Name: Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Aprenda a determinar a taxa de fertilização em Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética com DAPI. Este protocolo rápido de três horas permite analisar a proporção sexual primária e auxilia no manejo integrado de pragas.

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Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de NSF (DEB-1020460) para M.S.H. e um subsídio de USDA AFRI (2010-03752) para M.S.H. Os autores graças a Brennan Zehr para coloração de ovos de mosca branca com muita habilidade e Zen. Os autores agradecer a Mike Riehle permitindo o uso de seu microscópio fluorescente para a imagem latente. Os autores agradecer Suzanne Kelly e Marco Gebiola as imagens de ovo. Os autores Obrigado Suzanne Kelly e Jimmy Conway para ajudar nos momentos cruciais durante os experimentos.

Nota: Certifique-se de que todo o trabalho é realizado à temperatura ambiente em uma área bem ventilada ou sob uma coifa. Todos os 'gotas' neste protocolo são definidas como 5 – 20 µ l, dependendo da preferência do operador.
1. configuração inicial
<ol><li>Permita whiteflies femininos ovipositar em folhas limpas. Gaiolas de clip ou folhas cortadas para caber no ágar em um prato de Petri são exemplos de arenas de oviposição. Faça um buraco coberto na gaiola de clip ou capa de Petri para inserir e remover os adultos. Alternativamente, rapidamente colocou um vaso de adultos coletados no gelo e, em seguida, depositá-los na folha. Limite o tempo entre a oviposição e fixação de ovo para não mais de 60 min, para assegurar a observação da transição de esperma para o pronucleus paterna em ovos. Nota: Ovos não retirados da folha podem ser criados até a idade adulta para gravar rácios de sexo adultos.</li>
	<li>Antes ou durante a oviposição de mosca branca, prepare uma lâmina de microscópio, limpando-a com água e sabão, secá-lo bem e então esticando um pedaço de filme de parafina em uma extremidade, certificando-se de que não quebrar a superfície da película de parafina (Figura 1). Nota: O filme de parafina é hidrofóbico e semi opaco, permitindo que líquidos para formar gotas e ovos para ser mais facilmente visto.</li>
</ol>2. Dechorionation
<ol><li>Com um vidro Pasteur pipeta, adicione gotas de solução de água sanitária (0,83% de hipoclorito de sódio) para o filme de parafina. Nota: É mais fácil de acompanhar ovos se apenas 2-3 ovos são em cada gota. Como alternativa, para gerenciar um número de ovo grande, recolha os ovos em gotas de 1x tampão fosfato salino (PBS). Atenção: Bleach é corrosivo; usar luvas quando manusear alvejante e não inale.</li>
	<li>Remova os whiteflies adultos da folha.</li>
	<li>Coloque a folha sob um microscópio para ver os ovos claramente e recolher os ovos isoladamente e, cuidadosamente, com uma sonda fina. Para fazer uma sonda, inserir um pin de nadel minuten a 45° ou um ângulo de trabalho confortável com uma ponta de pipeta derretida (Figura 2).</li>
	<li>Transferi os ovos para lixívia ou 1X PBS. Se usar 1X PBS, retire o 1X PBS com um vidro Pasteur Pipetar uma vez todos os ovos são coletados e, em seguida, adicionem água sanitária para os ovos. Nota: Quando a coleta de ovos, lentamente, levante o ovo de sua base até o pedicelo é removido da folha. O pedicelo é pegajoso, e o ovo comumente vai ficar com a ponta da sonda até que é mergulhado em água sanitária. Nota: Recomenda-se usar pipetas Pasteur de vidro separado para todos os reagentes, e as pipetas podem ser modificadas com calor para fazer as pontas mais estreitas e reduzir o risco de aspiração acidentalmente os ovos da mosca branca. Para evitar contaminação e resíduos, limpe as pipetas com água desionizada após cada utilização.</li>
