Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central
15 de agosto de 2019
Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.
Este protocolo detalha o uso de um dispositivo de posicionamento para a entrega intranasal de biomoléculas ao CNS do mouse. O uso deste dispositivo reduz significativamente o manuseio de camundongos e o tempo de tratamento, resultando em melhores eficiências e reprodutibilidade da técnica. Para iniciar este procedimento, avalie o nível de anestesia dos camundongos pelo reflexo do pedal para manter o plano cirúrgico.
Em seguida, coloque o dispositivo de posicionamento a uma distância e altura adequadas para permitir acesso conveniente a todos os reagentes necessários. Em seguida, aplique pomada nos olhos do animal. Amarre um mouse com cintos de cadeira, certificando-se de que os membros dianteiros do mouse forneçam suporte natural enquanto ele estiver em uma posição relaxada sem qualquer desconforto.
Repita os procedimentos para os ratos restantes. Coloque suavemente cada rato na cadeira designada, colocando suas costas paralelas ao apoio traseiro da cadeira e a 90 graus no assento da cadeira. Deixe o animal deitar naturalmente na cabeça para baixo e para a frente posição sem empurrar ou pressionar.
Uma vez que todos os ratos estejam amarrados, inicie imediatamente a inoculação intranasal. Para realizar a entrega intranasal, carregue o micropipette com dois microliters de solução complexa siRNA RVG9R. Segure a pipeta na mão dominante e apoie-a com a outra mão para evitar movimentos descontrolados durante a administração do siRNA.
Coloque cerca de duas gotículas de microliter muito perto de uma narina para que o mouse possa inalá-la diretamente. Se uma pequena gota não for facilmente formada, substitua a ponta da pipeta por uma nova e repita a operação. Empurre suavemente a cabeça do mouse para baixo com o dedo indicador por cinco segundos enquanto ele está inalando e mantendo a posição.
Para evitar a drenagem da droga nos pulmões é importante empurrar sedadamente a cabeça do rato para baixo com o dedo indicador por cinco segundos enquanto o rato está inalando. Inicie um cronômetro para marcar de três a quatro minutos depois disso para cronometrar a inoculação na segunda nare do primeiro mouse. Este intervalo de tempo é necessário para que o rato complete a inalação da primeira dose e restaure a respiração normal.
No intervalo de três a quatro minutos entre a inoculação de nares alternadas no primeiro rato, inoculação intranasal completa de um nare em cada um dos três ratos restantes colocados no dispositivo. Quando o cronômetro soar, inocular a segunda narina no primeiro mouse e repetir o procedimento para os outros ratos como acima. Repita o procedimento até que os 20 a 30 microliters sejam entregues para todos os quatro camundongos.
Levará cerca de 30 a 45 minutos para completar todo o procedimento de inoculação. Devolva os animais de volta às suas gaiolas designadas. Não deixe os camundongos sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa.
Para avaliar o silenciamento genético, extrair RNA de várias regiões cerebrais com um kit de purificação de RNA, transcrição reversa em cDNA usando um kit de síntese cDNA e executar qPCR com pares de primer. A maioria da entrega cerebral do peptídeo RVG9R rotulado com Alexa Fluor 488 foi testada pela primeira vez usando o dispositivo de posicionamento do mouse descrito aqui. Em 48 horas após a inoculação, vários órgãos foram extirpados para medir a fluorescência A488.
Nada foi detectado em nenhum dos órgãos nos controles negativos. Por outro lado, um forte sinal fluorescente A488 foi detectado exclusivamente no cérebro do grupo inoculado RVG9R. Além disso, a posição de colocação do mouse foi comparada com o método de posição supina e o método acordado para eficácia.
Os resultados indicaram que o posicionamento dos camundongos de cabeça para baixo e para frente melhorou a penetração e a deposição do RVG9R A488 em todo o tecido cerebral. Para confirmar ainda mais a entrega do siRNA ao cérebro, o escaneamento cerebral completo foi realizado após uma única administração intranasal de RVG9R complexa ao siRNA rotulado Cy5. Em contraste com PBS ou RVM9R, o complexo com o RVG9R resultou em um forte acúmulo de siRNA nas principais regiões cerebrais, incluindo a lâmpada olfativa, o córtex, o hipocampo, o tálamo, o hipotálamo, o cérebro médio e o cerebelo.
O dispositivo de posicionamento pode ser usado para a entrega de drogas ou moléculas ao mouse CNS. As aplicações se estendem ao teste de terapêutica, bem como ao exame de mecanismos celulares no CNS. Este dispositivo de posicionamento tem sido usado pelos pesquisadores para demonstrar a potência das siRNAs no tratamento da doença do Vírus do Nilo Ocidental, bem como explorar terapias para outras doenças do SNC.
Visão Geral
Este protocolo descreve o uso de um dispositivo de posicionamento de camundongos para a administração intranasal de uma formulação de peptídeo-siRNA direcionada ao cérebro, facilitando o silenciamento gênico eficaz no sistema nervoso central. O método aumenta a eficiência e a reprodutibilidade, ao mesmo tempo que minimiza o manuseio dos camundongos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Terapia Genética
- Entrega Biomolecular
Antecedentes
- A administração intranasal é uma via promissora para terapias direcionadas ao SNC.
