Name: Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo ortotópico murino de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço em ratos. Este método permite estudar o microambiente tumoral e resistência ao tratamento com manifestações clínicas semelhantes às humanas.

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Todos os procedimentos de animais foram efectuados de acordo com um institucional animal cuidados e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado da Universidade de Colorado Denver (protocolo # 00250).
1. cultura de células de tumor
Nota: Linhas de células B4B8 e LY2 foram usadas para gerar tumores HNSCC ortotópico: B4B8 células de tumor foram derivadas de queratinócitos da mucosa cancerígena-transformadas (a partir de camundongos BALB/C)11. As células do tumor LY2 foram derivadas do linfonodo metástase de um queratinócito BALB/C espontaneamente transformado linha (Pam 212)12,13. Ambas as linhas de célula foram gentilmente cedidas pelo Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
<ol><li>Uso Dulbecco modificado, F/12 médio (DMEM da águia) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e reagente antimicrobiana de 1% para a manutenção de linha celular. Manter estas linhas de célula em uma incubadora estéril em 37 ° C e 5% de CO2. Células devem ser usadas para inoculação antes superior a 15 passagens.</li>
	<li>Placa de 2 x 106 a 4 x 106 células em frascos de cultura de células de2 175 cm. Nota: Garantir que as células são menos de 90% confluente para evitar induzir uma resposta ao estresse.</li>
	<li>Quando as células são 70% confluente (~ 48 h), retire o balão da incubadora e lavar as células 3 x com frio fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Separe as células do recipiente utilizando tripsina 0,25%, suficiente para cobrir a superfície da placa.<ol>
<li>Para fazer isso, dispense 4 mL de tripsina num balão de2 175 cm contendo 70% confluentes. Incube as celulas com tripsina por 3 – 4 min na incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Visualize as células sob um microscópio para garantir o desprendimento de células.</li>
		<li>Adicione 12 mL de DMEM F/12 mídia contendo FBS para neutralizar a atividade da tripsina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar a suspensão de eritrócitos e colocá-lo em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Agitar o tubo contendo as células invertendo-3 x-4 x.</li>
	<li>Opcionalmente, uma alíquota de 10 µ l da suspensão de células se misturam com 10 µ l de Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora e contar as células usando um hemocytometer. Determinar a viabilidade celular subtraindo-se o número de células Trypan azul-positivo do número total de células e divida pelo número total de células.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em DMEM livre de soro e antibiótico em um volume adequado para que 1 x 106 células estão presentes em 50 µ l de mídia. Nota: Baseia a agressividade de linha de células in vivo (determinada empiricamente), 1 x 106 células por injecção por rato foi considerada adequada para células B4B8 e LY2.</li>
	<li>Coloque o frasco contendo a suspensão de células no gelo.</li>
	<li>Coloque a matriz previamente descongelado membrana basal no gelo. Nota: A matriz da membrana basal foi descongelada durante a noite a 4 ° C.</li>
</ol>2. célula de injeção em ratos
<ol><li>Prepare uma mistura de 1:1 da matriz de membrana de células: cave (50 µ l cada).</li>
	<li>Adicionar as células primeiro; Então, gradualmente Pipete a matriz da membrana basal. Evite a introdução de bolhas de ar. Certifique-se de que a mistura é feita imediatamente antes da injeção de animais. Adicionar células à matriz da membrana basal por um longo período de tempo pode resultar em célula, fixando-se na mistura de matriz, o que dificulta a mistura a tremer com rigor. Isso fará com que uma considerável variabilidade no tamanho do tumor entre ratos.</li>
	<li>Misture suavemente. Certifique-se de todas as etapas que envolvem a matriz são executadas no gelo. Membrana basal matriz irá polimerizar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare as seringas para inoculação.</li>
	<li>Carrega seringas de insulina 0,5 mL (23 G) com 100 µ l da solução de matriz de membrana celular/porão.</li>
	<li>Mantenha as seringas no gelo para evitar a polimerização de matriz de membrana basal.</li>
	<li>ANESTHETIZE ratos, colocando-os em uma câmara com isoflurano e oxigênio (2,5%).</li>
	<li>Assegure que os ratos são anestesiados profundamente antes de executar a injeção (garantindo uma falta de resposta a uma pitada de dedo do pé).</li>
	<li>Insira a agulha na região bucal da direita ou esquerda. Isto é realizado através dos espaços disponíveis em ambos os lados da boca.</li>
	<li>Certifique-se de que a língua do rato não é da forma. Nota: É fácil de arrancar a língua, o que resultará em tumores de língua. Mova a língua para o lado oposto, se necessário.</li>
	<li>Manter a seringa paralela à região bucal enquanto dentro da cavidade oral.</li>
	<li>Quando estiver pronto para injetar, retirar a seringa e introduza lentamente a seringa em um ângulo de 10°.</li>
	<li>Injetar 100 µ l de suspensão de matriz de membrana celular/porão durante um período de 5 s.</li>
	<li>Segurar a seringa no lugar por um adicional de 5 s para garantir todo o material é injetado. Nota: Para os ratos nontumor-rolamento de controle, injete uma mistura de mídia livre de soro e matriz (como descrito acima) sem as células do tumor.</li>
	<li>Retire a seringa com cuidado.</li>
	<li>Continue o procedimento acima com os ratos restantes.</li>
	<li>Permitir a 1 semana até tumores começam a aparecer grosseiramente (50 – 200 mm3 para células B4B8 e LY2).</li>
</ol>3. Mouse monitoramento
<ol><li>Realize a primeira medição usando pinças em 1 semana após a injeção de células de tumor. Para calcular o volume do tumor utilizando pinças externas, determinar o maior diâmetro longitudinal (comprimento) e o maior diâmetro transversal (largura) e usar a fórmula elipsoidal modificados14,15. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59195/59195eq1.jpg">
</li>
	<li>Continue a realizar medições paquímetro regular para o volume do tumor (x-2 1x por semana em intervalos regulares).</li>
	<li>Medir peso animal para avaliar os efeitos do crescimento do tumor na alimentação.</li>
</ol>4. colheita de tumores
