFs11. Esta rede foi fundamental para desvendar o papel funcional de dezenas de c. elegans TFs.
Os protocolos para gerar manchas de DNA-isca e avaliar os níveis de atividade de repórter de fundo tem sido relatado em outro lugar15,16,17. Aqui, descrevemos um pipeline de eY1H que pode ser usado para qualquer região de DNA genômico humano contra uma matriz de 1.086 TFs humana de tela. Uma vez que uma estirpe de DNA-isca de levedura é gerada e uma matriz de TF-presa está manchado nas chapas de correspondente, o protocolo inteiro pode ser executado em duas semanas (tabela 1). Mais importante, o protocolo pode ser colocado em paralelo para que um único pesquisador pode tela 60 sequências de DNA-isca simultaneamente. Para demonstrar o protocolo, nós selecionados promotores do cytokine os genes CCL15 e IL17F. Além disso, mostramos resultados de falhadas telas para ilustrar os tipos de problemas que possam surgir durante a execução de ensaios de eY1H e como solucioná-los.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Inibidor competitivo para produtos do gene HIS3</td></tr><tr><td>Sulfato de adenina (hemissulfato), di-hidratado</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Necessário para o crescimento adequado da levedura</td></tr><tr><td>Ágar Alta Força do Gel - Grau bacteriológico</td><td>American International</td><td>Chemical AGHGUP</td><td>Meios nutritivos para o crescimento da levedura</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Fonte de nitrogênio em meio de levedura sintética</td></tr><tr><td>D+ Glicose Anidra</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Necessário para o crescimento de levedura</td></tr><tr><td>Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp e Uracil, rico em adenina sem base de nitrogênio de levedura</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Mídia sintética completa necessária para a borda de crescimento de levedura</td></tr><tr><td>Medidor de pH multiparâmetro</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Para medir o pH de meios</td></tr><tr><td>seletivos Palitos de Dente Planos 750 ct</td><td>Diamante</td><td></td><td>Para estriar leveduras em petrídeos</td></tr><tr><td>Contas de Vidro</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Para espalhar leveduras ao fazer gramados</td></tr><tr><td>Glicerol &ge; 99%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Necessário para fazer estoques de levedura congelados</td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td></td><td>Sigma T-0254</td><td>Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo</td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamida</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Para fazer solução X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Para dispensar volumes precisos de mídia em placas Singer</td></tr><tr><td>Peptone, Bacteriological</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Fonte de proteína necessária para o crescimento de levedura</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Para o cultivo de iscas de levedura para triagem</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Para fazer placas de ágar retangulares para usar com a</td></tr><tr><td>Incubadora Refrigerada BOD de Baixa Temperatura Singer Robot Precision</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Para incubar placas de levedura a temperatura constante</td></tr><tr><td>RePads 1.536 curtos</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Para transferir a matriz de presas TF, levedura mate e levedura de transferência para placas de seleção e leitura diplóides</td></tr><tr><td>RePads 384 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Para transferir matriz TF-prey de 384 para 1.536 formato de colônia</td></tr><tr><td>RePads 96 long</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>Para transferir matriz TF-prey do estoque de glicerol para a placa de ágar</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Para transferir TF-prey array de 96 para 384 formato de colônia</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR robot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Para transferir levedura de maneira de alto rendimento</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (Pellets/ACS Certificado)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Para ajustar o pH de meios seletivos</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio dibásico heptahidratado</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Necessário para atividade de repórter LacZ em X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Necessário para atividade de repórter LacZ em X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopyranoside)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galactosidase torna-se incolor X-gal azul para detectar interação proteína-DNA</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Meio nutritivo para crescimento e propagação de levedura</td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura (pó) sem AA, carboidrato e sem AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Necessário para o crescimento vigoroso de leveduras</td></tr></tbody></table>

telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de dna humano

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.

Três fatores principais devem ser considerados ao analisar resultados de ensaios de eY1H: a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca, a força da atividade repórter correspondente a interações TF-DNA e o número de colônias positivas. A atividade de repórter de fundo (i.e., autoactivity) da estirpe DNA-isca refere-se ao crescimento global e cor das colônias na placa de leitura, mesmo na ausência de um TF-rapina fermento. Idealmente, as estirpes não-autoactive mostram uma fundo branco ou claro cor marrom,...

