Name: Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a identificar interatores de RNA da proteína quinase PKR em células de mamíferos usando crosslinking com formaldeído e imunoprecipitação. Este método revela mecanismos de regulação pós-transcricional relevantes para doenças neurodegenerativas.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano, Ministério da ciência e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).

1. solução e célula preparação
<ol><li>Preparação da solução<ol>
<li>Para o meio de cultura celular, prepare-se meio para cultura de células HeLa, adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) para 500 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Nota: Os antibióticos podem ser adicionados ao meio de cultura celular, mas não usamos antibióticos.</li>
		<li>Para o 0,1% paraformaldeído, dissolver paraformaldeído 4% (p/v) em 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) com aquecimento em uma chapa quente e diluir para fazer 30 mL de 0,1% (v/v) paraformaldeído adicionando 1X PBS. Atenção: Executar todas as etapas em uma coifa e tenha cuidado para não ferver a solução de paraformaldeído. Proteger a solução 0,1% de luz e armazenar a 4 ° C. Utilize a solução dentro de um mês. Nota: O pH da solução de paraformaldeído final de 0,1% (v/v) deve ser em torno de 7.</li>
		<li>Preparar o tampão de Lise fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) sulfato dodecyl de sódio (SDS) e Deoxycholate do sódio de 0,1% (p/v). Adicione água destilada tripla (TDW) para 40 mL. Loja a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar fCLIP tampão de lavagem: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS e 0,1% (p/v) Deoxycholate do sódio. Adicione 40 mL TDW. Loja a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM de EDTA e SDS de 4% (v/v). Adicione 40 mL TDW. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar o tampão de eluição de fCLIP: 20 mL de 4 x 8,5 mL de TDW, 21 g de ureia e buffer de PK. Prepare-se fresco.</li>
		<li>Preparar o tampão de eluição do RNA: 0,3 M de NaOAc e SDS 2% (p/v). Armazenar em temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare 2 x tintura de carregamento do RNA: 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v), 5 mM EDTA, SDS de 0,05% (p/v) e formamida 95% (v/v). Loja a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 1 buffer de x TBE: 0.089 M Tris-borato e 0,002 M EDTA. Prepare 500 mL de tampão TBE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de células de fase-preso S ou M<ol>
<li>Semente de 750.000 ~ ou ~ 1.000.000 HeLa células para amostras preso a fase S ou M, respectivamente. Desenvolvem-se células em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h.</li>
		<li>Tratar as células com timidina 2mm e incubar por 18 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lave as células duas vezes com PBS. Adicionar mídia fresca e incubar durante 9 h a 37 ° C.</li>
		<li>Para S células fase-preso, tratar as células com timidina 2mm. Para células de fase-preso M, trate as células com 100 ng/mL nocodazole. Incube por 15 h a 37 ° C e a colheita de células. Nota: A homogeneidade das amostras de ciclo celular pode ser verificada usando FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. formaldeído cross-linking e imunoprecipitação
<ol><li>Colheita da pilha<ol>
<li>Para uma amostra da fase S, colete as células com um raspador de célula e transferência em um tubo cônico de 15 mL. Para uma amostra da fase M, bata com o lado do prato cultura celular para destacar células fase-preso M e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL. Nota: Para aumentar a homogeneidade das células M fase-preso, não use um raspador de célula.</li>
		<li>Centrifugar as células a 380 x g em temperatura ambiente por 3 min. Retire o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de frio PBS e transferir para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reticulação de formaldeído<ol>
<li>Adicione 750 μL de paraformaldeído 0,1% por 10 min à temperatura ambiente para consertar as células.</li>
		<li>Adicionar 250 μL de glicina 1 M e incubar um adicional 10 min à temperatura ambiente para saciar a reação. Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.</li>
		<li>Re-suspenda com 1 mL de PBS. Centrifugar as células em 10.000 x g a 4 ° C por 30 s e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Re-suspenda com 400 μL de tampão de Lise fCLIP suplementado com inibidor de protease de 0,2% (v/v) e 2% (v/v) inibidor de RNase. Incubar no gelo por 10 min e proceda à sonicação usando um ultrasonicator.</li>