<ol><li>Quando é alcançado o ponto de extremidade experimental, eutanásia dos animais usando medidas adequadas (por exemplo, CO2 asfixia, decapitação ou deslocamento cervical). Nota: Neste estudo, o ponto de extremidade foi alcançado se os ratos tornou-se moribundo (com perda de peso &gt; 15% de seu peso inicial, a falta de higiene, caquexia) e/ou se o tamanho do tumor chegou a 1.000 mm3.</li>
	<li>
Começa dissecando o animal através da criação de uma incisão longa através da linha mediana da região do pescoço.
	<ol>
<li>Use fórceps contundente para agarrar a pele e afiadas tesouras para cortar a pele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insira uma tesoura suavemente sob a pele que cobre o tumor e criar bolsões de ar empurrando a tesoura do outro lado e na pele.</li>
	<li>Uma vez que a pele é suficientemente separada do tumor, identificar os drenagem dos gânglios linfáticos (DLNs) e impostos especiais de consumo-los para evitar que o tecido do tumor confundido pela presença de gânglios linfáticos. Nota: Tumores grandes podem atingir e/ou cobrir o DLN. Dependendo do tipo de ensaio a ser realizado, o isolamento dos linfonodos intactos é essencial para evitar derrames de células do sistema imunológico para o tumor, o que resultará em distorcer os resultados do ensaio.</li>
	<li>Atravessa as fronteiras do tumor até que todo o volume se desprenda.</li>
</ol>5. tumor de processamento para aplicações a jusante
<ol><li>Para o exame histológico a jusante, coloque tumores em formol a 10% em temperatura ambiente. Para evitar overfixation, substitua o formol com etanol a 70%. Para análise de citometria de fluxo, processa os tumores conforme descrito abaixo. Nota: O tecido pode ser mantido em formol para 72 h antes de overfixation pode se tornar problemático para certos tipos de coloração.</li>
	<li>Corte o tumor em 1-2 mm-tamanho pedaços usando um estéril de lâmina de barbear ou tesoura afiada.</li>
	<li>Coloque as peças do corte do tumor em um tubo cónico de 50 mL com colagenase III (4.250 unidades por exemplo), DNase I (0,1 mg por exemplo) e inibidor de tripsina (1 mg por exemplo).</li>
	<li>Incube a 37 ° C por 30 min com agitação a cada 10 min. Nota: As amostras podem ser colocadas em um saco resealable, esterilizado com 90% de etanol e colocado em uma incubadora de cultura de células.</li>
	<li>Depois de 30 min, adicione 20 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS) e a centrifugação a 300 x g por 5 min. Nota: HBSS é composto de cloreto de potássio, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico e glicose.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2-3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Pipete rigorosamente. Nota: Tampão de Lise RBC é composto de cloreto de amônio, bicarbonato de sódio e dissódico.</li>
	<li>Incube durante 2 min à temperatura ambiente. Nota: Incubação mais longa pode ser tóxica para outras populações de células.</li>
	<li>Adicione 20 mL de HBSS para neutralizar o efeito de Lise.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS.</li>
	<li>Transferir a solução através de uma retenção de nylon 70 µm e centrifugar x g por 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas de 5.8 – 5.10 e passar a suspensão de células através de uma retenção de nylon de 40 µm para garantir a que remoção de quaisquer resíduos adicionais da suspensão.</li>
</ol>6. célula coloração e aquisição de dados
<ol><li>Ressuspender as células em 1 mL de HBSS.</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada, conforme descrito na etapa 1.7</li>
	<li>
Determine o número total de células e a concentração adequada para a coloração. Nota: a concentração de célula ideal para coloração de citometria de fluxo é de 1 milhão de células. Por exemplo, se a mancha é executada em uma placa de 96 poços e existem 10 milhões de células, resuspenda a amostra em 1 mL e placa 100 µ l para 1 milhão de células por poço.</li>
	<li>
Adicione o bloco Fc (CD16/CD32) na concentração de 1: 100 a fim de impedir a ligação de nonantigen específicas das imunoglobulinas aos receptores FcγIII e FcγII. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Centrifugue e resuspenda o pellet de células em 100 µ l de pilha de citometria de fluxo tampão de coloração (composto contendo 5% FBS, EDTA de 2% e 1% de solução salina HEPES).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Execute a superfície celular, coloração de acordo com instruções fornecido pelo fornecedor (adicionando cada anticorpo na diluição adequada). Incube durante 60 min à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Centrifugue e ressuspender as células em 100 µ l de HBSS. Repita 2x para se livrar de anticorpo em excesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Execute amostras em um citômetro de fluxo apropriado.
	<ol>
<li>Se analisar marcadores intracelulares (por exemplo, foxp3), realize permeabilização celular e coloração de acordo com as instruções do fornecedor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bonner, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+cetuximab+for+locoregionally+advanced+head+and+neck+cancer%3A+5-year+survival+data+from+a+phase+3+randomised+trial%2C+and+relation+between+cetuximab-induced+rash+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival.</a> The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+EphB4-Ephrin-B2+Signaling+Enhances+Response+to+Cetuximab-Radiation+Therapy+in+Head+and+Neck+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+radiosensitization+in+EphB4+receptor-expressing+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 6, 38792(2016).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+radiation+and+immunotherapy%3A+a+new+systemic+therapy+for+solid+tumors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?</a> Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).</li>
<li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+radiotherapy+and+PD-L1+blockade+is+mediated+by+TIM-3+upregulation+and+regulatory+T-cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma análise rigorosa e caracterização do microambiente do tumor representam uma importante estratégia para os mecanismos de compreensão do desenvolvimento do tumor, progressão e metástases e para o desenvolvimento de terapias eficazes. Câncer de cabeça e pescoço é uma doença complexa que pode originar-se de vários locais anatômicos dentro da região de cabeça e pescoço. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de células de rato murino que se asseme...

