Name: Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Aprenda a determinar a taxa de fertilização em Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética com DAPI. Este protocolo rápido de três horas permite analisar a proporção sexual primária e auxilia no manejo integrado de pragas.

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Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de NSF (DEB-1020460) para M.S.H. e um subsídio de USDA AFRI (2010-03752) para M.S.H. Os autores graças a Brennan Zehr para coloração de ovos de mosca branca com muita habilidade e Zen. Os autores agradecer a Mike Riehle permitindo o uso de seu microscópio fluorescente para a imagem latente. Os autores agradecer Suzanne Kelly e Marco Gebiola as imagens de ovo. Os autores Obrigado Suzanne Kelly e Jimmy Conway para ajudar nos momentos cruciais durante os experimentos.

Nota: Certifique-se de que todo o trabalho é realizado à temperatura ambiente em uma área bem ventilada ou sob uma coifa. Todos os 'gotas' neste protocolo são definidas como 5 – 20 µ l, dependendo da preferência do operador.
1. configuração inicial
<ol><li>Permita whiteflies femininos ovipositar em folhas limpas. Gaiolas de clip ou folhas cortadas para caber no ágar em um prato de Petri são exemplos de arenas de oviposição. Faça um buraco coberto na gaiola de clip ou capa de Petri para inserir e remover os adultos. Alternativamente, rapidamente colocou um vaso de adultos coletados no gelo e, em seguida, depositá-los na folha. Limite o tempo entre a oviposição e fixação de ovo para não mais de 60 min, para assegurar a observação da transição de esperma para o pronucleus paterna em ovos. Nota: Ovos não retirados da folha podem ser criados até a idade adulta para gravar rácios de sexo adultos.</li>
	<li>Antes ou durante a oviposição de mosca branca, prepare uma lâmina de microscópio, limpando-a com água e sabão, secá-lo bem e então esticando um pedaço de filme de parafina em uma extremidade, certificando-se de que não quebrar a superfície da película de parafina (Figura 1). Nota: O filme de parafina é hidrofóbico e semi opaco, permitindo que líquidos para formar gotas e ovos para ser mais facilmente visto.</li>
</ol>2. Dechorionation
<ol><li>Com um vidro Pasteur pipeta, adicione gotas de solução de água sanitária (0,83% de hipoclorito de sódio) para o filme de parafina. Nota: É mais fácil de acompanhar ovos se apenas 2-3 ovos são em cada gota. Como alternativa, para gerenciar um número de ovo grande, recolha os ovos em gotas de 1x tampão fosfato salino (PBS). Atenção: Bleach é corrosivo; usar luvas quando manusear alvejante e não inale.</li>
	<li>Remova os whiteflies adultos da folha.</li>
	<li>Coloque a folha sob um microscópio para ver os ovos claramente e recolher os ovos isoladamente e, cuidadosamente, com uma sonda fina. Para fazer uma sonda, inserir um pin de nadel minuten a 45° ou um ângulo de trabalho confortável com uma ponta de pipeta derretida (Figura 2).</li>
	<li>Transferi os ovos para lixívia ou 1X PBS. Se usar 1X PBS, retire o 1X PBS com um vidro Pasteur Pipetar uma vez todos os ovos são coletados e, em seguida, adicionem água sanitária para os ovos. Nota: Quando a coleta de ovos, lentamente, levante o ovo de sua base até o pedicelo é removido da folha. O pedicelo é pegajoso, e o ovo comumente vai ficar com a ponta da sonda até que é mergulhado em água sanitária. Nota: Recomenda-se usar pipetas Pasteur de vidro separado para todos os reagentes, e as pipetas podem ser modificadas com calor para fazer as pontas mais estreitas e reduzir o risco de aspiração acidentalmente os ovos da mosca branca. Para evitar contaminação e resíduos, limpe as pipetas com água desionizada após cada utilização.</li>
	<li>Espere por 10 min. Se houver interesse na embriogênese em ovos mais de 1h, deixe os ovos em água sanitária para até 15 min. Nota: Para os ovos que são velhos até 1h, 10 min é suficiente.</li>
</ol>3. fixação
Nota: Estas etapas são tiradas de um protocolo himenóptera17.
<ol><li>Remover a água sanitária (que contém os fragmentos de córion) com um pipeta Pasteur de vidro e descartá-lo. Adicione gotas de ácido acético com um vidro Pasteur pipeta e esperem 3 min. Atenção: Prosseguir com este passo sob uma coifa. Ácido acético glacial é corrosivo; desgaste luvas quando manipular o ácido acético glacial e não inale, especialmente em combinação com a lixívia residual.</li>
	<li>Remover o ácido acético glacial com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de solução de Clarke (3:1 de etanol absoluto: ácido acético glacial) com um vidro Pasteur pipeta. Espere até que a maioria da solução tenha evaporado (ou 10 min máx).</li>
	<li>Adicione gotas de etanol a 70% para os ovos com uma pipeta Pasteur de vidro e espere até que a maioria do etanol tenha evaporado (ou max 10 min).</li>
</ol>4. coloração
<ol><li>Remover qualquer etanol residual com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de 1X PBS aos ovos com um copo de pipeta Pasteur para obter o pH próximo de 7,0. Conjunto da corrediça do microscópio em uma câmara de umidade para evitar a dessecação, por exemplo, em uma caixa de ponta de pipeta vazio com uma toalha de papel molhada dentro (Figura 3). Espere pelo menos 30 min. Nota: Este é o melhor ponto se houver necessidade de uma pausa, enquanto a câmara de umidade pode evitar a dessecação.</li>