		<li>Adicione 11 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Vórtice brevemente e centrifugar 21.130 x g a 4 ° C por 15 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora pre-refrigerados 1,5 mL. Nota: Manter 40 μL do sobrenadante em um novo tubo de centrifugação, como o exemplo de entrada. Armazenar o exemplo de entrada a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imunoprecipitação<ol>
<li>Adicione 20 μL de grânulos de proteína A um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Lave os grânulos com 400 μL de tampão de Lise fCLIP. Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de Lise fCLIP cuidadosamente. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.</li>
		<li>Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.</li>
		<li>Re-suspenda as contas em 300 μL de tampão de Lise fCLIP. Adicione 8.3 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Adicionar 10 μL do anticorpo PKR e incubar durante 3 h em rotacao a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.</li>
		<li>Repita a etapa de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente. Nota: Nunca use um misturador do vortex. Inverta o tubo delicadamente com as mãos.</li>
		<li>Adicionar 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C em rotacao. Nota: O tempo de incubação pode resultar em vinculação do aumento do fundo.</li>
		<li>Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.</li>
		<li>Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.</li>
		<li>Adicione 300 μL de tampão de eluição de fCLIP. Incube em uma thermomixer por 3 h a 25 ° C para eluir PKR de grânulos. Nota: Prepare o fresco de tampão de eluição fCLIP.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g , à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo siliconizado limpo. Nota: Um tubo de microcentrifugadora também é okey, mas tubo siliconizado é a preferida para evitar a evaporação durante a etapa de reticulação (etapa 2.3.12).</li>
		<li>Adicionar 300 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante uma noite a 65 ° C. Nota: Utilize um thermomixer com tampa aquecida para evitar a evaporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extração de RNA<ol>
<li>Adicione 580 μL de ácido fenol clorofórmio e vórtice por 30 s. Incubar a 37 ° C por 1h.</li>
		<li>Vórtex durante 30 segundos e centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant (por exemplo, Glycoblue) e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.</li>
		<li>Precipitar pelotas por centrifugação a velocidade máxima a 4 ° C, durante 1 h. Nota: Se não foram observados aglomerados de RNA/DNA, adicione um adicional 0,5 μL de coprecipitant e centrífuga para um adicional 1 h. continuar esta etapa até pelotas de RNA/DNA são observadas.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de álcool etílico de 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min. repetir a etapa de lavagem mais uma vez. Remover o sobrenadante completamente e seque a pelota à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 42 μL de TDW, 5 μL de DNase eu de buffer, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de DNase I. Incubar a 37 ° C por 1h.</li>
		<li>Adicione 150 μL de TDW e 200 µ l de ácido fenol clorofórmio. Vórtice de 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.</li>
		<li>Precipitar pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Ressuspender em quantidade adequada de TDW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sequenciamento biblioteca preparação
<ol><li>remoção de rRNA<ol>
<li>Re-suspenda as pelotas de RNA da etapa 2.4.10 com 28 μL de TDW. Nota: A quantidade máxima de RNA total deve ser inferior a 5 μg.</li>
		<li>Siga os procedimentos fornecidos pelo guia de referência do kit rRNA remoção para remover o rRNA.</li>
		<li>Limpar o rRNA empobrecido RNAs adicionando 160 μL de grânulos magnéticos.<ol>
<li>Misture pipetando ~ 15 vezes e incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
			<li>Prenda o tubo em uma barra magnética e remover o sobrenadante.</li>
			<li>Adicionar 300 μL de álcool etílico a 80%, enquanto as contas ainda estão anexadas na Barra magnética e incubam por 30 s.</li>
			<li>Substitua o álcool etílico com uma solução de 300 μL a fresco. Ar seco os grânulos na Barra magnética para 12 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Re-suspenda as contas em 12 μL de TDW e misture pipetando 15 vezes.</li>
			<li>Anexar os grânulos na Barra magnética e mover o sobrenadante para um tubo limpo do PCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Empobrecem as fragmentada RNAs ribossomal (rRNAs) seguindo os procedimentos fornecidos pelo rRNA Kit de depleção.</li>
		<li>Limpe os RNAs adicionando 110 μL de grânulos magnéticos e repetindo as etapas 3.1.3.1 para 3.1.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligadura de rotulagem e adaptador de RNA<ol>
