Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal
5 de maio de 2020
Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para a cirurgia do nervo facial no modelo de rato, incluindo descrições de vários padrões induziveis de lesão.
Este protocolo pode ajudar os cientistas a estudar os resultados após lesões no nervo facial e métodos para melhorar a regeneração em muitos parâmetros diferentes. A principal vantagem dessa técnica é que a anatomia de ratos permite fácil acesso ao nervo facial, e sua grande escala nos permite estudar todos os padrões de lesões relevantes. As aplicações desta técnica se estendem para a reabilitação dos pacientes após lesão do nervo facial.
Como potencial regenerativo, o rato fornece um modelo experimental reprodutível e conciso. E este método pode fornecer insights sobre terapias cirúrgicas e médicas para parese de nervos faciais ou paralisia. E é traduzível para outros modelos de cabeça e pescoço ou outros nervos periféricos.
Operar sob um microscópio usando ambas as mãos pode ser um desafio. Recomendo praticar usando a versão binóculo sob o microscópio antes de tentar uma dissecção do nervo facial. Após confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do rato e raspe a área cirúrgica.
Estabeleça um método para identificação de ratos e coloque um rolo de gaze sob o pescoço. Desinfete a pele exposta com três clorexidinas alternadas e 70% de etanol e coloque o rato sob um microscópio estéreo. Manipule o ouvido ipsilateral em uma direção anterior-posterior para determinar a dobra natural da pele pós-uricular.
Use uma lâmina número 15 para fazer uma incisão de dois a três milímetros no vinco pós-auricular. O planejamento e a colocação da incisão são os passos mais críticos para garantir a identificação confiável do nervo facial, minimizando o tamanho da ferida. Disseca sem rodeios através da fáscia subcutânea imediata e coloque um retrátil micro-Weitlaner para aumentar a exposição ao tecido.
Identifique o músculo digastric anterior enquanto ele viaja em uma direção inferior a superior em direção à sua inserção ao longo da base do crânio. Espalhe suavemente pela barriga muscular ao longo do ponto de inserção muscular para revelar o tendão da barriga digastrica anterior. O tendão aparecerá como um processo branco filmado emanando do músculo com uma inserção sólida na base do crânio.
Após a identificação do músculo digastric anterior e seu tendão, ajuste o retrátil weitlaner para retrair ainda mais a barriga muscular. A região exposta é o espaço tridimensional no qual está o tronco principal do nervo facial. Dissecar ao longo do nervo em uma direção inferior distally a partir da saída do foramen estilomastoide.
Para induzir um padrão de lesão de esmagamento, use fórceps de joalheiro de superfície lisa para agarrar firmemente e comprimir o nervo aplicando pressão constante e reprodutível por 30 segundos para garantir uma lesão de esmagamento apropriada. Para uma simples transeção, segure o epineurium imediato sobredilhando o nervo com fórceps de dentes finos, e use microscissores afiados para transectar o nervo de forma limpa no ponto desejado com um único corte. Para um modelo de lacuna nervosa, use pinças ajustáveis para definir o comprimento da lacuna nervosa desejada para garantir padrões de lesão semelhantes entre os animais e transectar o nervo como apenas demonstrado.
Após a ção experimental, irrigar a ferida com soro fisiológico e secar o tecido com gaze estéril. antes de fechar a incisão da pele de acordo com as diretrizes institucionais. Aqui, imagens ao vivo do tronco principal do nervo facial com uma lesão de esmagamento aproximadamente dois a três milímetros distal até o ponto de ramificação do primeiro PES em um rato adulto transgênico Thy1-GFP é mostrado.
A avaliação do retorno gradual da fluorescência em uma, duas, três e quatro semanas após a lesão pode ser usada como marcador para monitorar a regeneração nervosa nesses animais transgênicos. A análise histomorfométrica pode ser usada para obter imagens transversais da divisão mandibular marginal permitindo quantificação do diâmetro axonal, quantidade de detritos, fibra nervosa, porcentagem de medidas nervosas e de densidade. É importante ajustar frequentemente a colocação do retrátil conforme necessário para garantir que os nervos anatômicos relevantes sejam visíveis ao identificar o nervo facial.
Após este procedimento, os nervos e músculos relevantes podem ser colhidos para análise imunohistoquímica para avaliar o grau de regeneração em relação a outros grupos experimentais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no estudo dos desfechos funcionais após lesão do nervo facial. Especificamente, como realizar o fenômeno da sintetização.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para cirurgia do nervo facial em um modelo de rato, concentrando-se especificamente em padrões de lesão e resultados regenerativos. Ele facilita a investigação de técnicas cirúrgicas e terapias médicas para a reabilitação de lesões do nervo facial.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Medicina Regenerativa
- Modelos Animais
Antecedentes
- O modelo com rato proporciona fácil acesso ao nervo facial.
- Essa técnica cirúrgica pode ajudar a avaliar métodos de lesão e regeneração nervosa.
- As características anatômicas do rato permitem um estudo detalhado de diferentes padrões de lesão.
Objetivo do Estudo
- Avaliar abordagens terapêuticas para paresia ou paralisia do nervo facial.
- Ampliar o entendimento sobre a regeneração após lesões do nervo facial.
- Desenvolver uma técnica cirúrgica detalhada que possa ser replicada em diferentes estudos.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza um modelo com rato para intervenção cirúrgica no nervo facial.
