Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Os métodos aqui apresentados permitem estudar os mecanismos moleculares da migração de células imunes através das barreiras cerebrais em encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal para esclerose múltipla. Ao investigar a permeabilidade da barreira hematoencefálica e a atividade de desoproteporase matricial ao mesmo tempo em correlação espacial com a infiltração de células imunes em seções de tecido cerebral, podemos associar precisamente esses eventos neuroinflamatórios aos sinais clínicos da EAE. O manuseio profissional de camundongos doentes precisa de treinamento aprofundado, bem como a pontuação correta dos sinais clínicos da EAE.

Assim, a demonstração visual é benéfica. Inicie este procedimento com a anestesia de camundongos C57-Black/6 que foram alojados em condições específicas sem patógenos, conforme descrito no protocolo de texto. Corrija o rato anestesiado em uma mão, e injete 30 microliters de peptídeo MOG e complete a emulsão de Freund subcutânea em cada um dos flancos da perna traseira, perto dos linfonodos inguinais.

Agora, coloque o rato em sua barriga, e injete 20 microliters da emulsão mog-peptídeo no tecido gorduroso macio tanto na esquerda quanto na direita na raiz da cauda. Além disso, injete uma gota da emulsão no pescoço do mouse. Injete 100 microliters de solução de toxina de coqueluche intraperitoneally no camundongo.

Segure a cabeça do rato abaixo do centro do corpo para evitar a injeção no intestino. Substitua a dieta de manutenção da dieta de reprodução, a fim de fornecer aos camundongos alimentos de maior teor energético antes e durante a doença clínica esperada. Repita a injeção de toxina da coqueluche 48 horas após o primeiro tratamento.

Verifique o estado de saúde dos ratos EAE todas as manhãs, dando uma olhada dentro das gaiolas. Marque ratos EAE todas as tardes. Tire cada rato incluído no experimento EAE da gaiola e verifique se a cauda tem tonus.

Mova a cauda para cima com um dedo. Um rato saudável manterá a cauda para cima. Se a EAE clínica tiver começado, o tonus da cauda será menor, visível por uma queda gradual da cauda.

Eventualmente, o mouse não será capaz de levantar sua cauda em tudo. Coloque cada rato incluído no experimento EAE no banco limpo para observar e documentar o comportamento de caminhada. Consulte o texto para critérios de pontuação para avaliação da gravidade da doença, que é o escore da EAE.

Avalie e documente o peso de cada rato incluído no experimento. Para a preparação de soluções de estoque de dextran, dissolva 10 miligramas de três quilodalton Dextran Texas Red em 500 microliters de 0,9% solução de cloreto de sódio e cinco miligramas de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 em 250 microliters de 0,9% de solução de cloreto de sódio. Para a solução de trabalho dextran, pouco antes da injeção, pipeta 55 microliters de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solução de estoque em um pedaço de filme de vedação.

Em seguida, adicione 55 microliters de três quilodalton Dextran Texas Red solução de estoque. Misture e colete 100 microliters em uma seringa fina descartável. Em seguida, coloque um rato anestesiado na posição lateral sobre a mesa.

Injete por via intravenosa 100 microlitros de rastreadores fluorescentes no mouse antes que o rato acorde. Deixe o rastreador circular por 15 minutos antes de realizar a perfusão de ratos conforme detalhado no protocolo de texto. Encha um recipiente de de guerra plano com gelo seco esmagado e adicione 2-metilbutano até que o líquido atinja cerca de um centímetro acima da bolsa de gelo seca.

Cubra com uma tampa solta, como uma tampa de balde de gelo. Depois de cortar a cabeça do rato perfusado com uma tesoura afiada, remova a pele e as orelhas usando um conjunto menor de tesouras. Disseca cuidadosamente a tampa do crânio cortando do forame magnum em direção à frente à esquerda e ao lado direito, para permitir o alongamento da tampa do crânio sobre o cérebro.

Em seguida, retire cuidadosamente o cérebro intacto da base do crânio enquanto corta os nervos ópticos usando uma espátula de metal plano. Coloque o cérebro na folha de alumínio. Corte o cérebro em três pedaços colocando dois cortes coronais.