	<li>Espere por 10 min. Se houver interesse na embriogênese em ovos mais de 1h, deixe os ovos em água sanitária para até 15 min. Nota: Para os ovos que são velhos até 1h, 10 min é suficiente.</li>
</ol>3. fixação
Nota: Estas etapas são tiradas de um protocolo himenóptera17.
<ol><li>Remover a água sanitária (que contém os fragmentos de córion) com um pipeta Pasteur de vidro e descartá-lo. Adicione gotas de ácido acético com um vidro Pasteur pipeta e esperem 3 min. Atenção: Prosseguir com este passo sob uma coifa. Ácido acético glacial é corrosivo; desgaste luvas quando manipular o ácido acético glacial e não inale, especialmente em combinação com a lixívia residual.</li>
	<li>Remover o ácido acético glacial com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de solução de Clarke (3:1 de etanol absoluto: ácido acético glacial) com um vidro Pasteur pipeta. Espere até que a maioria da solução tenha evaporado (ou 10 min máx).</li>
	<li>Adicione gotas de etanol a 70% para os ovos com uma pipeta Pasteur de vidro e espere até que a maioria do etanol tenha evaporado (ou max 10 min).</li>
</ol>4. coloração
<ol><li>Remover qualquer etanol residual com um pipeta Pasteur de vidro e adicione gotas de 1X PBS aos ovos com um copo de pipeta Pasteur para obter o pH próximo de 7,0. Conjunto da corrediça do microscópio em uma câmara de umidade para evitar a dessecação, por exemplo, em uma caixa de ponta de pipeta vazio com uma toalha de papel molhada dentro (Figura 3). Espere pelo menos 30 min. Nota: Este é o melhor ponto se houver necessidade de uma pausa, enquanto a câmara de umidade pode evitar a dessecação.</li>
	<li>Remover a PBS 1x com uma pipeta Pasteur, de vidro e adicione gotas de 0,1 μg/mL DAPI, uma mancha fluorescente de DNA, com um vidro Pasteur pipeta. Definir o microscópio em uma câmara escura de umidade e espere pelo menos 15 min. Atenção: DAPI é um irritante, então lidar com isso com luvas.</li>
</ol>5. lavar roupa
<ol><li>Remova o DAPI com um pipeta Pasteur de vidro.</li>
	<li>Adicione gotas de 1 x TBST (5 x solução feita a partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polissorbato 20 e 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] e trouxe para 1 L com água de grau PCR) para os ovos com um copo de Pasteur pipeta. Espere 5 minutos antes de retirar o 1 x TBST com um pipeta Pasteur de vidro. Repita essa etapa 2 vezes.</li>
</ol>6. montagem
<ol><li>Após a lavagem final, pipete cuidadosamente todos os ovos do filme de parafina em uma parte limpa da lâmina de microscópio. Remover o excesso 1 x TBST; em seguida, adicionar 20 µ l de mídia de montagem (glicerol 80% e 20% 1 x TBST com 2% de n-propil-galato) e colocar um slide de capa limpa em cima dos ovos.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, selar o slide de capa com esmaltes claros e, em seguida, armazenar o slide no escuro a 2 ° C ou visualizá-la imediatamente sob um microscópio fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
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<li>Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo é o primeiro a capturar a taxa de fertilização ou primária proporção sexual de b. tabaci. O desafio do presente protocolo é que ele requer pesquisadores aprender a lidar com os ovos da mosca branca rapidamente, garantindo que não mais de 1h se passou desde que os ovos foram oviposited até que eles são fixos. Durante experimentos preliminares, os ovos que foram corrigidos em 3h ou mais postoviposition eram muito velhos para observar a fecundação, como syngamy tinha ocorrido e divisões mitóticas est...