<li>Em RNAs empobrecido rRNA, adicione 2 μL de tampão, x CIAP 10, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de fosfatase alcalina da Antártica. Incube a 37 ° C por 1h e depois a 65 ° C por 5 min inactivar a fosfatase.</li>
		<li>Adicione 3 μL de tampão, x PNK 10, 1,5 μL de inibidor de RNase, 1,5 μL de T4 PNK enzima 0,8 μL de r-ATP e 1,7 μL de TDW. Incube a 37 ° C, durante 50 min.</li>
		<li>Adicionar 1,5 μL de 10mm ATP e incubar a 37 ° C por mais 40 min.</li>
		<li>Pare a reação adicionando 170 μL de tampão de eluição do RNA.</li>
		<li>Adicione 200 μL de clorofórmio fenol-ácido e vórtice por 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.</li>
		<li>Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 4,5 μL de TDW e adicionar 9 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA.</li>
		<li>Aquece a amostra a 95 ° C por 5 min e carga em um gel de ureia-página 10%.</li>
		<li>Funcione o gel a 370 V por 40 min. Nota: Pré-funcione o gel a 370 V para 90 min antes de carregar a amostra.</li>
		<li>Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 100-500 e quebrar o gel.</li>
		<li>Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite a 4 ° C em rotacao.</li>
		<li>Transferi a solução para uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligadura de adaptador 3'<ol>
<li>Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Re-suspender as pelotas de RNA em 6,5 μL de TDW e adicionar 1 μL de 10 μM 3' adaptador.</li>
		<li>Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.</li>
		<li>Adicione 1 μL de tampão, ligadura 10 x 0,5 μL de inibidor de RNase e 1 μL de RNA T4 ligase do 2. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.</li>
		<li>Adicione 12 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA e calor a 95 ° C por 5 min.</li>
		<li>Gel de purificar a 3' adaptador ligado RNAs, conforme descrito em 3.2.9 para 3.2.13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligadura de adaptador 5'<ol>
<li>Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Re-suspender as pelotas de RNA em 4.2 μL de TDW e adicionar 1 μL de 5 μM 5' adaptador.</li>
		<li>Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.</li>
		<li>Adicione 0,8 μL de tampão, ligase 10 x, 0,4 μL de inibidor de RNase, 0,8 μL de 10mm ATP, 0,8 μL de RNA T4 ligase do 1. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A transcrição reversa e amplificação por PCR<ol>
<li>No 5' adaptador RNAs ligados, adicionar 1 μL de primer de transcrição reversa 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min e arrefecer imediatamente a 4 ° C.</li>
		<li>Adicione 4 μL de tampão, FS x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M DTT 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa. Incube a 50 ° C por 1 h e 70 ° C durante 15 min.</li>
		<li>Preparar a amplificação por PCR<ol>
<li>Misturar 1 μL do produto da RT, 1 μL de primer RPI 25 μM, 1 μL de primer de RP1 25 μM, 10 μL de 5x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL de TDW e 0,5 μL de polymerase de alta-fidelidade.</li>
			<li>Executar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos. Nota: O programa para o PCR é: 98 ° C por 30 s para um começo quente, 98 ° C, durante 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s para amplificação e 72 ° C por 5 min. A etapa de amplificação é repetida em ciclos de 11-13.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Limpe os produtos PCR usando 40 μL dos grânulos magnéticos e passos seguintes 3.1.3.1 para 3.1.3.6 mas usando 10 μL de TDW para Eluir o DNA.</li>
		<li>Adicione 2 μL de tintura de carregamento 10 x DNA. Carregar a amostra em um gel do acrilamido 6% e executar a 200 V por 30 min.</li>
		<li>Mancha com Sybr gold (0,01% (v/v) em 1 x TBE buffer) durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>A mancha em 1 x TBE buffer durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 200 – 700 e quebrar o gel.</li>
		<li>Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite em temperatura ambiente para Eluir o DNA.</li>
		<li>Coloque tudo em uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.</li>
		<li>Precipitar o DNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 20 μL de TDW.</li>
		<li>Analise a amostra com um sequenciador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise da PKR-interagindo RNAs usando qRT-PCR
<ol><li>Método 1: A transcrição reversa do hexâmero aleatória<ol>
<li>Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.</li>
		<li>Adicione 0,5 μL de hexâmeros aleatória de 100 μM e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.</li>
