Name: Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda o protocolo SWIP para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans. Este método permite identificar genes relacionados à sinapse dopaminérgica e investigar os efeitos do excesso de dopamina extracelular.

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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Osama Refai do laboratório do Dr. Randy Blakely para orientação com a análise automatizada de SWIP. Este trabalho foi financiado por fundos do NIH R01 DA042156 para LC.

1. preparação de soluções e meios de comunicação
<ol><li>Preparar a M9 reserva dissolvendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e g NaCl 5.0 (85,5 mM) em 1 litro de água destilada esterilizada. Adicione 1,0 mL de 1m MgSO4 (12 g em um volume final de 100 mL de água deionizada esterilizada) após a esterilização em autoclave. Mistura de 100 mL do resultante x 10 M9 com 900 mL de autoclavados deionizada para fazer uma solução de 1x.</li>
	<li>Para fazer a reserva do ovo, dissolva 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g de MgCl2-6 H2O (2 mM) e 5,958 g (25 mM) de HEPES em 1 litro de água destilada esterilizada. Ajuste o pH para 7,3 usando NaOH.</li>
	<li>Prepare a solução de hipoclorito de sódio/NaOH fresco, adicionando 1 mL de 5-6% de hipoclorito de sódio (água sanitária) e 180 µ l de 10 N de NaOH a 3,8 mL de água desionizada.</li>
	<li>Pesar de sacarose de 60 g e dissolver em água deionizada esterilizada até um volume final de 100 mL para fazer 60% de solução de sacarose.</li>
	<li>Dissolva 0,684 g de sacarose em 10 mL de água desionizada autoclavada tornar sacarose 200 mM. Verificar e ajustar para o mesmo uma osmolaridade usando aparelhos. Fazer alíquotas de 1 mL em 1,5 mL microcentrifuge tubos e congelar a-20 ° C.</li>
	<li>Pesar, 0,184 g de ANF (peso molecular 184.75 g/mol) e dissolver em 10 mL de água desionizada, tornar-se uma solução estoque de 100 mM. Misture 2 µ l da solução estoque em 400 µ l de água para fazer a solução de trabalho de 0,5 mM.</li>
	<li>
Preparar o crescimento nutriente placas de mídia (NGM)
	<ol>
<li>Mix 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptona, 25 g de bacto ágar e 975 mL de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L. Inclua uma barra de agitação magnética e autoclave (121 ° C, 15 PSI) por 1 hora usando ciclo de líquido.</li>
		<li>Arrefecer e manter a temperatura a cerca de 50 ° C, colocando o frasco em um aquecedor, agitando. Adicionar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2 e 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g de K2HPO4 deionizada para 1 L).</li>
		<li>Pipetar 25 mL cada para placas de Petri 100 x 15 mm e permitir que os meios de comunicação solidificar. Armazene as placas de cabeça para baixo a 4 ° C em uma caixa por até 4 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de caldo de caldo de carne (LB) lisogenia
	<ol>
<li>Dissolva 5 g de mistura de pó LB em 200 mL de água deionizada em um balão de Erlenmeyer. Ciclo de autoclave para 30 minutos utilizando a esterilização de líquidos. Deixe o caldo esfriar. Armazenar em temperatura ambiente por 1-2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação das placas bacterianas NA22
	<ol>
<li>Use uma ponta de pipeta estéril ou um loop bacteriano estéril para marcam uma placa LB com um pequeno volume de NA22 Escherichia coli bactérias do estoque de glicerol e incubar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para crescer colónias isoladas. Pegam e introduzir uma única colônia em 200 mL de caldo LB preparado no passo 1.8 e deixe crescer durante a noite a 37 ° C em uma plataforma de agitação.</li>
		<li>Para propagar as placas, dispense 200 µ l de cultura bacteriana nas chapas de NGM preparado anteriormente na etapa 1.7 e espalhar com um taco de hóquei de vidro estéril. Deixe as placas secar durante a noite ou mais sob um capuz e armazenar de cabeça para baixo em uma caixa hermética a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tornar a ferramenta Pestana/platina para pegar vermes, cola um cílio grosso ou um filamento de platina em um vidro Pasteur pipeta usando super bonder. Corte a ponta da pestana em ângulo usando uma lâmina de barbear. Alternativamente, um bico de Bunsen pode ser usado para derreter a ponta da pipeta de vidro em torno do filamento de platina.</li>