O estudo da alocação de sexo, ou o investimento relativo em prole masculina e feminina, é uma pedra angular da ecologia comportamental1,2,3. Além de seu poder para testar modelos adaptáveis de comportamento, saber que a estratégia de alocação de sexo de um organismo pode melhorar modelos de sua dinâmica populacional. Em muitas espécies, alocação de sexo é controlada por mães. Para determinar a alocação de sexo, é importante determinar a proporção sexual primária ou a proporção de fêmeas no momento da deposição do ovo. Embora a proporção sexual na emergência de adultos pode fornecer pistas para alocação de sexo, diferencial do desenvolvimento mortalidade entre machos e fêmeas juvenis pode comumente inclinar a proporção sexual adulta substancialmente. Em algumas espécies de Hymenoptera, a ordem de insetos que contém formigas, abelhas e vespas, determinou-se a proporção sexual primária com ensaios citogenéticos, manchando os embriões para exibir genético DNA. Porque hymenopterans são haplodiploid, um ovo masculino incipiente é haploide e contém apenas o pronucleus feminino (n), enquanto os óvulos femininos incipientes são diploides e contêm pró-núcleos masculinos e femininos (2n). Embora Aleyrodidae, sap-alimentação da família dos Hemiptera (Hemiptera) conhecido como whiteflies, são também haplodiploid, não houve um ensaio estabelecido para encontrar a proporção sexual primária nesses insetos. Este é talvez surpreendente dada a intensidade do estudo das poucas pragas sérias cosmopolitas nesta família e a importância das relações de sexo em interações competitivas de whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 e na dinâmica da população em geral. Em haplodiploid insetos também, relações de sexo são ilimitadas por sistemas de determinação do sexo, permitindo a possibilidade de fertilização seletiva e lábil razões sexuais que variam de acordo com o meio ambiente2. Aqui apresentamos uma técnica para determinar a proporção sexual primária do complexo espécie de whiteflies, conhecidos coletivamente como a mosca branca sweetpotato, b. tabaci. Este nome de uma espécie engloba mais de 28 espécies no mundo11e inclui alguns dos mais danosas pragas invasoras global12,13. A aplicação desta técnica para determinar os padrões de alocação de sexo no b. tabaci e outro Aleyrodidae permitirá uma investigação mais rigorosa das variáveis, incluindo temperatura, planta hospedeira, bactérias endossimbióticas ou planta/mosca branca patógenos, que possam influenciar razões sexuais primárias de mosca branca e dinâmica da população de mosca branca.
Nós somos inconscientes de qualquer técnicas de ovo de coloração comparáveis de b. tabaci. O protocolo é conveniente em comparação com métodos de coloração utilizados para outros ovos de inseto14 como omite uma etapa de fixação durante a noite e, portanto, pode ser concluída dentro de 3 h. Como um exemplo de um aplicativo, uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, está associado com viés feminino em nossas linhas de laboratório de b. tabaci Médio Oriente-Ásia menor 1 (MEAM1)15,16. Em uma linha de laboratório da b. tabaci MEAM1 ("MAC1," recolhidos no centro agrícola de Maricopa), testamos se Rickettsia-infectados (R.+) fêmeas fertilizam mais ovos do que os não infectados fêmeas (R.–).

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>Qualquer</td><td></td><td>solução 5x feita de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 e 1,0 g de NaN3 pH 7,5, e levada a 1 L com água de grau PCR</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox</td><td></td><td>Qualquer alvejante doméstico funcionará desde que possa ser diluído a 0,83% Hipoclorito de sódio</td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Qualquer</td><td></td><td>diluir a 70% EtOH</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse 50i foi usado neste experimento, mas qualquer microscópio fluorescente com filtro de excitação de 340/380 nm e ampliação de pelo menos 4-10x pode ser usado</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio</td><td>selvagem</td><td></td><td>Um microscópio Wild M5A foi usado para este experimento, mas qualquer microscópio onde o operador possa ver claramente os ovos da mosca-branca pode ser usado</td></tr><tr><td>Tampas de lâminas de microscópio</td><td>Quaisquer</td><td></td><td>métodos são para tampas de lâminas de 18 mm x 18 mm. Mais mídia de montagem precisará ser adicionada para tampas deslizantes maiores.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pino nadel Minuten</td><td>BioQuip</td><td>1208SA</td><td>Os pinos nadel Minuten são opcionais para modelagem como sondas com pontas de pipeta</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-propil-galato</td><td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pipetas Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Fisherbrand Pipetas Pasteur de vidro borossilicato descartáveis 5.75 in. Um bico de Bunsen também pode ser necessário se o operador quiser alongar e estreitar pipetas</td></tr> Água <tr><td>de grau PCR</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Quaisquer</td><td></td><td>pontas de pipeta são opcionais para modelagem como sondas com pinos nadel minúsculos</td></tr><tr><td>Bulbo conta-gotas pequeno</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Deve caber na pipeta Pasteur</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da taxa de fertilização do ovo de bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Umas poucas espécies de sugadores de seiva whiteflies são algumas das mais danosas pragas terrestres em todo o mundo devido o que eles causem danos à lavoura e vírus de planta que eles vector. Apesar de numerosos estudos da biologia destas espécies em diferentes ambientes, um parâmetro chave história de vida, relações de sexo de prole, tem recebido pouca atenção, no entanto, é importante para prever a dinâmica populacional. A proporção sexual primária (proporção sexual em oviposição) de Bemisia tabaci nunca foi relatada, mas podem ser encontrada, determinando a taxa de fertilização do ovo deste insecto haplodiploid. A técnica envolve a dechorionation de ovos com água sanitária, uma série de etapas de fixação e a aplicação da geral DNA fluorescente mancha, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, um corante fluorescente de DNA-ligando), para ligar a pró-núcleos masculinos e femininos. Aqui, apresentamos a técnica e um exemplo de sua aplicação, para testar se uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenciado a proporção sexual primária de b. tabaci. Esse método pode auxiliar nos estudos de população da whiteflies, ou para determinar se a alocação de sexo existe com certos estímulos ambientais.