HNSCC é a quinto mais comum malignidade globalmente, com mais de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. Apesar do tratamento agressivo, envolvendo quimioterapia e radioterapia (RT), a taxa global de sobrevivência (OS) para pacientes com HNSCC sem infecção pelo papilomavírus humano (HPV) continua a ser inferior a 50% após 5 anos2. Isto é atribuído em grande parte para um microambiente do tumor altamente complexo como tumores podem se originar de vários sítios anatômicos distintos dentro da região de cabeça e pescoço, incluindo a mucosa bucal, língua, assoalho da boca, cavidade nasal, cavidade oral, faringe, orofaringe e hipofaringe. Além disso, a região da cabeça e pescoço é altamente vascularizada e contém quase a metade de todos os nós de linfa no corpo3. A maioria dos estudos investigando a biologia de tumor de cabeça e pescoço contam com modelos de tumor na região do flanco. Tais modelos podem oferecer insights sobre mecanismos intrínsecos tumor, mas a falta do microambiente nativo de cabeça e pescoço pode ter impacto significativamente o potencial translacional de tais achados. Um método que tem sido usado para induzir tumores orais é através da exposição ao carcinógeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. No entanto, este método está associado com um processo demorado, induz tumores em ratos e hamsters, mas não em ratos, e os tumores resultantes não possuem muitas das características histológicas de diferenciada SCCs5,6. A introdução do carcinogen4-nitroquinoleína 1-óxido (4-NQO), um derivado hidrossolúvel quinolona, resultou em tumores orais do rato quando aplicado por via oral, mas também sofria de longos tempos de exposição (16 semanas) e um número limitado tomar taxa dentro e entre lotes de ratos7,8,9. A fim de desenvolver modelos clinicamente relevantes, vários grupos utilizaram modelos geneticamente modificados, que envolve a manipulação dos oncogenes motorista ou genes supressores de tumor, incluindo TP53, TGFB, KRAS, HRAS e SMAD410. Estes modelos podem oferecer insights sobre tumores com genes de motorista conhecido mas não recapitular a complexa heterogeneidade da HNSCCs humanas.
Neste trabalho, vamos demonstrar a viabilidade de realizar uma intramucosal inoculação de células de carcinoma de células escamosas em camundongos. Células inoculadas se desenvolvem em tumores agressivos dentro de 1 semana da injeção. Semelhante a HNSCCs humanas, os tumores metastatizam para os linfonodos regionais. Podemos caracterizar características clínicas e histológicas da doença e fornecer insights sobre o microambiente imune do tumor. Propomos que este modelo ortotópico de HNSCC tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e estudos pré-clínicos. Mecanismos de evasão imune, progressão do tumor, metástases e resistência de tratamento representam áreas de significância clínica que podem ser abordados usando o modelo proposto.

