Name: A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a entrega por convecção aumentada guiada por RM de vetores virais optogenéticos no córtex de macacos Rhesus. Este método permite a manipulação da atividade neural em larga escala para estudar circuitos cerebrais complexos.

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Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association pós-doutorado Fellowship (AY), defesa avançada pesquisa projetos agência (DARPA) reorganização e plasticidade para acelerar a recuperação de lesões (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e pelo centro de imagiologia da neurociência UCSF. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde infantil Eunice Kennedy Shiver & desenvolvimento humano dos institutos nacionais de saúde o prêmio número K12HD073945, o Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e o centro de Neurotecnologia (CNT, um centro nacional de ciência da Fundação de engenharia de pesquisa a subvenção CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews por sua ajuda com os experimentos e NaN Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun para obter ajuda técnica.

Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, San Francisco institucional de cuidados e uso de animais do Comitê (IACUC) e estão em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O procedimento a seguir foi realizado com dois macacos machos adultos de 8 e 7 anos de idade, pesando 17,5 kg e 16,5 kg (macaco G e macaco J), respectivamente.
Nota: Use técnicas assépticas padrão para todos os procedimentos cirúrgicos.
1. imagem de base
<ol><li>Sedate e entubar o animal e manter a anestesia geral isoflurano (concentração alterada entre 0 a 5% conforme necessário, dependendo de sinais vitais, tais como frequência respiratória e frequência cardíaca). Monitore a temperatura do animal, a frequência cardíaca, a saturação de oxigênio, as respostas eletrocardiográficas e a pressão parcial da maré final do CO2 durante todo o procedimento.</li>
	<li>Coloque o animal em um quadro estereotódico compatível com MR (ver a tabela de materiais) em que permanecerá durante todo o procedimento. Ligue o animal a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR e transportá-la para o scanner de ressonância magnética (3 T).</li>
	<li>Adquira o T1 padrão (ângulo flip = 9 °, tempo de repetição/tempo de eco = 668,6, tamanho da matriz = 192 x 192 x 80, espessura da fatia = 1 mm) e T2 (ângulo de aleta = 130 °, tempo de repetição/tempo de eco = 52,5, tamanho da matriz = 256 x 256 x 45, espessura da fatia = 1 mm) imagens anatômicas do Sr referência e para o planeamento cirúrgico.</li>
	<li>Recupere o animal da anestesia e transporte-o à área de carcaça animal.</li>
	<li>Use as imagens adquiridas T1 e T2 para determinar a colocação da craniotomia. A posição da craniotomia pode precisamente ser determinada combinando a área cortical do interesse do Sr. com o Atlas do cérebro do macaque (Paxinos, Huang, Petride, edição de toga 2ND ). Além disso, essas imagens de linha de base podem fornecer uma estimativa para os locais de infusão viral. As regiões corticais de interesse aqui demonstradas são M1 e S1.</li>
</ol>2. implante de câmara compatível com MR
<ol><li>Sedate e entubar o animal e mantem a anestesia geral com monitoração anestésica padrão como em 1,1.</li>
	<li>Coloque o animal no quadro estereotódico compatível com o Sr em que permanecerá ao longo da implantação da câmara e da entrega do vetor viral. Ligue o animal a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR.</li>
	<li>Criar uma incisão sagital aproximadamente 2 cm da linha média com um comprimento de cerca de 5 cm com um bisturi.</li>
	<li>Retire o tecido mole subjacente do crânio usando elevadores (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Criar uma craniotomia circular (2,5 cm de diâmetro) para cobrir as trajetórias pré-planejadas para injeções usando um trephine (ver tabela de materiais).<ol>
<li>Abaixe o ponto de centralização do trephine após a borda do trephine. Crie um recuo no centro da craniotomia planejada suficientemente profundamente no crânio para ancorar a trefina usando o ponto de centralização ajustável do trephine. Exercite o cuidado para evitar penetrar completamente a profundidade do crânio, pois isso pode causar danos ao tecido neural subjacente.</li>
		<li>Lave periodicamente a área com soro fisiológico conforme necessário para manter a umidade do tecido em toda a craniotomia.</li>