	<li>Remover a PBS 1x com uma pipeta Pasteur, de vidro e adicione gotas de 0,1 μg/mL DAPI, uma mancha fluorescente de DNA, com um vidro Pasteur pipeta. Definir o microscópio em uma câmara escura de umidade e espere pelo menos 15 min. Atenção: DAPI é um irritante, então lidar com isso com luvas.</li>
</ol>5. lavar roupa
<ol><li>Remova o DAPI com um pipeta Pasteur de vidro.</li>
	<li>Adicione gotas de 1 x TBST (5 x solução feita a partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polissorbato 20 e 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] e trouxe para 1 L com água de grau PCR) para os ovos com um copo de Pasteur pipeta. Espere 5 minutos antes de retirar o 1 x TBST com um pipeta Pasteur de vidro. Repita essa etapa 2 vezes.</li>
</ol>6. montagem
<ol><li>Após a lavagem final, pipete cuidadosamente todos os ovos do filme de parafina em uma parte limpa da lâmina de microscópio. Remover o excesso 1 x TBST; em seguida, adicionar 20 µ l de mídia de montagem (glicerol 80% e 20% 1 x TBST com 2% de n-propil-galato) e colocar um slide de capa limpa em cima dos ovos.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, selar o slide de capa com esmaltes claros e, em seguida, armazenar o slide no escuro a 2 ° C ou visualizá-la imediatamente sob um microscópio fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
<li>Pascal, S., Callejas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecific+competition+between+biotypes+B+and+Q+of+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+from+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain.</a> Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).</li>
<li>Liu, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+mating+interactions+drive+widespread+invasion+and+displacement+in+a+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly.</a> Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+discrimination+in+invasive+whitefly+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Behavior%22%5BJournal%5D)">Mate discrimination in invasive whitefly species.</a> Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+mating+behaviour+drives+asymmetric+reproductive+interference+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies.</a> Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).</li>
<li>Tsueda, H., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+differences+between+Q+and+B+whiteflies%2C+Bemisia+tabaci%2C+on+three+host+plants+and+negative+interactions+in+mixed+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).</li>
<li>Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mating+behavioural+interactions+and+life+history+traits+in+the+competition+between+alien+and+indigenous+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).</li>
<li>Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reproductive+interference+on+the+competitive+displacement+between+two+invasive+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).</li>
<li>Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+concepts+as+applied+to+the+whitefly+Bemisia+tabaci+systematics%3A+how+many+species+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?</a> Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).</li>
<li>Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php">http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php</a> (2018).</li>
<li>Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+insect+supervectors+Bemisia+tabaci+and+Frankliniella+occidentalis+in+the+emergence+and+global+spread+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses.</a> Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).</li>
<li>Giorgini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+symbionts+cause+parthenogenetic+reproduction+in+the+parasitoid+wasp+Pingala+soemius+%28Hymenoptera%3A+Eulophidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+endosymbiont+Rickettsia+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest.</a> Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).</li>
<li>Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mechanism+and+genetic+consequences+of+thelytoky+in+the+wasp+Trichogramma+cacoeciae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae.</a> Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+fitness+benefits+of+the+Rickettsia+bacterial+symbiont+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest.</a> Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+nuclear+genotype+influences+phenotype+of+a+conditional+mutualist+symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont.</a> Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+intracellular+ecosystem%3A+symbiotic+bacteria+share+bacteriocytes+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies.</a> FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).</li>
<li>Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+inheritance+of+a+single+somatic+animal+cell+displayed+by+the+bacteriocyte+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci.</a> Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).</li>
<li>Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo é o primeiro a capturar a taxa de fertilização ou primária proporção sexual de b. tabaci. O desafio do presente protocolo é que ele requer pesquisadores aprender a lidar com os ovos da mosca branca rapidamente, garantindo que não mais de 1h se passou desde que os ovos foram oviposited até que eles são fixos. Durante experimentos preliminares, os ovos que foram corrigidos em 3h ou mais postoviposition eram muito velhos para observar a fecundação, como syngamy tinha ocorrido e divisões mitóticas est...