</ol>2. criação de c. elegans
Nota: Cultura do selvagem-tipo N2C. elegans estirpe em placas de NA22 de Escherichia coli . Os métodos de cultura detalhadas são descritos abaixo.
<ol><li>
Preparação da cultura worm
	<ol>
<li>Para fazer uma cultura de vermes, cortar um pequeno pedaço de ágar de uma placa contendo animais bem alimentados e transferi-lo em uma placa de bactérias NA22 Escherichia coli preparada na etapa 1.9 usando uma espátula estéril. Incube as placas a 20 ° C por 3-4 dias. Sob um microscópio estéreo, confirme visualmente a presença de adultos gravid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da população sincronizada de vermes
	<ol>
<li>Colete gravid adultos de pelo menos 2 placas pelo fornecimento de água deionizada esterilizada ao redor da placa usando uma garrafa de esguicho. Agite suavemente a placa para desalojar os vermes e coletar os vermes em um tubo cônico poliestireno 15 mL com uma pipeta descartável de plástico.</li>
		<li>Girar o tubo em uma centrífuga a 140 x g por 2 min para os vermes de pelotas e, em seguida, Aspire o sobrenadante usando uma bomba de vácuo ou com construído no vácuo de laboratório.</li>
		<li>Ressuspender e lave os vermes, preenchendo o tubo com água destilada esterilizada e mistura e centrifugar 140 x g por 2 min. Aspire o sobrenadante e repetir este último passo dois mais vezes ou até vermes são claras de bactérias (água parece clara quando misturado com os vermes).</li>
		<li>Adicionar 5 mL de solução de hipoclorito de sódio/NaOH recém-feitos (etapa 1.3) para a pelota de minhoca e misture rapidamente usando um vórtice. Incube o tubo em um balancim para cerca de 4-8 min. O tempo de incubação com solução de hipoclorito de sódio/NaOH oscila entre 4-8 minutos, baseados na qualidade da solução estoque de hipoclorito de sódio (água sanitária).</li>
		<li>Coloque uma gota (2-50 µ l) de solução contendo worms em um vidro de microscópio e verificar cada 2min sob o microscópio para lise de verme. Quando cerca de 70% dos vermes lysed e ovos são liberados, preencher o tubo com buffer de ovo preparado na etapa 1.2 e imediatamente Centrifugue durante 1 min a x 140 g para os embriões de pelotas e carcaças de verme.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento 3 vezes mais preenchendo cada vez que o tubo com buffer de ovo. Spin para baixo a 140 x g por 1 min e retirar o sobrenadante de cada vez. A pelota fica branca no final de lavagens.</li>
		<li>Após a lavagem final, separe os embriões as carcaças mortas em 30% de solução de sacarose. Adicionar 5 mL de água destilada esterilizada ao pellet, resuspenda e adicionar 5 mL de 60% de sacarose preparada na etapa 1.4. Misture bem e centrifugar a 160 x g durante 6 minutos.</li>
		<li>Use um pipeta Pasteur de vidro para transferir os embriões flutuando no menisco superior em um tubo cónico de 15 mL. Não tome mais de 3-4 mL. Para remover qualquer restante sacarose, lave os embriões 3 vezes com água esterilizada por centrifugação a 140 x g durante 3 min, remover o sobrenadante e resuspending a pelota (e o tubo de enchimento) cada vez.</li>
		<li>Repita as lavagens com 1 x M9 de buffer. Após a lavagem final, resuspenda o pellet em 10 mL de M9. Deixe os tubos num agitador durante a noite (não mais que 14 h) para os ovos, que eclodem em larvas de L1. Worms permanecerá em fase larval L1 devido à falta de comida.</li>
		<li>Larvas de lavagem a L1 3 vezes com água esterilizada para remover qualquer feromônios liberados pelas larvas por centrifugação a 140 x g por 2 min. Ressuspender as larvas em 1 mL de água. Fazer um 01:10 diluição dos vermes na água, Pipetar uma queda de 10 µ l em uma lâmina de vidro, colocar uma lamela e contar o número de minhocas sob um estereoscópio. Repita isso duas vezes e a média dos resultados.</li>