- Técnicas eficientes de administração são cruciais para resultados reprodutíveis.
- A posição do camundongo pode influenciar a eficácia da entrega do fármaco.
- O silenciamento gênico por meio de siRNA é uma ferramenta valiosa na pesquisa em neurociência.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo para a entrega eficaz de siRNA por via intranasal ao SNC de camundongos.
- Avaliar o impacto da posição do camundongo na eficiência da entrega do fármaco.
- Demonstrar a utilidade do dispositivo de posicionamento em aplicações de terapia gênica.
Métodos Utilizados
- Avaliação dos níveis de anestesia em camundongos antes do posicionamento.
- Uso de um dispositivo de posicionamento para fixar os camundongos em uma posição relaxada.
- Inoculação intranasal de solução do complexo de siRNA.
- Extração de RNA e qPCR para avaliar a eficácia do silenciamento gênico.
Resultados Principais
- Observado silenciamento gênico significativo em regiões cerebrais após inoculação.
- Entrega aprimorada de siRNA utilizando o dispositivo de posicionamento em comparação com outros métodos.
- Fluorescência intensa detectada nos cérebros de camundongos tratados, indicando entrega bem-sucedida.
- O posicionamento com a cabeça para baixo melhorou a penetração e a deposição da formulação de siRNA.
Conclusões
- O dispositivo de posicionamento de camundongo é eficaz para a administração de fármacos no sistema nervoso central.
- Este método pode ser aplicado em diversas situações terapêuticas e de pesquisa.
- Estudos futuros podem explorar seu uso no tratamento de doenças do sistema nervoso central.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega intranasal eficiente de terapêuticas direcionadas ao SNC continua sendo um gargalo crítico no desenvolvimento pré-clínico de neurociência e terapia gênica. Este dispositivo de posicionamento permite a administração padronizada e de alto rendimento de biomoléculas, como siRNA, peptídeos ou nanopartículas, ao cérebro de camundongos, melhorando a reprodutibilidade e reduzindo a variabilidade em estudos de engajamento do alvo. Ao garantir um posicionamento consistente com a cabeça para baixo e para frente, ele aumenta a confiança preditiva na captação pelo SNC e reduz os riscos no avanço translacional de candidatos terapêuticos intranasais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação precisa de hipóteses terapêuticas ao garantir a administração reprodutível de compostos ativos no SNC, como complexos RVG9R-siRNA.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade dependente do operador na dosagem, apoiando avaliações confiáveis do engajamento com o alvo e da modulação da via.
- Confiabilidade Preditiva: Melhora a consistência nos resultados dos biomarcadores, como silenciamento gênico ou redução proteica, entre os grupos tratados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos padronizados para triagem subsequente, garantindo entrega uniforme de compostos ao sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Facilita a reprodutibilidade dos ensaios por meio do posicionamento controlado dos animais e redução do estresse provocado pelo manejo.
- Reutilização da Plataforma: Permite a avaliação de diversas modalidades, incluindo siRNA, nanopartículas e anticorpos, para entrega ao sistema nervoso central.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao permitir a administração consistente em regiões cerebrais-chave envolvidas em modelos de neurodegeneração ou infecção viral.
- Valor Operacional: Permite a avaliação rápida de candidatos terapêuticos mediante o processamento paralelo de até oito camundongos por sessão.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção ao aumentar a confiança nos dados de exposição ao SNC e modulação do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O dispositivo integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a validação inicial do alvo até a otimização do composto líder, apoiando avaliações confiáveis de entrega ao SNC antes dos estudos habilitantes para IND.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a administração consistente de siRNA ou terapêuticas peptídicas para validar a modulação de alvos in vivo.
- Triagem: Melhora a prontidão e reprodutibilidade de ensaios ao padronizar a posição dos animais durante a administração intranasal de compostos.
- Análises: Permite a comparação quantitativa da captação no SNC por meio de fluorescência, qPCR ou leituras de biomarcadores entre grupos de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica, melhorando a confiabilidade das métricas de entrega ao SNC usadas em estudos de definição de dose e eficácia.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para avaliar múltiplas modalidades direcionadas ao SNC em diferentes projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na entrega ao SNC e no engajamento do alvo ao reduzir a variabilidade procedural.
- Valor Operacional: Melhora a produtividade e a padronização, reduzindo o tempo de manipulação e a dependência do técnico.
- Valor Estratégico: Apoia decisões mais assertivas de prosseguir/não prosseguir ao melhorar a qualidade dos dados e reduzir falsos negativos em ensaios de entrega ao SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos intranasais com base em dados reprodutíveis de captação no SNC.
Considerações sobre a Implementação
- Requer treinamento na avaliação da anestesia e no posicionamento correto do animal para garantir conforto e posicionamento adequado.
- Depende do acesso a equipamentos para administração intranasal, como micropipetas e ponteiras estéreis, para formação consistente de gotas.
- Necessita padronização entre as equipes para assegurar posicionamento uniforme com a cabeça para baixo e para frente, bem como o intervalo de tempo entre as inoculações nas narinas.
- Deve ser adaptado para diferentes linhagens ou tamanhos de camundongos, utilizando ajustes de altura e inclinação da cadeira.
- Limita-se a procedimentos que exigem administração intranasal precisa; não é adequado para vias de administração intravenosa ou oral.