Para testar se Rickettsia afeta a taxa de fertilização das fêmeas de MEAM1 de b. tabaci , nós criados Rickettsia-infectado (R.+) ou não infectados (R.–) b. tabaci em plantas de feijão-caupi (Vigna unguiculata) em separar as gaiolas em 27 ° C, umidade relativa de 70% e um fotoperíodo escuro h luz/8 de 16 h. R+ e R– 4º ínstar whiteflies foram cuidadosamente retirados das folhas e isolados em tubos de ti...

Apresentamos uma técnica citogenética simples usando ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar a taxa de fertilização e principal razão sexual do haplodiploid invasiva Praga Bemisia tabaci.

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

O protocolo que Liz desenvolveu nos permite determinar a taxa de fertilização da mosca branca. A aplicação dessa técnica melhorará nossa compreensão do comportamento e ecologia das moscas brancas. Moscas brancas são haplodiploides, então a taxa de fertilização é igual à razão sexual em oviposition.Este protocolo é o primeiro descrito para moscas brancas, ao nosso conhecimento, e pode ser concluído dentro de três horas. Para começar, faça um furo de cobertura na tampa da placa de Petri para inserir e remover as moscas brancas adultas. Configure uma câmara de umidade e modele uma sonda inserindo um pino fino em um ângulo de trabalho confortável em uma ponta de pipeta derretida para fazer uma sonda fina.Opcionalmente, alonge as pontas de pipeta de vidro com calor para facilitar o manuseio de ovos de mosca branca. Em seguida, deixe as moscas brancas fêmeas ovipositar em uma folha limpa, cortada para caber em ágar em uma placa de Petri. Durante a oviposição da mosca branca, limpe um slide de microscópio com água e sabão.Seque-o bem e estique um pedaço de filme de parafina sobre uma extremidade para permitir que líquidos formem gotas e ovos sejam mais facilmente vistos. Para descorrionato de ovos, use uma pipeta pasteur de vidro para adicionar gotas de 83% de solução de alvejante hipoclorito de sódio ao filme de parafina logo antes da remoção adulta e coleta de óvulos. Alvejante e ácido acético glacial sãorosivos.Eles devem ser manuseados com luvas em um capô ou área bem ventilada. DAPI também é irritante e deve ser manuseado com luvas. Em seguida, remova as moscas brancas adultas da folha e coloque a folha sob um microscópio.Retire cuidadosamente cada ovo de sua base até que o pedicel seja removido da folha. Pratique em muitos ovos antes de realizar este protocolo. Levante os ovos lentamente da base e levante-o completamente da folha uma vez que você pode ver que o pedicel de ovo é removido da folha.Transfira de dois a três ovos para cada gota de alvejante e deixe-os por 10 minutos. Para fixar os ovos, use uma pipeta de vidro para descartar a alvejante. Em seguida, adicione gotas de ácido acético glacial e espere três minutos.Em seguida, remova o ácido acético glacial e adicione gotas da solução de Clarke. Então, espere 10 minutos até que a maior parte da solução tenha evaporado. Adicione gotas de 70% de etanol e espere novamente por 10 minutos.Para manchar os ovos, primeiro remova qualquer etanol residual. Em seguida, adicione gotas de 1xPBS aos ovos para obter o pH perto de sete. Coloque o deslizamento do microscópio em uma câmara de umidade para evitar a dessacação.Após 30 minutos, remova o 1xPBS e adicione gotas de 1 microgramas por DAPI mililitro. Coloque o deslizamento do microscópio em uma câmara de umidade escura e espere pelo menos 15 minutos. Para lavar ovos, primeiro remova a solução DAPI.Em seguida, adicione gotas de 1xTBST aos ovos. Após cinco minutos, remova o 1xTBST. Repita esta lavagem mais duas vezes para