		<li>Pipetar o volume de vermes que corresponde a cerca de 1.000 worms em um prato de NA22 (que anteriormente foi trazido à temperatura ambiente) colocando pequenas gotas na placa. Deixe a placa entreabertas até seca a gota. Em seguida, cobrir a placa e incubadora de 20 ° C por cerca de 44-48 h ou até que os vermes chegam a fase tardia de L4, tal como foi confirmado visualmente sob um estereomicroscópio, incubar de cabeça para baixo. Agora os vermes estão prontos para ser testado para SWIP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SWIP
Nota: Descrevemos o método manual de avaliação SWIP em selvagem-tipo worms tratados com ANF. Discutimos também brevemente o rastreamento de vermes e posterior análise da cinética de worm usando um rastreador de worm automatizado e um software de rastreamento que anteriormente foram descritos por Hardaway et al10.
<ol><li>
Método manual para testar SWIP
	<ol>
<li>Alíquota de 40 µ l de solução de sacarose, 200 mOsm/L com ou sem 0,5 mM ANF em uma placa de ponto de vidro. Sob o estereoscópio, pick 8-10 tarde-L4 palco vermes com um cílio ou platina escolher e mergulhe a palheta na placa contendo a solução até vermes saiam a palheta e nadam na solução. Anote o número de minhocas que escolheu para o poço, iniciar o temporizador, observar e registrar o número de vermes exibindo SWIP em cada minuto marca.</li>
		<li>Copie os dados brutos em uma planilha e calcular a porcentagem de vermes paralisados, dividindo o número de vermes paralisado no cada minuto pelo número total de vermes testados durante todo o ensaio e multiplique por 100. Copiar os valores de porcentagem para quaisquer gráficos e enredo e software estatístico os dados com valores de porcentagem no eixo Y e tempo no eixo utilizando o gráfico XY X formato.</li>
		<li>Execute a ANOVA de duas vias seguido de análise post-hoc (por exemplo, Bonferroni pós-teste) para testar a significância estatística entre controle, grupos de ANF e tempo de tratamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise automatizada de SWIP
	<ol>
<li>Execute análise automatizada em um único verme de cada vez. O protocolo para definir câmera, o software do tracker worm e o script para executar o software de rastreamento análise são descritas em detalhes no Hardaway et al.16.</li>
		<li>Brevemente, coloque uma hermafrodita de fase única tarde L4 em uma placa de vidro local utilizando um furador de cílios, conforme descrito no método manual na seção 3.1.2. Gravar vídeos de natação de um verme no momento e usar o software tracker worm para calcular a frequência das curvas do corpo.</li>
		<li>Siga o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de goleada do worm e para gerar mapas de calor a partir dos dados de goleada do worm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li>
<li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Transporter%2FSyntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).</li>
<li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li>
<li>Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRefai%2C+O+%22Neurochemistry+International%22">Neurochemistry International</a>. , (2018).</li>
<li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13%2FERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li>
<li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li>
<li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).</li>
<li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li>
<li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li>
<li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li>
<li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+%2F+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li>
<li>Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li>
<li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+%28TSP-17%29+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).</li>
<li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para realizar um ensaio comportamental, SWIP, em c. elegans. Este protocolo é simples e direta com nenhum obstáculos técnicos tornando este usuário de ensaio muito amigável. No entanto, existem alguns aspectos essenciais que precisam ser considerados para efetivamente realizar o ensaio.
Deve ter cuidado para garantir que os vermes que usada para o ensaio são bem alimentados, desde que a restrição dietética afeta SWIP17</su...