<table><tbody><tr><td>Colagenase III</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS004183</tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS006328</tr><tr><td>Bloco Fc (CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>&nbsp; Clone 2.4G2&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175079</td><td>sem cálcio, sem magnésio, sem feno vermelho</td></tr><tr><td>Helois citômetro de massa</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana</td><td>Matrigel Corning&nbsp;</td><td>CB-40234B</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de ressonância magnética</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>7.4 Tesla</td></tr><tr><td>RBC tampão de lise</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de tripsina</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002830</tr></tbody></table>

intramucosal inoculação de células de carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de tumor e tratamento avaliação de resposta

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é uma doença debilitante e mortal com uma elevada prevalência de recidiva e falha do tratamento. Para desenvolver melhor estratégias terapêuticas, compreensão tumor microenvironmental fatores que contribuem para a resistência de tratamento é importante. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de celulares murino que se assemelham a natureza agressiva e metastática da HNSCCs humanas. Além disso, a maioria dos modelos murino empregar implantes subcutâneos de tumores que não possuem características fisiológicas importantes da região da cabeça e pescoço, incluindo alta densidade vascular e extensa vascularização linfática residente flora da mucosa. O objetivo deste estudo é desenvolver e caracterizar um modelo ortotópico de HNSCC. Nós empregamos duas linhas de células geneticamente distintas de murino e tumores estabelecidas na mucosa bucal de ratos. Otimizamos a métodos de digestão tumor colagenase-baseado para a recuperação ideal de células únicas de tumores estabelecidas. Os dados aqui apresentados mostram que ratos desenvolvem tumores altamente vascularizados que metastatizam para linfonodos regionais. Análise de citometria de massa Multiparamétrico monocelulares mostra a presença de diversas populações imunes com células mieloides, que representa a maioria de todas as células do sistema imunológico. O modelo proposto neste estudo tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e desenvolvimento pré-clínico da novela terapêutica. A semelhança do modelo ortotópico para características clínicas da doença humana irá fornecer uma ferramenta para tradução melhorada e melhorou os resultados dos pacientes.