		<li>Uma vez que o centro foi feito, abaixe o trephine no crânio e gire o trephine no sentido horário e anti-horário ao aplicar a pressão descendente até que a tampa do osso possa ser removida com fórceps. Exercite o cuidado para evitar danificar o tecido subjacente com o trephine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rosqueie uma sutura fina (tamanho 6-0) através do dura no centro da craniotomia e levante a dura puxando delicadamente a sutura da superfície do cérebro que cria uma barraca no centro da craniotomia.</li>
	<li>Em seguida, perfure a dura perto do centro da tenda usando tesouras oftalmálicas finas para evitar danificar o cérebro. Em seguida, cortar a dura do centro para a borda da craniotomia e continuar ao longo da borda com tesouras opthalmic multa.</li>
	<li>Monte a câmara cilíndrica personalizada com o tipo CED (Figura 1; ver secção 4 para instruções de produção) para o crânio em cima da craniotomia para fornecer suporte de cânula durante a PERFUSÃO de CED, de tal forma que a curvatura da flange da câmara se alinha bem com a curvatura do crânio.</li>
	<li>Prenda os implantes ao crânio usando os parafusos plásticos e o acrílico dental ou alguns parafusos Titanium.</li>
</ol>3. entrega viral do vetor
<ol><li>Logo após a implantação da câmara compatível com MR e a inserção da grelha de injecção da cânula (Figura 1a-B, figura suplementar 1) na câmara, encha a grelha com soro fisiológico (0,9% NaCl) para visualizar os locais de injecção através de imagens anatômicas Mr e Encha as cavidades da câmara com a gelatina absorvente estéril molhada para manter a umidade do cérebro (Figura 1F).</li>
	<li>Cubra a pele e o cilindro com uma incisão antimicrobiana estéril incise para manter a esterilidade dos cilindros durante o transporte e infusões MR. Coloque uma cápsula de vitamina E para marcar a parte superior da grelha de injecção para identificação positiva.</li>
	<li>Enquanto o animal permanece intubado, retire o tubo endotraqueal do circuito de anestesia e volte a anexá-lo a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR e transportar o animal para o scanner de ressonância magnética.</li>
	<li>Adquira imagens T1 (ângulo flip = 9 °, tempo de repetição/tempo de eco = 668,6, tamanho da matriz = 192 x 192, espessura da fatia = 1 mm, 80 fatias) para calcular a distância do topo da grade de injeção e da superfície cortical. A cápsula da vitamina E é claramente visível em imagens T1 e deve ser usada como um marcador para a parte superior da grade da injeção (Figura 2a). Utilize a ferramenta de régua do software de imagem MR para medir a distância entre a parte superior da grelha de injecção e a superfície cortical.</li>
	<li>Adquira imagens T2 (ângulo da aleta = 130 °, tempo de repetição/tempo de eco = 52,5, tamanho da matriz = 256 x 256, espessura da fatia = 1 milímetro, 45 fatias) para determinar as guias ideais da cânula para cada local baseado no local alvejado da infusão (Figura 2b-C). Como mencionado mais cedo, a grade da cânula é enchida com o soro fisiológico que é o mais melhor visível em imagens do T2. Usando o software de imagem latente de MR, role através dos planos coronal e sagital para encontrar a posição do alvo da infusão.</li>
	<li>Após descongelamento o vetor viral por algumas horas na temperatura ambiente, misture o vetor viral com o gadotérico do agente de contraste do Sr. (relação de 250:1; 2mm gd-dTpa, veja a tabela dos materiais) pela mistura da pipeta ou do vortex. Nota: A técnica apresentada foi testada para vetores de AAV com um promotor de CamKIIa expressão de condução de C1V1 fundido ao EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, Titer: 2,5 x 1012 moléculas de vírus/ml; ver tabela de materiais).</li>
	<li>Carregue o vírus misto em um tubo de 0,2 mL de alta pressão IV (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Estabeleça um campo estéril fora do varredor do Sr. para preparar a linha viral da infusão.</li>
	<li>Usando a tubulação de alta pressão IV, conecte uma linha de extensão longa (aproximadamente 3-5 medidores, dependendo da posição da bomba da infusão no que diz respeito ao furo do Sr.) a uma seringa MR-Compatible de 3 mL e prima com soro fisiológico.</li>
	<li>Ligue a extremidade distal da linha de extensão longa à extremidade proximal da tubagem 0,2 mL IV carregada com o vírus e prenda a cânula resistente ao refluxo com uma ponta escalonada de 1 mm (Figura 2D; ver secção 5 para instruções de produção da cânula) para a extremidade distal do Este conjunto com um conector do cateter do estilo da braçadeira (veja a tabela dos materiais) (Figura 2e).</li>