O estudo da alocação de sexo, ou o investimento relativo em prole masculina e feminina, é uma pedra angular da ecologia comportamental1,2,3. Além de seu poder para testar modelos adaptáveis de comportamento, saber que a estratégia de alocação de sexo de um organismo pode melhorar modelos de sua dinâmica populacional. Em muitas espécies, alocação de sexo é controlada por mães. Para determinar a alocação de sexo, é importante determinar a proporção sexual primária ou a proporção de fêmeas no momento da deposição do ovo. Embora a proporção sexual na emergência de adultos pode fornecer pistas para alocação de sexo, diferencial do desenvolvimento mortalidade entre machos e fêmeas juvenis pode comumente inclinar a proporção sexual adulta substancialmente. Em algumas espécies de Hymenoptera, a ordem de insetos que contém formigas, abelhas e vespas, determinou-se a proporção sexual primária com ensaios citogenéticos, manchando os embriões para exibir genético DNA. Porque hymenopterans são haplodiploid, um ovo masculino incipiente é haploide e contém apenas o pronucleus feminino (n), enquanto os óvulos femininos incipientes são diploides e contêm pró-núcleos masculinos e femininos (2n). Embora Aleyrodidae, sap-alimentação da família dos Hemiptera (Hemiptera) conhecido como whiteflies, são também haplodiploid, não houve um ensaio estabelecido para encontrar a proporção sexual primária nesses insetos. Este é talvez surpreendente dada a intensidade do estudo das poucas pragas sérias cosmopolitas nesta família e a importância das relações de sexo em interações competitivas de whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 e na dinâmica da população em geral. Em haplodiploid insetos também, relações de sexo são ilimitadas por sistemas de determinação do sexo, permitindo a possibilidade de fertilização seletiva e lábil razões sexuais que variam de acordo com o meio ambiente2. Aqui apresentamos uma técnica para determinar a proporção sexual primária do complexo espécie de whiteflies, conhecidos coletivamente como a mosca branca sweetpotato, b. tabaci. Este nome de uma espécie engloba mais de 28 espécies no mundo11e inclui alguns dos mais danosas pragas invasoras global12,13. A aplicação desta técnica para determinar os padrões de alocação de sexo no b. tabaci e outro Aleyrodidae permitirá uma investigação mais rigorosa das variáveis, incluindo temperatura, planta hospedeira, bactérias endossimbióticas ou planta/mosca branca patógenos, que possam influenciar razões sexuais primárias de mosca branca e dinâmica da população de mosca branca.
Nós somos inconscientes de qualquer técnicas de ovo de coloração comparáveis de b. tabaci. O protocolo é conveniente em comparação com métodos de coloração utilizados para outros ovos de inseto14 como omite uma etapa de fixação durante a noite e, portanto, pode ser concluída dentro de 3 h. Como um exemplo de um aplicativo, uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, está associado com viés feminino em nossas linhas de laboratório de b. tabaci Médio Oriente-Ásia menor 1 (MEAM1)15,16. Em uma linha de laboratório da b. tabaci MEAM1 ("MAC1," recolhidos no centro agrícola de Maricopa), testamos se Rickettsia-infectados (R.+) fêmeas fertilizam mais ovos do que os não infectados fêmeas (R.–).