		<li>Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.</li>
		<li>Fazer com que a reação mix: 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a mistura de reação para a solução de RNA.</li>
		<li>Incubar a mistura a 23 ° C por 10 min, 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.</li>
		<li>Analise o cDNA usando um sistema PCR em tempo real. Nota: O programa para o PCR em tempo real é: 95 ° C por 3 min para arranque a quente, 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 10 s para amplificação e 95 ° C por 30 s, 65 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s para derreter. A etapa de amplificação é repetida para 40 ciclos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Método 2: Transcrição reversa Strand-específicos<ol>
<li>Preparar uma mistura de mestre de primers inversa: mistura de quantidades iguais de primers específicos de transcrição reversa de gene que contém a sequência de promotor CMV seguidas de ~ 20 nucleotídeos de sequências de genes específicos. Nota: A concentração combinada de todos os genes específicos RT primeiras demão é de 4 μM.</li>
		<li>Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.</li>
		<li>Adicione 0,5 μL da mistura mestre da 4 μM de primers de transcrição reversa e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.</li>
		<li>Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.</li>
		<li>Prepare a solução de reação misturando 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a solução de reação à mistura do RNA-primer.</li>
		<li>Incube a solução a 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.</li>
		<li>Analise o cDNA usando o sistema PCR em tempo real. Nota: O programa para o PCR em tempo real é o mesmo que aquele descrito no método 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
<li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li>
<li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAX%2FPACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation%2C+leading+to+G%281%29+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O processo para preparar amostras de fase-preso S ou M é ilustrado na Figura 1. Para prender as células na fase S, usamos um método de bloqueio duplo de timidina onde tratamos as células com timidina duas vezes com um lançamento de 9h entre elas para assegurar a prisão de alta eficiência (figura 1A). Para a detenção de fase M, tratamos as células uma vez com timidina seguido por um lançamento de 9 h e então aplicado nocodazole ao bloco de células em prometafase ...

Proteína quinase RNA-ativado (PKR), também conhecido como eucarióticas iniciação fator alfa-2 da quinase 2 (EIF2AK2), é uma bem caracterizadas proteína quinase que transmite informações fornecidas por RNAs. Pertence a alfa de subunidade de iniciação 2 Tradução eucariota (eIF2α) família quinase e fosforila eIF2α em serina 51 em resposta à infecção para suprimir a tradução global1. Neste contexto, o PKR é ativado por RNAs virais double-stranded (dsRNAs), que fornecem uma plataforma para PKR dimerização e autofosforilação2. Além de eIF2α, PKR pode também phosphorylate p53, substrato do receptor de insulina 1, inibidor κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) para regular a atividade de numerosos sinal transdução vias3,4,5, 6.
PKR foi originalmente identificada como uma quinase que fosforilado eIF2α durante a infecção de poliovírus através do reconhecimento dsRNAs7,8 dos poliovírus. PKR é encontrado cada vez mais a desempenhar papéis multifacetadas além da resposta imune, e sua ativação aberrante ou avaria está implícito em várias doenças humanas. Ativado/Phosphorylated PKR (pPKR) é frequentemente observada durante a apoptose e é uma característica comum dos pacientes do doenças degenerativas, particularmente doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington, Parkinson e a doença de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Além disso, o PKR é ativado sob várias condições de estresse, tais como estresse metabólico e calor choque14,15,16,17. Por outro lado, a inibição da PKR resulta na proliferação celular aumentada e transformação maligna mesmo18,19. PKR função também é importante na função cerebral normal e durante o ciclo celular, como o nível de pPKR é elevada durante a fase de M20,21,22. Neste contexto, pPKR suprime tradução global e fornece dicas para sistemas de sinalização mitóticas chaves que são necessárias para a adequada divisão celular20. Além disso, a ativação prolongada de PKR resultou na fase G2/M detenção do ciclo celular em ovário de hamster chinês células23. Consequentemente, a fosforilação de PKR é regulada pelo ciclo de feedback negativo para garantir rápida desativação durante a transição de M/G121.