- Os procedimentos principais incluem lesão por esmagamento e secção, com etapas cirúrgicas específicas descritas para garantir confiabilidade.
- Imagens em tempo real e análises histomorfométricas são utilizadas para monitorar os resultados da regeneração.
- Destaca-se uma dissecação metódica ao microscópio, exigindo habilidade e preparo.
Resultados Principais
- A visualização e manipulação bem-sucedidas do nervo facial permitem a avaliação dos processos regenerativos.
- A imagem por fluorescência e a análise histomorfométrica fornecem medidas quantificáveis da recuperação do nervo.
- A técnica revela informações importantes sobre os fenômenos de sinquinesia após lesão nervosa.
Conclusões
- Este estudo estabelece um protocolo fundamental para analisar lesão e regeneração do nervo facial.
- Permite aos pesquisadores explorar resultados funcionais e abordagens terapêuticas na reabilitação neural.
- A metodologia demonstra implicações significativas para aplicações mais amplas em estudos de nervos periféricos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de lesão do nervo facial em ratos fornece uma plataforma reprodutível para avaliar a regeneração e inibição axonal, apoiando a validação de alvos no desenvolvimento de terapias neuroregenerativas. Sua escalabilidade e acessibilidade anatômica permitem a avaliação consistente de padrões de lesão e respostas regenerativas, facilitando a redução de riscos pré-clínicos de candidatos neurotróficos ou anti-inibitórios. Este modelo conecta a pesquisa básica e a pesquisa translacional ao oferecer parâmetros histomorfométricos e funcionais quantificáveis relevantes para estratégias de reparo do nervo facial humano.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de inibição axonal e das vias regenerativas após lesões definidas por esmagamento, secção ou lacuna no nervo.
- Valor Operacional: Permite a administração consistente de reagentes neuroativos ou células para avaliar o engajamento do alvo e a modulação da via.
- Valor Preditivo: A quantificação histomorfométrica do diâmetro axonal, densidade de fibras e remoção de detritos fornece métricas objetivas para eficácia do alvo e redução de riscos mecanicistas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera modelos padronizados de lesão adequados para triagem de alta reprodutibilidade de compostos pró-regenerativos ou antagonistas inibitórios.
- Saídas Quantitativas: O imageamento em tempo real de axônios marcados com fluorescência e a análise histomorfométrica permitem o acompanhamento longitudinal e quantificável da regeneração.
- Escalabilidade: O modelo ratino permite manipulações cirúrgicas desde segmentos intracranianos até nervos extratemporais, apoiando avaliação multiparamétrica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Facilita a avaliação da recuperação funcional e da mitigação da sinquinesia, alinhando-se com os pontos finais clínicos na reabilitação do nervo facial.
- Modelagem Pré-clínica: Permite a avaliação de manipulações centrais ou em órgãos-alvo e terapias celulares em um sistema de nervo periférico relevante para a doença.
- Avanço Ajustado ao Risco: Taxas de sobrevida confiáveis e consistência entre espécies apoiam decisões de prosseguir ou interromper antes da tradução para espécies de ordem superior.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta ao permitir a validação de alvos por meio de lesão controlada do nervo, avançando para o desenvolvimento de ensaios para triagem de compostos e apoiando a avaliação pré-clínica de terapias regenerativas por meio de medidas funcionais e estruturais de desfecho.
- Biologia de Descoberta: Facilita testes de hipóteses sobre inibidores e promotores do crescimento axonal por meio de paradigmas padronizados de lesão.
- Triagem: Fornece modelos reprodutíveis de lesão nervosa para avaliação dos efeitos de compostos sobre a cinética e fidelidade da regeneração.
- Análises: Leituras histomorfométricas e baseadas em fluorescência fornecem dados quantificáveis para análise de resposta à dose e engajamento do alvo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona métricas de regeneração axonal com desfechos funcionais como a sinquinesia, apoiando a relevância clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica reutilizável para testes iterativos em múltiplas modalidades terapêuticas e pontos temporais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de regeneração axonal por meio de métricas quantificáveis e reprodutíveis de lesão e regeneração.
- Valor Operacional: Técnicas cirúrgicas padronizadas e protocolos de avaliação pós-operatória aumentam a consistência entre laboratórios e a confiabilidade dos dados.
- Valor Estratégico: Orienta decisões iniciais de prosseguimento ou interrupção do desenvolvimento ao esclarecer a biologia do alvo e reduzir o risco de falhas em programas neuroregenerativos de estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos neuroregenerativos com base na modulação validada do alvo em um modelo clínico relevante de nervo periférico.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microcirurgia e familiaridade com a neuroanatomia de roedores sob orientação estereomicroscópica.
- Depende de instrumentos especializados, incluindo afastadores micro-Weitlaner, pinças de ourives, tesouras microcirúrgicas e paquímetros ajustáveis para indução padronizada da lesão.
- Requer linhagens transgênicas com repórteres (por exemplo, Thy1-GFP) ou processamento imunohistoquímico para o rastreamento longitudinal dos axônios e análise histomorfométrica.
- Exige protocolos de cuidados pós-operatórios para garantir a sobrevivência dos ratos e minimizar variáveis confundidoras na avaliação da regeneração.
- A limitada manipulabilidade genética em comparação com modelos murinos pode restringir a análise mecanicista por meio de abordagens de eliminação gênica ou superexpressão.