Animais executam uma variedade de comportamentos inatos e complexas que são mediadas por neurotransmissores diferentes, coordenados por intrincados processos de sinalização. A neurotransmissor dopamina (DA) Medeia comportamentos altamente conservados entre espécies, incluindo a aprendizagem, a função motora e processamento de recompensa.
C. elegans, o nematódeo de solo com um sistema nervoso bem mapeado e relativamente simples consistindo de apenas 302 neurônios, mostra comportamentos marcadamente complexos, incluindo muitos que são regulados pelo DA como acasalamento, aprendendo, forrageamento, locomoção e postura de ovos 1. entre outras características, ciclo de vida curto, facilidade de manuseio e conservação de moléculas de sinalização, destacar as vantagens do uso de c. elegans como modelo para estudar a base neural dos comportamentos conservadas.
O hermafrodita c. elegans contém oito neurônios dopaminérgicos; Além desses, o macho contém seis pares extras para fins de acasalamento. Como em mamíferos, estes neurônios sintetizam DA e expressam o transportador DA (DAT-1), uma proteína de membrana encontrada exclusivamente em neurônios dopaminérgicos, que transporta DA liberada na fenda sináptica volta para os neurônios dopaminérgicos. Além disso, a maioria das proteínas envolvidas em cada etapa da síntese, a embalagem e a liberação DA é altamente conservada entre os vermes e os seres humanos e, como nos mamíferos, DA modula comportamentos de alimentação e locomoção em c. elegans2.
C. elegans rasteja sobre superfícies sólidas e nada com um comportamento característico de goleada na água. Curiosamente, mutantes, falta de expressão do DAT-1 (dat-1) rastejam normalmente na superfície sólida, mas não conseguem sustentar natação quando imerso em água. Este comportamento foi denominado paralisia induzida de natação, ou SWIP. Experiências anteriores demonstraram que SWIP, em parte, é causado por um excesso na fenda sináptica que, finalmente, estimula os receptores pós-sinápticos D2-like (DOP-3). Embora originalmente identificado em dat-1 nocaute animais3, SWIP também é observado no tipo selvagem animais tratados com drogas que bloqueiam a atividade de DAT (por exemplo, imipramina4) e/ou induzir DA liberação (por exemplo, anfetaminas5). Por outro lado, manipulações farmacológicas ou genéticas evitando a síntese e liberação DA e DOP-3 receptor função de bloqueio impedem SWIP6. Tomados em conjunto, estes dados já publicados estabeleceram SWIP como uma ferramenta confiável para estudar os efeitos comportamentais causados pela mutação proteínas dentro dopaminergic sinapses3,4,7 e a ser empregado para telas de genéticas para a frente para a identificação das vias reguladoras romance envolvidas em DA sinalização7,8,9,10,11,12. Além disso, fornecendo uma leitura facilmente quantificável de comportamento induzido em animais vivos, SWIP permite a elucidação dos mecanismos de ação de drogas como anfetaminas (ANF) e azaperona no dopaminérgico sinapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolos para a realização de ensaios os SWIP têm sido descritos antes16. Aqui, descrevemos em detalhe a metodologia e a instalação para realizar o ensaio com o objetivo de fornecer um guia visual para a comunidade de c. elegans executar eficazmente SWIP.