Apesar da função de ampla gama de PKR, nossa compreensão da ativação PKR é limitado devido à falta de uma abordagem experimental padronizada de alta produtividade para capturar e identificar dsRNAs que pode ativar PKR. Estudos anteriores mostraram que a PKR pode interagir com dsRNAs formado por dois invertido Alu repetições (IRAlus)20,24, mas a possibilidade da existência de dsRNAs celular adicional que pode ativar PKR durante o ciclo celular ou sob condições de estresse em células humanas era inexplorado. A abordagem convencional na identificação de RNA-interactianos de uma proteína de ligação de RNA (RBP) usa a luz UV para crosslink RNA-RBP complexos25,26,27. Um estudo recente aplicado esta abordagem de reticulação UV em um sistema de rato e identificou que pequenos RNAs nucleolares podem regular a ativação PKR durante o estresse metabólico16. Utilizando a reticulação de alta eficiência de formaldeído, apresentamos um método alternativo para identificar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular em células de HeLa28. Uma abordagem similar foi aplicada para estudar outros dsRBPs como Staufen e Drosha29,30,31. Nós achamos que a PKR pode interagir com vários tipos de RNA não-codificante tais como curto interspersed nuclear elemento (SINE), longo intercaladas elemento nuclear (linha), elemento de retrovírus endógenos (ERV) e alfa-satélite nem RNAs. Além disso, mostramos que a PKR pode interagir com RNAs mitocondriais (mtRNAs), que forma intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre a luz e pesados-strand strand RNAs28. Uma recente publicação mais suporte para nossos dados que algumas mtRNAs existe em um formulário frente e verso e pode ativar sensores dsRNA como melanoma diferenciação-proteína associada 5 para induzir os interferões32. Mais importante, a expressão e Localização subcellular das mtRNAs são modulados durante o ciclo celular e por vários factores de stress, que pode ser importante na sua capacidade de regular a ativação de PKR28.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para uma reticulação de formaldeído recentemente desenvolvidos e imunoprecipitação (fCLIP) método para capturar e analisar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular. Demonstramos o método para preparar amostras de detenção do ciclo celular utilizando timidina e nocodazole. Em seguida apresentamos o processo de fCLIP para isolar RNAs ligados a PKR e um método para preparar a biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para identificar estes RNAs. Além disso, podemos delinear procedimentos detalhados para analisar ligados a PKR RNAs usando qRT-PCR. Especificamente, apresentamos um procedimento de transcrição reversa vertente específica para analisar o strandedness de mtRNAs. O protocolo descrito é otimizado para as células HeLa e PKR, mas etapas-chave tais como a preparação da amostra de ciclo celular, fCLIP e análise da vertente específica qRT-PCR podem ser facilmente modificadas para estudar celular dsRNAs ou identificar interactianos de RNA de outros dsRBPs.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 7,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento de DNA 10X</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo cônico</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3' adaptador</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M Acetato de Sódio pH 5.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' adaptador</td><td></td><td></td><td>5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-fenol clorofórmio, pH 4.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Grânulos magnéticos DNA/RNA limpam</td></tr><tr><td>fosfatase alcalina antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DGCR8</td><td></td><td></td><td>Fabricado em casa</td></tr><tr><td>Anti-PKR (D7F7)</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKR (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio azul de bromofenol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase</td> <td>alcalina intestinal de bezerroTaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células 25 cm 2 posições</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr>Sequência <td></td><td></td><td>promotora CMV</td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGGTG-3'Dulbecco's</td></tr> <tr><td>modificado meio de águia Welgene</td><td></td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP (2,5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absoluto, Grau ACS</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-basic</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>Coprecipitante GlycoBlue (15 mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEB Kit de depleção de rRNA</td><td>Kit de Depleção de rRNA</td> <td>New England Biolabs</td><td>E6318</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr>Tecnologia <td>de sinalização de células</td><td>IgG de coelho normal</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>Índice de PCR primer reverso (RPI)</td><td></td><td></td> <td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'Tubos</td></tr> <tr><td>PCR com tampa plana, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de solução salina bufered fosfato (PBS)</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Polimerase</td></tr> <tr><td>de alta fidelidadeMicrocentrífuga PlateFuge com rotor basculante</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotídeo quinase (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, PCR Grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR sequência de primer: CO1 Pesado</td><td></td><td></td><td>Frente/Reverso: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CO2 Pesado</td><td></td><td></td><td>Frente/Reverso: 5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CO3 Pesado</td><td></td><td></td><td>Frente/Reverso: 5&prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CO3 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CYTB Pesado</td><td></td><td></td><td>para frente / para trás: 5&prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: GAPDH</td><td></td><td></td><td>Direto/Reverso: 5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND1 Pesado</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND1 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGGGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND4 Pesado</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND4 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND5 Pesado</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND6 Pesado</td><td></td><td></td><td>Frente/Reverso: 5&prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer qPCR: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse: 5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Hexâmero aleatório</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Dnase Recombinante I (Rnase-free) (5 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase recombinante (40 U/&mu; L)</td> <td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Remoção de rRNA Ribo-Zero Kit de Remoção de rRNA</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT sequência de primers: CO1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CO2 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CO3 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CO3 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAAGGGTGGAGAGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND4 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND4 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND5 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND6 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sequência de primer RT: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Polipropileno siliconizado 1,5 mL G-tubo</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>Dedecil sulfato de sódio</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase In Rnase inibidor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptase reversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>Transcriptase reversa para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>SuperScript IV transcriptase reversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>Transcriptase reversa para qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR ouro ácido nucleico gl stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotídeo quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 2, truncado KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C com ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borato-EDTA tampão (TBE)</td> <td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Grânulos de sepharose de proteína A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>Grânulos de proteína A</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Bioruptor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Bio-basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP (10 &mu; Ci/&mu; L, 3,3 &mu; M)</td> <td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

estudando o rna interactianos de proteína quinase rna-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Proteína quinase RNA-ativado (PKR) é um membro das proteínas de resposta imune inata e reconhece a estrutura secundária de double-stranded do RNA viral. Quando vinculado a viral double-stranded RNA (dsRNAs), o PKR sofre de dimerização e autofosforilação subsequente. PKR fosforilada (pPKR) torna-se ativo e induz a fosforilação de subunidade alfa do fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2α) para suprimir a tradução global. Aumentando a evidência sugere que a PKR pode ser ativada em condições fisiológicas, tais como durante o ciclo celular ou sob diferentes condições de estresse, sem infecção. No entanto, nosso entendimento sobre os ativadores de RNA de PKR é limitado devido à falta de um método experimental padronizado para capturar e analisar dsRNAs PKR-interagindo. Aqui, apresentamos um experimental protocolo especificamente enriquecer e analisar PKR limite RNAs durante o ciclo celular utilizando células HeLa. Nós utilizamos a atividade de reticulação eficiente de formaldeído para corrigir complexos PKR-RNA e isolá-los através da imunoprecipitação. Então, PKR co-immunoprecipitated RNAs podem ser processados para gerar uma biblioteca de sequenciamento de alto rendimento ainda mais. Uma classe importante de PKR-interagindo celular dsRNAs é RNAs mitocondriais (mtRNAs), que podem existir como intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre os RNAs de luz-fio e pesados-strand. Para estudar o strandedness destes mtRNAs frente e verso, apresentamos também um protocolo para a vertente específica qRT-PCR. Nosso protocolo é otimizado para a análise de RNAs PKR-limite, mas ele pode ser facilmente modificado para estudar dsRNAs celular ou RNA-interactianos de outras proteínas com ligação dsRNA.