	<li>Por último, defina a seringa numa bomba compatível com MR (ver tabela de materiais). Coloque o controlador da bomba na sala de controle do scanner, pois não é compatível com o Sr.</li>
	<li>Usando as imagens anatômicas da linha de base obtidas antes, selecione a localização da grade de injeção da cânula e a profundidade de inserção necessária para atingir o local de infusão alvo. Marque a profundidade de inserção na cânula usando fita estéril.</li>
	<li>Comece a infusão a uma taxa de 1 μL/min e valide visualmente o fluxo do fluido na linha de infusão observando a ejeção do fluido da ponta da cânula.</li>
	<li>Insira a cânula manualmente através da grelha de injecção para a profundidade alvo, mantendo o fluxo na linha de infusão, pois isso impedirá o tecido penetrado de entupimento da cânula durante a inserção.</li>
	<li>Adquira imagens ponderadas em T1 rápidas (2 minutos) (ângulo de aleta = 30 °, tempo de repetição/eco = 3, 5, tamanho da matriz = 128 x 128, espessura da fatia = 1 mm, 64 fatias) para monitoramento on-line da infusão viral do vetor.</li>
	<li>Após a infusão de ~ 10 μL do vetor de tal forma que o vírus suficiente é infundido para detectar no MR scanner, obter imagens de MR para verificar a colocação correta cânula como evidente pela propagação observada do vírus. Se a profundidade da cânula inserida estiver incorreta, ajuste a profundidade de acordo ou remova lentamente a cânula e tente novamente a inserção como em 3,12.</li>
	<li>Monitore a infusão através da orientação de imagens de MR em linha (flash T1 tornado mais pesado) e aumente a taxa de infusão a 5 μL/min por 1 μL/min etapas cada poucos minutos (Figura 3a).</li>
	<li>Após a infusão de aproximadamente 40 μL do vetor viral, começar a reduzir a taxa de perfusão em 1 μL/min passos e parar a perfusão após ~ 50 μL é injetado e deixar a cânula no lugar por 10 minutos.</li>
	<li>Lentamente retire a cânula do cérebro e mover para o próximo local. Repita as etapas 3,9 a 3,19 para cada local.</li>
	<li>Cubra o cilindro com um drapejar estéril na extremidade das injeções, antes do transporte animal. Em seguida, transportar o animal de volta para a sala de operação.</li>
	<li>Explante a câmara MR-Compatible e fecha a incisão cirúrgica substituindo a aleta do osso e o músculo sobrejacente e suturando a pele usando técnicas assépticas padrão ou substitua a câmara com um cilindro Titanium e um dura artificial (veja Yazdan-Shahmorad et al. 20169) para a gravação e estimulação neural.</li>
</ol>4. produção de câmara compatível com MR
<ol><li>Fabricar a grelha de injecção de cânula de náilon (Figura 1a-B) fazendo a usinagem de acordo com as dimensões especificadas (Figura 1 suplementar).</li>
	<li>3D imprimem o cilindro Mr-Compatible fora do estireno do butadieno do acrilonitrila (plástico ABS0 (Figura 1C-E) (Veja o arquivo suplementar 1 – 3; Veja a tabela de materiais para a impressora 3D e os materiais). Nota: Um projeto mantem uma grade fixa da injeção da cânula dentro do cilindro MR-compatible (Figura 1C), quando outro permitir a rotação da grade, estendendo a região da injeção (Figura 1D-E).</li>
	<li>Rosqueie a grade da injeção da cânula e bata a cavidade correspondente da câmara MR-Compatible tal que ambas as partes exibem o mesmo Threading. Nota: Qualquer tipo de Threading pode ser usado desde que ambos os componentes têm o mesmo Threading.</li>
	<li>Insira a grelha de injecção de cânula de nylon aparafusando no orifício roscado do cilindro compatível com MR.</li>
</ol>5. produção de cânula resistente a refluxo13
<ol><li>Corte um tubo de sílica de 30 cm de comprimento com 0,32 mm de ID e 0,43 mm de diâmetro para a tubagem de sílica interna (ver tabela de materiais) utilizando uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Corte um tubo de sílica de 7,5 cm de comprimento e 5 cm de comprimento com 0,45 mm de ID e 0,76 mm de diâmetro para a tubagem de sílica exterior (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Adira a tubulação exterior de 7,5 cm à tubulação interna de 30 cm com cianoacrilato de tal forma que o tubo interno se estende 1 mm além do tubo externo, fazendo o passo resistente ao refluxo (Figura 2D). Para garantir que o cianoacrilato não entra no interior da tubagem interna, coloque o cianoacrilato no exterior da tubagem interior longe da ponta da cânula.</li>
	<li>Cole o tubo de sílica de 5 cm de comprimento na outra extremidade da tubagem interna para fixação ao conector do cateter de estilo Clamp (ver passo 3,10).</li>
</ol>

