Name: Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a analisar células-tronco neurais adultas usando manipulação quimigenética de circuitos neurais específicos. Este método permite estudar como a estimulação ou inibição de circuitos afeta a neurogênese adulta no hipocampo.

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L.J.Q. foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde mental dos institutos nacionais de saúde o suplemento de diversidade R01MH111773, bem como uma subvenção de formação T32 T32NS007431-20. Este projeto foi apoiado das concessões concedidas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160, e NS104530).

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Os autores não têm nada a revelar.

O objetivo deste protocolo é avaliar como manipular circuitos neurais específicos regula a neurogênese hipocampal adulta in vivo usando uma série de técnicas immunohistochemistry. O Regulamento dependente da atividade de assaying da neurogênese adulta mediada por circuitos neurais específicos é uma técnica valiosa com grande potencial para que as modificações estudem uma escala diversa de circuitos neural. O sucesso destes tipos de experimentos depende de vários fatores, incluindo a entrega viral exata, a seleção viral a...

A neurogênese adulta é um processo biológico pelo qual novos neurônios nascem em um adulto e integrados nas redes neurais existentes1. Nos seres humanos, este processo ocorre no giro dentado (DG) do hipocampo, onde cerca de 1.400 novas células nascem a cada dia2. Estas células residem na parte interna da DG, que abriga um nicho neurogênico, denominado zona zona (SGZ). Aqui, células-tronco neurais adultas hipocampais (NSCs) passam por um processo complexo de desenvolvimento para se tornarem neurônios totalmente funcionais que contribuem para a regulação de funções cerebrais específicas, incluindo aprendizagem e memória, regulação do humor e resposta ao estresse3 ,4,5,6. Para influenciar comportamentos, os NSCs adultos são altamente regulados por vários estímulos externos de uma forma dependente da atividade, respondendo a uma variedade de pistas químicas locais e distais. Estas pistas químicas incluem neurotransmissores e Neuromoduladores e atuam em um circuito de maneira específica de várias regiões cerebrais. Importante, a convergência de circuito largo destes sinais químicos em NSCs permite o regulamento original e preciso da ativação, da diferenciação, e das decisões do Fate da pilha de haste.
Uma das maneiras mais eficazes de interrogar a regulação do circuito de NSCs adultos in vivo é através da análise de imunofluorescência de emparelhamento com manipulações de circuito largo. A análise da imunofluorescência de NSCs adultos é uma técnica comumente utilizada, onde os anticorpos contra marcadores moleculares específicos são usados para indicar o estágio de desenvolvimento de NSCs adultos. Estes marcadores incluem: Nestin como uma pilha radial do glia e um marcador neural adiantado do progenitor, Tbr2 como um marcador intermediário do progenitor, e DCX como um marcador do neuroblast e do neurônio imaturo7. Adicionalmente, através da administração de análogos da timidina como BrdU, Cidu, IDU e edu, as populações de células submetidas à fase S podem ser rotuladas individualmente e visualizadas8,9,10. Combinando essas duas abordagens, uma ampla gama de perguntas pode ser investigada, variando de como a proliferação é regulada em estágios específicos de desenvolvimento, a forma como várias pistas afetam a diferenciação de NSC e a neurogênese.
Existem várias opções para manipular eficazmente os circuitos neurais, incluindo a estimulação elétrica, optogenética e quimiogenética, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. A estimulação elétrica envolve uma cirurgia extensiva onde os elétrodos estão implantados a uma região específica do cérebro que sejam usadas mais tarde para transmitir sinais elétricos para modular uma região alvejada do cérebro. No entanto, esta abordagem carece de especificidade celular e de circuito. A optogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor ativado por luz que é estimulado por um laser emitido através de uma fibra óptica implantada, mas requer manipulações extensas, grande custo e cirurgias complexas11. A quimiogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor de designer ativado exclusivamente por drogas de grife ou DREADDs, que são subsequentemente ativados por um ligador específico e biologicamente inerte conhecido como N-óxido de clozapina (CNO)12 . A vantagem de utilizar DREADDs para manipular circuitos neurais locais que regulam NSCs adultos reside na facilidade e várias rotas de administração CNO. Isto permite uma aproximação menos demorada com manipulação animal reduzida, que é facilmente adaptável para estudos a longo prazo para modular circuitos neural.
A aproximação descrita neste protocolo é uma coleção detalhada de vários protocolos exigidos para interrogar com sucesso a regulação do circuito da neurogênese hippocampal adulta que combina técnicas da imunofluorescência e manipulações do circuito usando a quimiogenética. O método descrito no seguinte protocolo é apropriado para estimular ou inibir um ou vários circuitos simultaneamente in vivo para determinar sua função reguladora na neurogênese adulta. Essa abordagem é melhor usada se a pergunta não precisar de um alto grau de resolução temporal. As perguntas que exigem o controle temporal preciso da estimulação/inibição em uma determinada freqüência, podem melhor ser endereçadas usando o optogenetics13,14. A aproximação descrita aqui é adaptada facilmente para estudos a longo prazo com manipulação animal mínima especial onde o stress é uma preocupação principal.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 Poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 Poços</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-Etinil-2'-desoxiuridina (Edu)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>Álcool 70% Isopropil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Frango Nestin</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cabra DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Tbr2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: Solução de AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (iodopovidona)</td><td>Estoque</td> de ácido cítrico da Amazônia <td></td><td></td></tr><tr><td>[.1M] Ácido cítrico (21g/L de ácido cítrico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina N-Óxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Software Confocal (Zen Black)</td><td>Zeiss Microscopia</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (preto)</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) Pentahydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de Algodão</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>Limpeza de Tarefa Delicada Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Broca 0,5 mm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Hamilton 2 polegadas</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 5 &mu; L Modelo 75 RN</td><td>Hmailton Company</td><td>Ref: 87931</td><td></td></tr><tr><td>Broca de Alta Velocidade</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Infusão</td><td>Harvard Aparelho</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Injetável</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Insulina</td><td>BD Seringas de Insulina Ultrafinas</td> Isoflurano <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax Para Instrumentos</td><td>KOPF de Pequenos Animais</td><td>Modelo 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microtomo</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (Produto de Depilação)</td> <td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldaído 4%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus Charged Slide</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tamponada de Fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Pomada Puralube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack 20 unidade de slides</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Rack de Slides</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento para pequenos animais</td><td>K & H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Caneta 4 mm ponta</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Cirúrgico</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tamponada Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de trissódio Estoque [0,1 M] Citrato de trissódio (29,4g/L citrato de trissódico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond Adesivo de Tecido</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