Um esquema para o processo de prender HeLa células em fase S ou M do ciclo celular é mostrado na Figura 1. Para uma amostra da fase-preso M, podemos Visualizar claramente redondo em forma de células sob o microscópio (Figura 2A). Para examinar a eficácia da detenção do ciclo celular, o conteúdo nuclear da célula pode ser analisado usando FACS (Figura 2B). A Figura 3 mostra dados representativos para teste de eficiência de...

Nós apresentamos abordagens experimentais para estudar RNA-interactianos de double-stranded RNA ligação proteína quinase RNA-ativado (PKR) durante o ciclo de pilha mamífero usando células HeLa. Este método utiliza o formaldeído para complexos de crosslink RNA-PKR e imunoprecipitação para enriquecer RNAs ligados a PKR. Estes RNAs podem ser analisados ainda mais através de sequenciamento de alto rendimento ou qRT-PCR.

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Este protocolo fornece um método para identificar os interagedores de RNA de uma proteína de ligação de RNA PKR de forma genoma. Isso nos ajuda a entender melhor a regulação pós-transcricional da expressão genética pela proteína de ligação de RNA. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza uma ligação cruzada eficiente de formaldeído para corrigir rnase vinculado a proteínas de ligação de RNA e enriquecê-las através da imunoprecipitação.PKR ativado é observado em pacientes com doença neurodegenerativa, como Parkinson e Doença de Alzheimer. Identificar RNase de dupla-encalha interagindo com PKR nos ajudará a entender melhor a patogênese dessas doenças degenerativas. Este método pode ser usado para estudar os interagedores de RNA de quaisquer proteínas de ligação de RNA.Em particular, acreditamos que este método é útil para estudar proteínas que reconhecem o RNase estruturado, como rnase de duplar. Verifique a homogeneidade da amostra de ciclo preso antes de colher células. Além disso, é fundamental otimizar a eficiência da imunoprecipitação usando o melhor anticorpo disponível.Para começar, sementes 750.000 ou um milhão de células HeLa para amostras de S ou M-phase presos, respectivamente. Cultivar células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Trate as células com timmidina de dois milimônios e incubar a 37 graus Celsius por 18 horas.Lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione mídia fresca, e incubar a 37 graus Celsius por nove horas. Para células presas em fase S, trate células com timmidina de dois mililitros.Para células presas em fase M, trate células com 100 nanogramas por mililitro de nocodazol. Incubar a 37 graus Celsius por 15 horas. Para uma amostra de fase S, colete células com um raspador de células e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros.Para uma amostra de fase M, toque na lateral do prato de cultura celular para desapegar células presas em fase M, e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar as células a 380 g à temperatura ambiente por três minutos. Remova o supernatante e resuspense as células com um mililitro de PBS frio.Transfira células para tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar as células a 10.000 g a quatro graus Celsius por 30 segundos, e remover completamente os supernantes. Para realizar o crosslinking de formaldeído, primeiro adicione 750 microliters de 0,1% paraformaldeído às células, e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para fixar as células.Em seguida, adicione 250 microliters de glicina de um molar e incubar à temperatura ambiente por mais 10 minutos para saciar a reação. Centrifugar as células a 10.000 g a 4 graus Celsius por 30 segundos. Remova completamente os supernantes.Em seguida, resuspend com um mililitro de PBS. Centrifugar as células a 10.000 g a quatro graus Celsius por 30 segundos, e remover o supernante. Resuspend com 400 microliters de tampão de lise fCLIP suplementado com 0,2% de volume por cento inibidor de protease e 2% de inibidor de RNase de volume.Incubar no gelo por 10 minutos, e sonicar usando um ultrassônico. Em seguida, adicione 11 microliters de cloreto de sódio de cinco molares para ajustar a concentração de cloreto de sódio a 150 mililitros, e vórtice brevemente. Em seguida, centrífuga a 21,130 g a 4 graus Celsius por 15 minutos.Transfira os supernantes para um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 mililitro. Para realizar a imunoprecipitação, adicione primeiro 20 microlitadores de proteína A em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, lave