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

O objetivo de ensaios de leveduras um híbrido aprimorados é identificar o conjunto de fatores de transcrição que se ligam a uma sequência de DNA de interesse. A vantagem desta técnica é que ensaios de leveduras um híbrido aprimorados podem avaliar mais de 1000 fatores de transcrição em um único experimento. Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina avalia apenas um fator de transcrição por vez.Este método constitui uma ferramenta-chave para a genômica funcional para identificar o repertório de fatores de transcrição que se ligam a promotores e intensificadores genéticos e identificar fator de transcrição alterado vinculando-se a variantes não codificadoras. Demonstrando o procedimento será o Dr. Xing Liu um pós-doutor do meu laboratório. Descongele as placas de estoque de glicerol de levedura com a matriz de presas TF no gelo.Resuspenha a levedura usando uma pipeta de 12 canais e prossiga para o próximo passo dentro de 1 a 3 minutos. Para detectar o fermento em placas retangulares de sc menos triptofano, use um robô de matriz de alta densidade para selecionar placas multiwell 96 como a fonte, 96 placas de ágar como o alvo e 96 almofadas de pinos longos. As almofadas de pinos não são reutilizáveis e devem ser descartadas.Selecione o programa Spot Many para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar a contaminação dos estoques congelados. Além disso, selecione a opção de girar para cima e para baixo na fonte para misturar o fermento.Siga as instruções de onde e quando colocar as placas e deixe que o robô localmente a levedura em Sc menos placas retangulares do triptofano. Ensace a matriz manchada e incuba-a lateral de ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Para gerar 384 matrizes de colônia em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placas de ágar como alvo e 96 almofadas de pinos curtos.Em seguida, selecione o programa de 1:4 array single source. Desta forma, quatro 96 placas de colônia serão consolidadas em uma placa de 384 colônias. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar contaminação entre diferentes placas.Ensace as placas e incuba o conjunto de ágar 384 colônias a 30 graus Celsius por 2 dias. Para gerar 1536 matrizes de colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de ágar 1536 como alvo e 384 almofadas de pinos curtos. Em seguida, selecione o programa de 1:4 ensaio único de origem.O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicatos. Use as opções de reciclagem e revisitar, pois isso envolve copiar cada colônia 4 vezes. Siga as instruções do robô e permita que o robô localmente o fermento nas placas antes de ensacar e incubar o lado ágar da matriz de 1536 colônias a 30 graus Celsius por 3 dias.Para amplificar a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares triptofano, selecione 1536 placas de ágar como fonte, 1536 placas de ágar como alvo e 1536 almofadas de pinos curtos. Selecione o programa Replicar Muitos para replicar de 3 a 4 cópias. Use a opção reciclar e revisitar, mas jogue fora a almofada ao mudar para uma placa diferente da matriz para evitar contaminação cruzada.Permita que o robô amplie a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano. Finalmente, ensace as placas e incuba o agar da matriz de 1536 avistados até 30 graus Celsius durante 3 dias para usar em etapas de acasalamento. Para preparar os gramados da isca de DNA para acasalamento, localmente as iscas de levedura de DNA em uma placa sc menos uracil e histidina e crescer por 3 dias a 30 graus Celsius.Coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe de 12 a 16 cepas diferentes. Incubar a placa um dia a 30 graus Celsius. No dia seguinte, coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe em 4 cepas diferentes.Incubar a placa por um dia a 30 graus Celsius. Após a incubação, raspe a levedura usando um palito estéril, certificando-se de não raspar nenhum ágar. Adicione o fermento em um tubo de 1,5 mililitro com 500 microliters de água estéril.Agora adicione 10 a 15 contas de vidro estéreis e a suspensão da levedura em uma placa retangular YAPD. Agite bem em todas as direções por um minuto para garantir que o fermento esteja espalhado por toda a placa. Inverta a placa imediatamente, e bata para que as contas vão para a tampa.Remova e recicle as contas. Ensace as placas e incuba-as lado do ágar para baixo por 1 a 2 dias a 30 graus Celsius. Então, vá para a etapa de acasalamento.Para acasalar a isca de DNA de levedura e as cepas de matriz TF, transfira a matriz TF para uma placa retangular YAPD com o robô. Selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo, e a almofada de pino curto de 1536. Selecione o programa Replicar Muitos.Selecione 4 placas de origem e as opções de reciclagem e revisite. Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir de 3 a 4 placas YAPD. As placas de matriz TF usadas para acasalar devem ter de 2 a 3 dias, mas não mais, pois o acasalamento pode ser ineficiente.Para transferir o gramado de uma isca de DNA para as placas yapd já contendo o array TF, selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar Muitos. Use um deslocamento aleatório na fonte com um raio de aproximadamente 0,6 milímetros para evitar tomar levedura do mesmo local e selecione Mix no Alvo para facilitar o contato entre as cepas de leveduras.Use o gramado contendo as iscas de DNA como fonte, e as placas yapd contendo a matriz TF manchada como o alvo antes de ensacar as placas e incubar-as lado ágar até 30 graus Celsius por um dia. Para seleção de levedura diploide, selecione a placa de 1536 ágar como a fonte e o alvo e selecione a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar.Selecione Mix na Fonte e no Alvo. Permita que o robô transfira o fermento acasalado das placas yapd para as placas sc menos uracil e triptofano antes de ensacar as placas e incubar-as do lado ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Agora, selecione as placas de 1536 ágar como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536.Selecione o programa Replicar. Transfira a levedura diploide das placas Sc menos uracil e triptofano para a leitura retangular 3-AT e X-gal contendo placas usando o robô. Ensace as placas e incuba-as lateral até 30 graus Celsius por até 7 dias.Para iscas de DNA com atividade de repórter de fundo alto, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos nos dias 4 e 7. Mantenha as placas de matriz TF em temperatura ambiente e copie novamente após 7 dias para uma nova rodada de triagem.Para ilustrar o tipo de resultados que podem ser obtidos usando ensaios de leveduras uni-híbridos aprimorados, as regiões promotoras dos genes CCL15 e IL17F foram rastreadas contra uma matriz de 1086 TFs humanos. O promotor CCL15 é um exemplo de uma isca de DNA não autoativa, onde as interações, mesmo as fracas, podem ser facilmente detectadas. O promotor do IL17F é um exemplo de uma isca de DNA autoativa com atividade de repórter de fundo desigual onde algumas interações podem ser detectadas, enquanto para vários TFs, é incerto se a atividade do repórter é maior do que o fundo.Existem vários problemas que podem ocorrer ao realizar ensaios de leveduras um-híbrido aprimorados. Neste caso, as colônias são muito pequenas e não conseguiram se transferir. Normalmente, aproximadamente 95% das colônias de presas TF apresentam crescimento normal.Neste exemplo, não há crescimento de levedura em uma porção da placa. Esta questão está geralmente relacionada a uma falha na etapa de acasalamento se a almofada de pino 1536 não fizer contato com o fermento no gramado da isca de DNA, na matriz TF, ou na placa de acasalamento. Nestes dois exemplos, não são detectadas interações.Esta questão está frequentemente relacionada a mutações inativas não intencionais nos genes repórteres, em particular LacZ, ou autoatividade muito alta que mascaram interações. Neste caso, a placa apresenta manchas azuis aleatórias que muitas vezes estão relacionadas à contaminação bacteriana. A coisa mais importante a considerar é a preparação adequada da placa.Certificando-se de que todos os componentes são adicionados e que a altura do ágar é uniforme, pois todas as etapas subsequentes dependem disso. Embora a maioria dos reagentes não sejam perigosos, é importante usar luvas o tempo todo para evitar a contaminação das amostras e placas. Como em qualquer ensaio de ligação de DNA, é importante validar as interações identificadas usando ensaios funcionais como ensaios de repórteres, knockdown de fator de transcrição ou nocaute, seguido pela expressão de medição do gene alvo.Este método permitiu a identificação de fatores de transcrição que regulam genes envolvidos em processos biológicos particulares, bem como fatores de transcrição com vinculação alternativa a variantes não codificadas associadas a doenças.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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