As três peças representam o cérebro frontal, cérebro médio e cerebelo com tronco cerebral. Encha um Cryomold até o primeiro trimestre com uma matriz de corte de temperatura ideal. Em seguida, coloque as fatias cerebrais no Cryomold, com o lado anterior de cada peça cerebral voltada para baixo.

Cubra o tecido completamente com matriz. Coloque o Cryomold com o tecido em uma orientação horizontal no banho de 2-metilbutano. Certifique-se de que o tecido congela da parte inferior para cima dentro de um minuto, evitando mergulhar todo o bloco de tecido no banho.

Transfira o tecido congelado para menos 80 graus Celsius para armazenamento. Consulte o protocolo de texto para elaboração das seções de tecido congelado. Recuperar seções de tecido cerebral não fixa de seis mícrons que foram preparadas de camundongos EAE.

Em um capô de fumaça, descongele as seções dentro da caixa de congelamento plástico contendo gel de sílica na tampa para evitar a retenção de água no tecido. Separe duas seções de tecido em um slide desenhando linhas com uma caneta repelente de água. Soluções de reação centrífuga por cinco minutos a 13.300 vezes g à temperatura ambiente, e pré-quente a 37 graus Celsius usando um banho de água.

Em seguida, reidratar as seções teciduais por cinco minutos a 37 graus Celsius usando tampão de reação 1X. Após cinco minutos, despeje o tampão de reação 1X. Adicione a solução de reação nas seções teciduais e incubar por quatro horas a 37 graus Celsius.

Em seguida, lave os slides cinco vezes em água duplamente destilada. Agora, conserte as seções por cinco minutos com metanol gelado a menos 20 graus Celsius antes de lavá-las uma vez com PBS em temperatura ambiente. Adicione 1%BSA em PBS à seção e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, descarte o tampão da seção invertendo a lâmina em um tecido. Adicione coquetel de anticorpos primários à seção e incubar por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as seções duas vezes com PBS, adicione coquetel de anticorpos secundários e incubar por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as seções duas vezes com PBS e monte os slides com a solução de incorporação. Depois de deixar as seções montadas secarem durante a noite à temperatura ambiente, analise seções de tecido manchado usando um microscópio fluorescente. A gravidade da doença de EAE aumenta até o pico da doença, que pode ser esperada entre os dias 16 e 20 após a indução da EAE.

No auge da EAE clínica, os camundongos também apresentaram o menor peso corporal, o que aumenta em correlação com a amenização da EAE na fase de remissão da doença. Mostrado aqui é uma imagem representativa do plexo coroide e do parênquim cerebral adjacente de um rato C57-Black/6 que sofre de EAE. O rato foi injetado por via intravenosa 15 minutos antes de se sacrificar.

Os rastreadores prontamente se difundem através dos microvessels fenestrados no estoma do plexo coroóide, enquanto a barreira hematoencefálica não permite a difusão de rastreadores circulantes no parenchyma cerebral, que é, portanto, desprovido de qualquer sinal fluorescente. Estas imagens mostram vasos sanguíneos com vazamento representativo no cerebelo de um rato C57-Black/6 que sofre de EAE. Pontas de flecha indicam rastreadores difundidos através dos microvessels cerebrais no parênquim CNS, sugerindo que a função de barreira hematoencefálica é prejudicada nesses vasos.

No parênquimo CNS, o sinal fluorescente verde e vermelho é visível fora das paredes dos vasos sanguíneos. A colocação subcutânea correta da emulsão MOG-CFA é essencial para montar a resposta imune apropriada que leva à EAE. A injeção intraperitoneal e intramuscular deve ser evitada.

Prepare o CFA sob um capô de fumaça para evitar a inalação do Mycobacterium atenuado. Além disso, evite a autoinjeção com a emulsão MOG-CFA, pois isso pode causar condiloma ou até mesmo levar à EAE em indivíduos geneticamente predispostos. Células imunes infiltradas no cérebro podem ser isoladas do CNS de camundongos que sofrem de EAE para quantificar subconjuntos de células imunes infiltrados durante a neuroinflamação por citometria de fluxo.

Avaliar a integridade da endotelial e das barreiras cerebrais gliais pode ser traduzido para a análise de modelos de camundongos geneticamente modificados ou para modelos de outras doenças neurológicas.