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</ol>

A PNS tem interesse financeiro na Neuralink Corp., uma empresa que está desenvolvendo terapias clínicas usando estimulação cerebral.

Aqui, nós esboçamos uma técnica viável e eficiente para conseguir a expressão optogenética em grande escala no córtice somatosensory e do motor preliminar de NHP pelo Sr.-guiado CED. O uso da CED guiada por MR apresenta vantagens significativas sobre os métodos tradicionais de infusão viral no cérebro de NHP. Uma dessas vantagens é a capacidade de atingir a expressão em grandes áreas com menos infusões necessárias. Por exemplo, com métodos convencionais, múltiplas injeções de 1-2 μl da expressão de rendimento vetorial em...

Optogenetics é uma ferramenta poderosa que permite a manipulação da atividade neural e o estudo das conexões de rede no cérebro. A implementação desta técnica em primatas não humanos (NHPs) tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da computação neural em grande escala, cognição e comportamento no cérebro do primata. Embora a optogenética tenha sido implementada com sucesso em nhps nos últimos anos1,2,3,4,5,6,7, um desafio que pesquisadores enfrentam está alcançando altos níveis de expressão em grandes áreas cerebrais nesses animais. Aqui, nós estamos fornecendo uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir níveis elevados de expressão optogenética através das grandes áreas do córtice nos macaques. Esta técnica tem um grande potencial para melhorar a atual estudos optogenéticos nestes animais em combinação com o estado-da-arte de gravação8,9 e estimulação óptica10 tecnologias.
O fornecimento aprimorado de convecção (CED) é um método estabelecido de entrega de agentes farmacológicos e outras grandes moléculas, incluindo vetores virais, para o sistema nervoso central11,12,13. Considerando que os métodos convencionais de parto envolvem múltiplas infusões de baixo volume distribuídas em pequenas regiões do cérebro, a CED pode alcançar uma distribuição mais ampla e uniforme do agente com menos infusões. O fluxo de fluido a granel acionado por pressão (convecção) durante a infusão permite transdução mais ampla e uniformemente distribuída do tecido alvo ao entregar vetores virais com CED. Em estudos recentes, nós Demonstramos a transdução e a expressão optogenética subseqüente de grandes áreas do motor preliminar (M1) e dos córtices somatosensory (S1)9 e do tálamo14 usando a ressonância magnética (Sr.)-guiada CED.
Aqui, nós esboçamos o uso de CED para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais com somente algumas injeções corticais.