<table><tbody><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Reynolds 1091835</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfetamina</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Autoclave</td><td></td><td></td> Bacteriana New Brunswick scientific M1352-0000 <td></td></tr> Grau <tr><td></td> bacteriológico, Agar Lab Scientific, Inc&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Peptona</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio (di-hidratado)</td> <td>Câmera Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrífuga Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>Depressão placa de vidro Corning</td><td></td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>Cílios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Software gráfico e estatístico</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito</td><td>Hawkins</td><td>Hipoclorito de Sódio 4-6%, USP" 1 gal</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio (Hexahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio (heptahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação magnética</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 bactérias</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Modelo 3320</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Medidor</td><td>de pH Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de poliestire,</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio - DIBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio - MONOBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>VWR</td><td>10ml=89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de Sódio</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>Planilha</td><td>MS office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Modelo tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta estéreis</td><td></td> Várias <td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>Supercola</td><td>Loctite</td><td>1647358 .14 oz.</td><td></td></tr><tr><td>Software SwimR</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>Software de gravação de vídeo</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

O ensaio de natação descrito neste protocolo é uma ferramenta válida para identificar proteínas regulando o dopaminérgico sinapses. Semelhantes aos mamíferos, dopamina (DA) controla várias funções em c. elegans , incluindo atividade de aprendizagem e motor. Condições que estimulam a liberação DA (por exemplo, tratamentos de anfetamina (ANF)) ou que impedem DA autorização (por exemplo, animais faltando o transportador DA (dat-1) que são incapazes de reaccumulating para os neurônios) gerar um excesso DA extracelular em última análise, resultando em locomoção inibida. Esse comportamento é particularmente evidente quando os animais nadam na água. Na verdade, enquanto animais selvagem-tipo continuam a nadar por um longo período, dat-1 nula mutantes e selvagem-tipo tratadocom com ANF ou inibidores do transportador DA afundam até o fundo do poço e não se mexa. Esse comportamento é denominado "Natação paralisia induzida" (SWIP). Embora o ensaio SWIP está bem estabelecido, uma descrição detalhada do método está faltando. Aqui, descrevemos um guia passo a passo para executar SWIP. Para realizar o ensaio, larvas finais estágio-4 animais são colocados em uma placa de ponto de vidro contendo solução de sacarose de controle com ou sem ANF. Os animais são marcados por seu comportamento de natação ou manualmente pelo visualização sob um estereoscópio automaticamente por gravação com uma câmera montada sobre o estereoscópio. Vídeos são então analisados usando um software de rastreamento, que produz uma representação visual da frequência de debulha e paralisia na forma de mapas de calor. Ambos os sistemas manuais e automatizados garantem uma leitura facilmente quantificável de capacidade de natação dos animais e, assim, facilitam a triagem para animais com mutações dentro do sistema dopaminérgico ou para auxiliares genes. Além disso, SWIP pode ser usado para elucidar o mecanismo de ação de drogas de abuso como a ANF.

Nós apresentamos um exemplo de ensaio SWIP induzido pelo tratamento de ANF. A Figura 1 mostra uma representação esquemática da instalação do ensaio conforme descrito acima. Para o ensaio manual, aproximadamente 8-10 idade sincronizado tarde L4 palco vermes são coletados com um cílio ou platina escolher e colocado em uma placa de vidro local repleto de 40 µ l de 200 mOsm/L sacarose (solução controle) ou sacarose com 0,5 mM ANF e testado para SWIP.
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Natação induzida por paralisia (SWIP) é um ensaio comportamental bem estabelecido, usado para estudar os mecanismos subjacentes de dopamina sinalização em Caenorhabditis elegans (c. elegans). No entanto, falta um método detalhado para realizar o ensaio. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para SWIP.

Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar paralisia induzida pela natação ou SWIP, um ensaio comportamental para avaliar a sinalização de dopamina em C.elegans. O SWIP permite a identificação rápida de genes dentro ou relacionados à sinapse dopaminérgica. Este método permite a investigação dos efeitos produzidos por um excesso de dopamina extracelular que é causada, por exemplo, por drogas ou por mutações no transportador de dopamina.Para garantir que todos os vermes testados durante o ensaio nadassem pela mesma quantidade de tempo, os animais devem ser transferidos rapidamente para a solução. Demonstrando o procedimento serão Sirisha Kudumala e Serene Sossi. Ambos trabalham no meu laboratório.Para configurar culturas de partida de vermes, use uma espátula estéril para cortar pequenos pedaços de ágar de uma placa contendo C.elegans bem alimentados e transferir as peças de ágar em placas individuais NA22 E.coli. Depois de incubar as placas a 20 graus Celsius por três a quatro dias, confirme visualmente a presença de adultos gravid sob um microscópio estéreo. Para obter uma população sincronizada de vermes, esguiche água em um prato cheio de adultos gravid.Gire suavemente a pl

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

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Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

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Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

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Avaliação da Motilidade Gastrointestinal em Mutantes RAC1/CED-10 de Caenorhabditis elegans como uma ferramenta para estudar a doença de Parkinson precoce

Aprenda o protocolo SWIP para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans. Este método permite identificar genes relacionados à sinapse dopaminérgica e investigar os efeitos do excesso de dopamina extracelular.

Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans

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