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DOI: 10.3791/59215-v
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Nós apresentamos abordagens experimentais para estudar RNA-interactianos de double-stranded RNA ligação proteína quinase RNA-ativado (PKR) durante o ciclo de pilha mamífero usando células HeLa. Este método utiliza o formaldeído para complexos de crosslink RNA-PKR e imunoprecipitação para enriquecer RNAs ligados a PKR. Estes RNAs podem ser analisados ainda mais através de sequenciamento de alto rendimento ou qRT-PCR.
Este protocolo fornece um método para identificar os interagedores de RNA de uma proteína de ligação de RNA PKR de forma genoma. Isso nos ajuda a entender melhor a regulação pós-transcricional da expressão genética pela proteína de ligação de RNA. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza uma ligação cruzada eficiente de formaldeído para corrigir rnase vinculado a proteínas de ligação de RNA e enriquecê-las através da imunoprecipitação.
PKR ativado é observado em pacientes com doença neurodegenerativa, como Parkinson e Doença de Alzheimer. Identificar RNase de dupla-encalha interagindo com PKR nos ajudará a entender melhor a patogênese dessas doenças degenerativas. Este método pode ser usado para estudar os interagedores de RNA de quaisquer proteínas de ligação de RNA.
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