<table><tbody><tr><td>Tubulação IV de alta pressão de 0,2 mL</td><td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, EUA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0,32 mm de diâmetro, 0,43 mm de diâmetro externo Tubo de sílica</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm de diâmetro interno, 0,76 mm de diâmetro externo Tubo de sílica</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, Universidade da Pensilvânia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS plástico</td><td>Stratasys, MN, EUA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Cortina antimicrobiana para inciso</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban Drape</td></tr><tr><td>Dental Acrílico</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Elevadores de agente de ligação acrílico</td></tr><tr><td></td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Elevador Langenbeck,</td></tr><tr><td>sutura fina</td> de ponta larga <td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Laser para estimulação de luz</td><td>Omicron-Laserage, Alemanha</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR compatível com seringa de 3 cc</td><td>Aparelho Harvard, Holliston, MA, EUA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem MR</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>compatível com MR Bomba</td><td>Aparelho Harvard, Holliston, MA, EUA</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico compatível com RM</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td><td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos de plástico</td><td>Plásticos 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>Parafusos de nylon</td></tr><tr><td>Parafusos de titânio</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Parafusos ósseos auto-roscantes</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,</td> <td>SKU: GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE Impressora 3D</td><td>Stratasys, MN, EUA</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula de vitamina E</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina absorvível estéril úmida</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Gelfoam</td></tr></tbody></table>

a convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado optogenetic ao córtice de rhesus macaque a orientação de imagens em linha de mri

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

No primata não-humano (NHP) optogenética, infectando grandes áreas corticais com vetores virais é muitas vezes uma tarefa difícil e demorada. Aqui, Nós demonstramos o uso de ressonância magnética (RM)-guiada por convecção reforçada de entrega (CED) de vetores virais optogenéticos em córtices primários somatosensorial (S1) e motor (M1) de macacos para obter uma expressão cortical eficiente e generalizada de canais iônicos sensíveis à luz. Os vetores virais adeno-associados (AAV) que codificam o opsina vermelho-deslocado C1V1 fundidos à proteína fluorescente amarela (EYFP) foram injetados no córtice de macacos do rhesus o Sr.-guiado CED. Três meses após a infusão, a imagem latente epifluorescente confirmou grandes regiões da expressão optogenética (> 130 milímetros2) em M1 e em S1 em dois macaques. Além disso, nós pudemos gravar respostas luz-evocadas confiáveis da electrofisiologia das áreas expressando usando matrizes micro-electrocorticographic. A análise histológica mais atrasada e a imunomarcação de encontro ao repórter revelaram a expressão optogenética difundida e densa em M1 e em S1 que correspondem à distribuição indicada pela imagem latente epifluorescente. Esta técnica permite-nos obter a expressão através das grandes áreas do córtice dentro de um período de tempo mais curto com dano mínimo comparado às técnicas tradicionais e pode ser uma aproximação óptima para a entrega viral optogenética em grandes animais tais como nhps. Esta aproximação demonstra o grande potencial para a manipulação do rede-nível de circuitos neural com célula-tipo especificidade em modelos animais evolutionarmente perto dos seres humanos.

Fornecimento aprimorado de convecção (CED) orientação de RM
A disseminação do vetor viral foi monitorada durante a infusão de CED a orientação de imagens de MR on-line (Figura 3a). Neste estudo, S1 e M1 de dois macacos foram direcionados (Figura 3B). Os volumes de distribuição tridimensional foram estimados em uma análise post-hoc das imagens de MR (<st...

Aqui, nós Demonstramos a ressonância magnética (Sr.)-a entrega aumentada da convecção guiada (CED) de vetores virais no córtice como uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais no cérebro do macaque.