as contas com 400 microliters de tampão de lise fCLIP.Centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Em seguida, remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lise fCLIP cuidadosamente, e reaprondo suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes. Repita o passo de lavagem três vezes.Após a lavagem final, remova completamente os supernantes. Resuspenja as contas em 300 microliters de tampão de lise fCLIP. Adicione 8,3 microliters de cloreto de sódio de cinco molares para ajustar a concentração de cloreto de sódio a 150 mililitros.Adicione 10 microliters de proteínas quinas RNA, e incuba em uma rotadora a quatro graus Celsius por três horas. Em seguida, centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lavagem fCLIP e resuspenque suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes.Repita o passo de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, remova completamente os supernantes. Em seguida, adicione 300 microliters de lise e incubar a quatro graus Celsius em um rotador por três horas.Em seguida, centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lavagem fCLIP e resuspenque suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes. Repita o passo de lavagem três vezes.Após a lavagem final, remova completamente o sobrenante. Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de eluição fCLIP. Incubar em um ThermoMixer a 25 graus Celsius por três horas para a proteína elute quinasase RNA ativado a partir das contas.Centrifugar a 1.000 g à temperatura ambiente, e transferir os supernantes para um tubo limpo siliconado. Finalmente, adicione 300 microliters de Proteinase K e incubar durante a noite a 65 graus Celsius. A eficiência da detenção do ciclo celular das células HeLa na fase S ou M foi examinada utilizando FACS.O anticorpo D7F7 mostrou uma capacidade superior de imuno precipitar proteína quinase RNA ativado. A análise de manchas ocidentais do imuno PKR precipitado ou total heLa lysate mostrou apenas uma banda forte correspondente ao tamanho do PKR, indicando que o anticorpo D7F7 é altamente específico no reconhecimento de PKR. O uso de diferentes anticorpos PKR com diferentes eficiências de precipitação imuno, resultou em uma distribuição de classe diferente de leituras de sequenciamento de mapas.A diminuição do sinal de radioisótopos para RNase co-imunoprecipitado PKR foi observada após a remoção bem sucedida do rRNA. PKR co-imunoprecipitado amostra de RNA, mostrou forte enriquecimento de RNase mitocondrial em comparação com os controles negativos. A transcrição reversa específica da strand foi usada para distinguir o fio pesado e leve mitocondrial RNase que foram co-imunoprecipitados com PKR para células presas fase S ou M.O passo mais crítico na preparação da amostra de parada do ciclo celular é onde você deve lavar as células duas vezes com PBS e onde você deve coletar apenas células pastel para homogeneidade ou seria prejudicada amostra. Para o processo ético, as etapas mais críticas são o cruzamento de formaldeído e quantidade. Após este procedimento, as RNAs elucidadas podem ser analisadas utilizando-se de manchas do norte, PCR qRT ou sequenciamento de alto rendimento.Esses experimentos podem identificar o tipo e a quantidade relativa de RNase vinculado ao PKR. Essa técnica pode ser aplicada para estudar e identificar os interagedores de RNA de proteínas de ligação de RNA que melhorarão nossa compreensão da regulação pós-transcricional da expressão genética, mediada por proteínas de ligação de RNA. O formaldeído é perigoso, por isso a fixação, a solução e o buffer de lavagem inicial precisam ser tratados com cautela.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

A reticulação cinética e análise de cDNA é um método que permite investigar a dinâmica das interações proteína-RNA em células vivas em alta resolução temporal. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, incluindo o crescimento de células de levedura, reticulação UV, colheita, purificação de proteínas e etapas de preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Aprenda a identificar interatores de RNA da proteína quinase PKR em células de mamíferos usando crosslinking com formaldeído e imunoprecipitação. Este método revela mecanismos de regulação pós-transcricional relevantes para doenças neurodegenerativas.

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

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