um total de três lavagens.Após a lavagem final, pipeta cuidadosamente todos os ovos do parafilme em uma parte limpa do slide do microscópio. Remova o excesso de TBST e adicione 20 microliters de mídia de montagem. Por fim, coloque um slide de cobertura limpa em cima dos ovos, sele o slide da tampa com esmalte transparente para armazenamento a longo prazo e prossiga para a imagem usando um microscópio fluorescente.A descorção de óvulos seguida de coloração nuclear DAPI permitiu a atribuição de fertilização e sexo embrião quando observada com um microscópio fluorescente. O pronucleu feminino está perto do centro do óvulo fêmea fertilizado e do óvulo macho não fertilizado, e o espermatozoide é visível como uma raia brilhante perto do ápice apenas do óvulo feminino. Uma aplicação desta técnica é determinar se os endossímbiontos bacterianos afetam as relações sexuais primárias dos moscas brancas.Por exemplo, as proporções sexuais primárias dos ovos colocados por moscas B.tabici não infectadas por Rickettsia e não infectadas não mostraram diferença significativa entre a razão sexual nos dois tratamentos. Quanto aos ovos criados até a idade adulta, resultados semelhantes foram observados para adultos infectados por Rickettsia e não infectados, não fornecendo evidências, pelo menos neste estudo, para maiores taxas de fertilização por fêmeas infectadas por Rickettsia. Usando este protocolo, pode-se determinar se o esperma interespecífico pode fertilizar óvulos.Se nenhuma fertilização for observada, pode-se recuar e ver se o esperma é transferido durante o acasalamento olhando na espermatozoide da fêmea. Se a fertilização ocorrer, pode-se comparar a razão sexual dos adultos com a taxa de fertilização para determinar a viabilidade do desenvolvimento da prole híbrida.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Diferencial esperma capacidade competitiva...

Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.

Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Tabelas de vida permitem a quantificação das fontes e as taxas de mortalidade nas populações de insetos e contribuam para a compreensão, previsão e manipulação dinâmica populacional em agroecossistemas. São apresentados métodos para realização e análise de tabelas de vida baseada em coorte no campo para um inseto com estágios de vida imatura séssil.

Metodologia para desenvolvimento de tabelas de vida para insetos sésseis no campo utilizando a mosca branca, Bemisia tabaci, em algodão como um modelo de sistema

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.

Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

O presente protocolo descreve como medir dados de parâmetros de vida comuns em mosquitos Aedes aegypti , incluindo fecundidade, tamanho da asa, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Essas medições podem ser usadas para avaliar a aptidão de mosquitos transgênicos.

Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

Este protocolo descreve um ensaio de interferência de RNA e ChIP para estudar a herança epigenética do silenciamento induzido por RNAi e modificações associadas da cromatina em C. elegans.

Análise da Herança Epigenética Transgeracional em C. elegans Usando um Fluorescente Reporter e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

Aprenda a determinar a taxa de fertilização em Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética com DAPI. Este protocolo rápido de três horas permite analisar a proporção sexual primária e auxilia no manejo integrado de pragas.

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

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