A avaliação in vitro da proliferação celular de LY2 e B4B8 mostrou que ambas as linhas de célula têm tempos de duplicação similares (21h e 23h, respectivamente). In vivo, ambas as linhas de célula formaram uma massa única, visível e palpável dentro de 1 semana de inoculação (figura 1A). Em camundongos com tumores LY2, o maxilar foi deslocado por 3 semanas devido a carga do tumor (figura 1A). Ratos de controle que não recebeu célu...

Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Os cânceres da região da cabeça e pescoço estão se tornando cada vez mais prevalentes. No entanto, há uma compreensão limitada do microambiente tumoral e dos mecanismos de resistência ao tratamento nesta região. Esta técnica pode ser usada para recapitular o microambiente nativo de tumores de cabeça/pescoço de forma acessível e produz manifestações clínicas semelhantes às vistas em humanos.Quando a cultura das células tumorais atingir 70% de confluência, lave as células três vezes com PBS frio por lavagem e conecte as células com 0,25% de trippsina suficiente para cobrir a superfície inferior do frasco de cultura. Após três a quatro minutos na incubadora de cultura celular, confirme o desprendimento sob um microscópio leve e neutralize a trippsina com 12 mililitros de meio DMEM F12, suplementado com soro bovino fetal. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e misture as células três a quatro vezes por inversão.Em seguida, colete as células por centrifugação e suspenda novamente a pelota em DMEM sem soro e antibióticos em uma única vez 10 a sexta células tumorais por 50 microliters de concentração média no gelo. Imediatamente antes da injeção, misture as células em uma suspensão de células tumorais de um a um com a relação de matriz de membrana no gelo. Carregue uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 23 com 100 microliters de células por animal receptor.Coloque as seringas no gelo e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato anestesiado. Em seguida, insira a agulha na região bucal direita ou esquerda através do espaço aberto disponível em ambos os lados da boca mantendo a seringa paralela à região bucal enquanto ela está dentro da cavidade oral para facilitar a injeção do volume total de 100 microliter da suspensão da matriz da membrana do porão celular durante um período de cinco segundos. Mantenha a seringa no lugar por mais cinco segundos para garantir que todo o material tenha sido injetado antes de retirar a seringa suavemente.Os tumores se tornarão grosseiramente visíveis em cerca de uma semana. Uma semana após a injeção, use pinças para medir o comprimento e largura de cada tumor para determinar o volume do tumor de uma a duas vezes por semana. E medir o peso de cada animal para avaliar os efeitos do crescimento do tumor na alimentação.No ponto final experimental apropriado, use tesouras afiadas e fórceps contundentes para fazer uma incisão da pele através da linha média no pescoço. E insira a tesoura suavemente sob a pele cobrindo o tumor para criar bolsões de ar empurrando a tesoura através e para dentro da pele. Uma vez que a pele esteja suficientemente afastada do tumor, extiride os linfonodos drenantes para evitar que o tecido tumoral seja confundido pela presença de tecido linfático e corte as bordas do tumor até que todo o volume seja desconectado.Para processar o tumor para análise a jusante, corte o tumor em pedaços de tamanho de um a dois milímetros e coloque os pedaços em um tubo cônico de 50 mililitros contendo colagenase três, DNAs um e inibidor de trippsina. Depois de incubar as peças tumorais a 37 graus Celsius por 30 minutos, com agitação a cada 10 minutos, adicione 20 mililitros de HBSS ao tubo e passe a suspensão contendo as peças tumorais através de um filtro de nylon de 70 micrômetros. Use um êmbolo de seringa de cinco mililitros para amassar as peças tumorais no coador e adicionar mais 10 mililitros de HBSS através do coador.Gire as células por centrifugação. Suspenda a pelota em dois a três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos com tubulação rigorosa, neutralizando a lise com 20 mililitros de HBSS frescos após dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente as células em um adicional de 20 mililitros de HBSS para outra centrifugação e coe as células através de um filtro de derramamento de 40 micrômetros para remover quaisquer detritos finais da suspensão da célula tumoral.Os tumores LY2 crescem em uma taxa maior, em comparação com os tumores B4B8. E camundongos que exibem deslocamento da mandíbula rapidamente desenvolvem perda de peso, devido à disfagia. A sobrevida mediana em camundongos LY2 também é menos da metade do observado para camundongos portadores de tumor B4B8.A ressonância magnética de camundongos portadores de tumores mostra tumores bem demarcados que se estendem até a camada interna da mucosa bucal, mas não na língua ou em outros órgãos próximos. O exame histológico indica que todos os camundongos portadores de tumor LY2 desenvolvem carcinoma de células escamosas pouco diferenciados, enquanto os camundongos com tumores B4B8 desenvolvem carcinoma celular escamoso moderadamente diferenciado. Todos os camundongos portadores de tumor LY2 também têm necrose histologicamente confirmada, com a maioria demonstrando necrose moderada a grave.Neste experimento representativo, um tumor LY2 foi colhido e processado três semanas após a injeção de células tumorais da região bucal, como demonstrado. As células imunes cd45 positivas representaram 7,3% da população total de células tumorais. As células mielóides mielóides positivos do CD11b representaram 37,8% de todas as células CD45 positivas, a maioria das quais foram determinadas como macrófagos f480 positivos, com pequenas populações de neutrófilos e células supressoras derivadas de mielóide também observadas.As células T constituíam 15,9% da população de células imunes CD45 positivas, das quais 53,4% eram células T reguladoras de CD4 positivos FoxP3. As células assassinas naturais compunham menos de 2% de todas as células CD45 positivas. É importante praticar a injeção para desenvolver confiança e conforto na retenção da agulha e do rato receptor e na exposição da boca do animal.Uma vez realizado o procedimento, experimentos envolvendo a avaliação da resposta tumoral à terapia ou avaliação dos fatores intrínsecos e microambientais do tumor podem ser realizados. Esta técnica abriu caminho na concepção de um ensaio clínico iniciado por pesquisadores, avaliando os efeitos da combinação da radioterapia com a terapia anti-PL1 em pacientes com câncer de cabeça e pescoço.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Neste vídeo, desenvolvemos um modelo murino ortotópico de câncer de cabeça e pescoço por inoculação intramucosa da linhagem celular de carcinoma de células escamosas. O camundongo portador de tumor mostraria semelhança com sintomas clinicamente relevantes de doenças humanas e, portanto, pode ser usado para estudar a progressão do câncer e descobrir novas estratégias terapêuticas.