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

A convecção aprimorada da entrega, ou CED, de vetores virais optogenéticos em primatas não humanos permitirá que os pesquisadores manipulem a atividade neural em larga escala para entender computaçãos e comportamentos neurais complexos. Com CED podemos alcançar alta expressão optogenética em grandes regiões do cérebro primata com apenas algumas injeções em um curto espaço de tempo em comparação com os métodos tradicionais. A ressonância magnética ou implantação de câmara compatível com Mr é realizada utilizando-se a prática padrão em cirurgias de primatas não humanos, o procedimento é descrito detalhadamente no protocolo de texto e delineado brevemente neste vídeo.Após sedação animal, posicionamento e incisão inicial, conforme descrito no protocolo de texto, crie uma craniotomia circular para cobrir as trajetórias pré-planejadas para injeções usando uma trefina. Crie um recuo no centro da craniotomia planejada suficientemente profunda no crânio para ancorar a trefina usando o ponto de centro ajustável da trefina. Uma vez feito o centro, abaixe a trefina sobre o crânio e gire a trefina no sentido horário e anti-horário, aplicando pressão para baixo até que a tampa óssea possa ser removida com fórceps.Depois de levantar a dura como detalhado no protocolo de texto, corte a dura do centro até a borda da craniotomia e continue ao longo da borda com uma tesoura oftálmica fina. Monte a convecção cilíndrica feita sob medida de entrega de câmara compatível com MR ao crânio em cima da craniotomia para fornecer suporte à cânula durante a infusão de tal forma que a curvatura da flange da câmara se alinha bem com a curvatura do crânio. Fixar os implantes no crânio usando parafusos plásticos e acrílicos dentários ou alguns parafusos de titânio.Logo após implantar a câmara compatível com Mr e inserir a grade de injeção de cânula na câmara, encha a grade com soro fisiológico de 0,9% para visualizar os locais de injeção através de imagens anatômicas mr. Preencha também as cavidades da câmara com espuma de gel absorvível estéril úmida para manter a umidade do cérebro. Cubra a pele e o cilindro com uma cortina de incisão antimicrobiana estéril para manter a esterilidade dos cilindros durante o transporte e as infusões de MR.Coloque uma cápsula de vitamina E para marcar o topo da rede de injeção para identificação positiva. Enquanto o animal permanece entubado, retire o tubo endotraqueal do circuito de anestesia e recoloque-o em uma máquina de isoflurane compatível com MR portátil. Transporte o animal para o scanner de ressonância magnética.Adquira imagens T1 para calcular a distância do topo da grade de injeção e da superfície cortical. A cápsula de vitamina E é claramente visível em imagens T1 e deve ser usada como um marcador para o topo da grade de injeção. Adquira imagens T2 para determinar os guias de cânula ideal para cada local com base no local alvo da infusão.A grade da cânula é preenchida com soro fisiológico que é melhor visível em imagens T2. Usando o software de imagem MR, percorria os planos coronal e sagital para encontrar o local alvo da infusão. Depois de descongelar o vetor viral por algumas horas à temperatura ambiente, misture o vetor viral com o agente de contraste MR gadoteridol por pipeta ou mistura de vórtice.Carregue o vírus misto em tubos iv de alta pressão de 0,2 mililitro. Utilizando tubos IV de alta pressão, conecte uma longa linha de extensão a uma seringa de três mililitros compatível com MR e prime com soro fisiológico. Conecte a outra extremidade da tubulação de extensão longa ao tubo iv de 0,2 mililitro carregado com o vírus.Em seguida, conecte a cânula resistente ao refluxo com uma ponta pisada de um mililitro na extremidade distal deste conjunto com um conector de cateter estilo grampo. Por fim, coloque a seringa em uma bomba compatível com MR. Utilizando as imagens mr anatômicas da linha de base obtidas, selecione o local da grade de injeção de cânula e a profundidade de inserção necessária para chegar ao local de infusão de destino.Marque a profundidade de inserção na cânula usando fita estéril. Inicie a infusão a uma taxa de um microliter por minuto e valide visualmente o fluxo do fluido na linha de infusão observando a ejeção de fluido da ponta da cânula. Insira a cânula manualmente através da grade de injeção até a profundidade do alvo, mantendo o fluxo na linha de infusão, pois isso impedirá que o tecido penetrado entupida a cânula durante a inserção.Agora, adquira imagens rápidas de flash T1 para monitoramento on-line da infusão de vetor viral. Depois de infundir aproximadamente 10 microliters do vetor de tal forma que o vírus suficiente é infundido para detectar no scanner mr, obtenha imagens de MR para verificar a colocação