A neurogênese adulta é um processo dinâmico pelo qual as células-tronco neurais recém-ativadas (NSCS) na zona zona (SGZ) do giro dentado (DG) geram novos neurônios, que se integram em um circuito neural existente e contribuem para funções hipocampais específicas . É importante ressaltar que a neurogênese adulta é altamente suscetível a estímulos ambientais, o que permite a regulação dependente da atividade de várias funções cognitivas. Uma vasta gama de circuitos neurais de várias regiões do cérebro orquestrates estas funções cognitivas complexas. Portanto, é importante entender como os circuitos neurais específicos regulam a neurogênese adulta. Aqui, nós descrevemos um protocolo para manipular a atividade do circuito neural usando o receptor do desenhador ativado exclusivamente pela tecnologia das drogas do desenhador (dreadds) que regula NSCS e o progênie recém-nascido nos roedores. Este protocolo detalhado inclui a injeção Stereotaxic de partículas virais, a estimulação chemogenetic de circuitos neural específicos, a administração análoga do timidina, o processamento do tecido, a rotulagem da imunofluorescência, a imagem latente confocal, e a imagem latente análise de vários estágios de células precursoras neurais. Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre técnicas da recuperação do antígeno usadas para visualizar NSCS e seus progênie e descreve uma maneira simples, contudo eficaz de modular circuitos do cérebro usando o N-óxido do Clozapine (CNO) ou CNO-que contem a água bebendo e Vírus que expressam DREADDs. A força deste protocolo reside na sua adaptabilidade para estudar uma gama diversificada de circuitos neurais que influenciam a neurogênese adulta derivada de NSCs.

Seguindo os procedimentos experimentais descritos acima (Figura 1a,B), pudemos determinar os efeitos de estimular projeções de células Mossy contralaterais no nicho neurogênico dentro do hipocampo. Usando um CRE-dependente GQ-acoplado estimulando o vírus de DREADD emparelhado com uma pilha Mossy que etiqueta 5-HT2A CRE-linha, nós pudemos ativar seletivamente projeções excitatórias das pilhas Mossy na DG contralateral e determinamos que a pilha Mossy forte estimulação promove...

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Este protocolo pode responder como vários circuitos no cérebro regulam neurogênese adulta e especificamente como estimular ou inibir circuitos neurais afetam a proliferação de células-tronco neurais adultas. A vantagem dessa técnica é que ela é capaz de atingir especificamente circuitos neurais desejados, bem como reduzir a quantidade de estresse introduzido aos animais. Este método pode fornecer uma visão de como diferentes circuitos cerebrais regulam a neurogênese adulta, em particular, como tipos de células específicas que liberam certos neurotransmissores regulam a proliferação de células-tronco neurais adultas.Para iniciar este procedimento, coloque as seções teciduais em PBS e monte cinco a oito seções em um slide carregado positivamente em ordem serial de anterior para posterior. Deixe as seções de tecido secarem à temperatura ambiente por dois a cinco minutos e adere completamente aos slides. Em seguida, prepare o tampão de citrato em um recipiente.Aqueça o tampão de citrato em um forno micro-ondas por cinco minutos até que a solução esteja fervendo. Enquanto isso, coloque as seções montadas em um porta-slides de vidro. Após cinco minutos, coloque cuidadosamente o suporte d

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Células-tronco neurais foram preparadas a partir do hipocampo de adultos não-hibernando yearling esquilos do Ártico (AGS). Essas células-tronco neurais pode ser expandida através de numerosas passagens, diferenciados e mantidos como um neurônio quase 50:50 para a cultura da glia.

Crescimento e Diferenciação de Adultos Hippocampal terra ártico Squirrel células-tronco neurais

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Durante a neurogênese do hipocampo adulto, um conjunto distinto de marcadores genéticos é expresso quando uma célula-tronco neural quiescente progride sequencialmente e se desenvolve em um neurônio funcionalmente integrado no circuito. Usando a recuperação de antígeno induzida por calor, os tipos de células progenitoras que são difíceis de detectar são identificados com maior eficácia.

Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

O cérebro canino é um modelo valioso para estudar a neurogênese adulta. Aqui apresentados são protocolos para isolar e expandir adultos células precursoras neurais do hipocampo caninos a partir de tecido cerebral primário.

Isolamento e Expansão da mediana Canino hipocampo Neurais Precursores

A dissecção crio-seção permite a preparação fresca e congelada do maior nicho neurogênico do cérebro murino para análise profunda de proteome quantitativo. O método é preciso, eficiente e causa perturbação mínima do tecido. Portanto, é ideal para estudar o microambiente molecular desse nicho, bem como outros órgãos, regiões e espécies.

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Aprenda a analisar células-tronco neurais adultas usando manipulação quimigenética de circuitos neurais específicos. Este método permite estudar como a estimulação ou inibição de circuitos afeta a neurogênese adulta no hipocampo.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

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