Inoculação intramucosa de células cancerígenas em modelo murino: um procedimento para estabelecer um modelo ortotópico de câncer de cabeça e pescoço em camundongos

Este vídeo demonstra um ensaio de vacinação tumoral baseado em células. Um camundongo, injetado por via intradérmica com células de melanoma B16-F10 para formação de tumor, é vacinado com células B16-F10 secretando citocina Flt3L perto do tumor desenvolvido. O Flt3L secretado da vacina promove a maturação e proliferação de células dendríticas que então apresentam antígenos tumorais para células T nos gânglios linfáticos, desencadeando uma resposta imune antitumoral direcionada.

Implantação tumoral e injeção de uma vacina tumoral em um modelo de camundongo

Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Este estudo se concentra na indução subcutânea in vivo de células cancerígenas colorretais luminescentes em um modelo murino e na subsequente medição de luminescência usando um sistema de imagem. O procedimento visa estabelecer um modelo de crescimento tumoral reprodutível para monitoramento em tempo real e avaliação terapêutica.

Injeção subcutânea de células de câncer colorretal humano em camundongos nus atímicos para avaliar a eficácia antitumoral

Um método único para ressecar cirurgicamente tumores de carcinoma escamoso oral estabelecidos na cavidade oral é apresentado aqui.

Modelo de Resseção Tumoral Translacional Relevante para Modelos Pré-clínicos de Múrino de Carcinoma Escamoso Oral

Com o crescente interesse na imunoterapia intratumoral, a seleção de modelos tumorais acessíveis e práticos é essencial. Tumores subcutâneos são fáceis de estabelecer, mas difíceis de visualizar e manipular. Neste protocolo, descrevemos métodos para gerar tumores intradérmicos que proporcionam melhor visibilidade e acessibilidade.

Implantação de Tumores Intradérmicos como Modelo Robusto para Estudos de Imunoterapia Intratumoral do Câncer de Múrino

Aprenda a desenvolver um modelo ortotópico murino de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço em ratos. Este método permite estudar o microambiente tumoral e resistência ao tratamento com manifestações clínicas semelhantes às humanas.

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta (Vídeo) | JoVE Journal

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

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