correta da cânula, conforme evidente pela propagação observada do vírus. Se a profundidade da cânula inserida estiver incorreta, ajuste a profundidade de acordo ou lentamente remova a cânula e ressarca a inserção.Monitore a infusão através de orientação de imagens de MR on-line. Aumente a taxa de infusão para cinco microliters por minuto por um microliter por minuto a cada poucos minutos. É importante aumentar a taxa de infusão lentamente e não exceder cinco microliters por minuto, pois altas taxas de infusão podem causar danos teciduais.Depois de infundir aproximadamente 40 microliters do vetor viral, comece a reduzir a taxa de infusão em um microliter por minuto. Pare a infusão depois que aproximadamente 50 microliters são injetados. Deixe a cânula no lugar por dez minutos.Remova lentamente a cânula do cérebro e vá para o próximo local. Cubra o cilindro com uma cortina estéril no final das injeções antes do transporte animal e, em seguida, transporte o animal de volta para a sala de cirurgia. Análises histológicas em seções coronárias seriais revelam expressão optogenética em larga escala ao redor dos locais de infusão.Aqui está a imagem de MR coronal da linha de base e a disseminação do agente de contraste após a infusão para a mesma fatia coronal mr. Uma seção de tecido coronal é mostrada aproximadamente a mesma. A coloração de peroxidase reflete a expressão da proteína fluorescente amarela ou repórter da EYFP.Observa-se bom alinhamento entre a área de expressão EYFP, medida com epifluorescência superficial e com coloração histológica. Estes incluem a região de difusão vetorial estimada a partir de imagens mr. Pontos brancos indicam locais de injeção e toda a região negra representa a área exposta pela craniotomia.Aqui mostrada está uma imagem de baixa ampliação das seções coronais manchadas com anticorpo anti GFP mostrando o aspecto lateral medial da expressão YFP no córtex somatosensorial. A ponta da flecha preta indica a localização da faixa da cânula. O tecido adjacente é mostrado em maior ampliação para mostrar distribuição laminar das células positivas YFP.Regiões densamente povoadas de células positivas YFP estão localizadas predominantemente em camadas de dois a três e cinco a seis. O alargamento adicional revela células piramipúneis típicas nas camadas dois a três, camada cinco e camada seis. É importante deixar a cânula no lugar por 10 minutos após o fluxo parar.Isso garantirá que o vírus tenha percolado no tecido neural alvo circundante. CED é uma abordagem eficiente para alcançar níveis de expressão uniformemente altos em grandes regiões cerebrais em mamíferos. Tem o potencial de expandir nossa compreensão de circuitos neurais e conectividade.Após a transdução viral por CED, experimentos subsequentes de estimulação optogenética podem ser emparelhados com gravação elétrica e ensaios comportamentais para revelar a dinâmica complexa do circuito dentro do cérebro. Esta técnica foi anteriormente empregada por Yazdan-Shahmorad e colegas em 2018, na qual a modulação neural optogenética foi usada para induzir mudanças de conectividade amplas na rede no córtex motor sensorial.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Este protocolo descreve as etapas e a análise de dados necessárias para realizar com sucesso a ressonância magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI é uma nova técnica que combina leitura de fMRI de alto campo com estimulação optogenética, permitindo o mapeamento específico do tipo de célula de circuitos neurais funcionais e sua dinâmica em todo o cérebro vivo.

Ressonância magnética funcional optogenética

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.

Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Uma nova técnica para entrega generalizada de vírus adeno-associado que usa infusão de vírus subaracnóideo é descrita. Este método não apenas garante a transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos em camadas superficiais, mas também resulta na expressão seletiva do transgene em neurônios piramidais da camada cinco, mesmo quando se usa um promotor não seletivo.

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.

Um Método Integrado para Modelagem de AVC Fototrombótico e Registro In Vivo de Optrode da Atividade Neuronal e Astrocítica em Ratos Comportando-se

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Aprenda a entrega por convecção aumentada guiada por RM de vetores virais optogenéticos no córtex de macacos Rhesus. Este método permite a manipulação da atividade neural em larga escala para estudar circuitos cerebrais complexos.

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI (Vídeo) | JoVE Journal

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

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