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>Qualquer</td><td></td><td>solução 5x feita de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 e 1,0 g de NaN3 pH 7,5, e levada a 1 L com água de grau PCR</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox</td><td></td><td>Qualquer alvejante doméstico funcionará desde que possa ser diluído a 0,83% Hipoclorito de sódio</td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Qualquer</td><td></td><td>diluir a 70% EtOH</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse 50i foi usado neste experimento, mas qualquer microscópio fluorescente com filtro de excitação de 340/380 nm e ampliação de pelo menos 4-10x pode ser usado</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio</td><td>selvagem</td><td></td><td>Um microscópio Wild M5A foi usado para este experimento, mas qualquer microscópio onde o operador possa ver claramente os ovos da mosca-branca pode ser usado</td></tr><tr><td>Tampas de lâminas de microscópio</td><td>Quaisquer</td><td></td><td>métodos são para tampas de lâminas de 18 mm x 18 mm. Mais mídia de montagem precisará ser adicionada para tampas deslizantes maiores.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pino nadel Minuten</td><td>BioQuip</td><td>1208SA</td><td>Os pinos nadel Minuten são opcionais para modelagem como sondas com pontas de pipeta</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-propil-galato</td><td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pipetas Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Fisherbrand Pipetas Pasteur de vidro borossilicato descartáveis 5.75 in. Um bico de Bunsen também pode ser necessário se o operador quiser alongar e estreitar pipetas</td></tr> Água <tr><td>de grau PCR</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Quaisquer</td><td></td><td>pontas de pipeta são opcionais para modelagem como sondas com pinos nadel minúsculos</td></tr><tr><td>Bulbo conta-gotas pequeno</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Deve caber na pipeta Pasteur</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da taxa de fertilização do ovo de bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Umas poucas espécies de sugadores de seiva whiteflies são algumas das mais danosas pragas terrestres em todo o mundo devido o que eles causem danos à lavoura e vírus de planta que eles vector. Apesar de numerosos estudos da biologia destas espécies em diferentes ambientes, um parâmetro chave história de vida, relações de sexo de prole, tem recebido pouca atenção, no entanto, é importante para prever a dinâmica populacional. A proporção sexual primária (proporção sexual em oviposição) de Bemisia tabaci nunca foi relatada, mas podem ser encontrada, determinando a taxa de fertilização do ovo deste insecto haplodiploid. A técnica envolve a dechorionation de ovos com água sanitária, uma série de etapas de fixação e a aplicação da geral DNA fluorescente mancha, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, um corante fluorescente de DNA-ligando), para ligar a pró-núcleos masculinos e femininos. Aqui, apresentamos a técnica e um exemplo de sua aplicação, para testar se uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenciado a proporção sexual primária de b. tabaci. Esse método pode auxiliar nos estudos de população da whiteflies, ou para determinar se a alocação de sexo existe com certos estímulos ambientais.

Para testar se Rickettsia afeta a taxa de fertilização das fêmeas de MEAM1 de b. tabaci , nós criados Rickettsia-infectado (R.+) ou não infectados (R.–) b. tabaci em plantas de feijão-caupi (Vigna unguiculata) em separar as gaiolas em 27 ° C, umidade relativa de 70% e um fotoperíodo escuro h luz/8 de 16 h. R+ e R– 4º ínstar whiteflies foram cuidadosamente retirados das folhas e isolados em tubos de ti...

Apresentamos uma técnica citogenética simples usando ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar a taxa de fertilização e principal razão sexual do haplodiploid invasiva Praga Bemisia tabaci.

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

O protocolo que Liz desenvolveu nos permite determinar a taxa de fertilização da mosca branca. A aplicação dessa técnica melhorará nossa compreensão do comportamento e ecologia das moscas brancas. Moscas brancas são haplodiploides, então a taxa de fertilização é igual à razão sexual em oviposition.Este protocolo é o primeiro descrito para moscas brancas, ao nosso conhecimento, e pode ser concluído dentro de três horas. Para começar, faça um furo de cobertura na tampa da placa de Petri para inserir e remover as moscas brancas adultas. Configure uma câmara de umidade e modele uma sonda inserindo um pino fino em um ângulo de trabalho confortável em uma ponta de pipeta derretida para fazer uma sonda fina.Opcionalmente, alonge as pontas de pipeta de vidro com calor para facilitar o manuseio de ovos de mosca branca. Em seguida, deixe as moscas brancas fêmeas ovipositar em uma folha limpa, cortada para caber em ágar em uma placa de Petri. Durante a oviposição da mosca branca, limpe um slide de microscópio com água e sabão.Seque-o bem e estique um pedaço de filme de parafina sobre uma extremidade para permitir que líquidos formem gotas e ovos sejam mais facilmente vistos. Para descorrionat

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Diferencial esperma capacidade competitiva...

Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.

Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Tabelas de vida permitem a quantificação das fontes e as taxas de mortalidade nas populações de insetos e contribuam para a compreensão, previsão e manipulação dinâmica populacional em agroecossistemas. São apresentados métodos para realização e análise de tabelas de vida baseada em coorte no campo para um inseto com estágios de vida imatura séssil.

Metodologia para desenvolvimento de tabelas de vida para insetos sésseis no campo utilizando a mosca branca, Bemisia tabaci, em algodão como um modelo de sistema

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.

Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um ensaio de interferência de RNA e ChIP para estudar a herança epigenética do silenciamento induzido por RNAi e modificações associadas da cromatina em C. elegans.

Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

Aprenda a determinar a taxa de fertilização em Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética com DAPI. Este protocolo rápido de três horas permite analisar a proporção sexual primária e auxilia no manejo integrado de pragas.

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

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