Indução e Caracterização da Hipertensão Pulmonar em Camundongos usando o Modelo De Hypoxia/SU5416

Este protocolo pode ser usado para induzir a hipertensão pulmonar e para realizar medições funcionais do ventrículo direito. O Modelo de Hipóxia Sugen é fácil de implementar e pode recapitular algumas das marcas da hipertensão pulmonar dentro de duas a três semanas de indução. Usando esse modelo, podemos identificar novos caminhos envolvidos no desenvolvimento da doença.

Podemos identificar novos alvos e testar seu potencial terapêutico. Antes de iniciar o procedimento de indução, proteja os tanques de nitrogênio perto da câmara hipoxica e coloque o controlador de oxigênio em um ponto de 10% de oxigênio. Em seguida, carregue a solução SU5416 recém-preparada em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha calibre 25 e contenha manualmente o primeiro animal a ser injetado.

Segure a pele para formar uma tenda paralela à coluna vertebral certificando-se de agarrar firmemente a parte de trás da cabeça para evitar uma possível lesão de mordida pelo rato. Insira a agulha subcutânea sobre o flanco na dobra de pele solta paralela à pele e entregue 100 microliters do conteúdo da seringa. Após 10 segundos, retire a agulha e devolva o animal para sua gaiola.

Quando todos os animais tiverem sido injetados, coloque os ratos em uma câmara de hipóxia ventilada. Para exposição à hipóxia, confirme que as câmaras estão equipadas com um sensor de oxigênio para medir o nível de oxigênio e abrir as câmaras por não mais de 20 minutos a cada três dias para limpeza e adição de alimentos e água. Inspecione os animais diariamente em busca de sinais de estresse e repita a injeção SU5416 semanalmente por três semanas consecutivas.

Antes de iniciar o procedimento de medição da pressão, prepare o conector do tubo Y e use o modo manual para verificar a função do ventilador. Coloque a pressão inspiratória em menos de um centímetro de água para evitar o barotrauma e coloque a taxa respiratória em 110 respirações por minuto. Corte um cateter intravascular de 20 bitolas para criar um tubo endotraqueal e ligue a unidade de controle de volume de pressão.

Inicie o software de aquisição de dados e coloque o cateter de volume de pressão em um tubo de centrífuga de 15 mililitros de PBS em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, calibrar o cateter de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento e coloque uma sonda retal para monitoramento da temperatura corporal.

Em seguida, confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em um rato anestesiado e raspar as áreas do pescoço e peito. Fixar os membros do camundongo com fita cirúrgica e fazer uma incisão de um centímetro na pele cervical medial. Usando um aplicador de ponta de algodão, separe sem rodeios as glândulas salivares parótides e submandibulares para expor os músculos subjacentes à traqueia.

Corte cuidadosamente os músculos para expor totalmente a traqueia e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão entre as cartilagens traqueais. Insira o tubo endotraqueal preparado e remova a guia metálica do cateter intravascular. Em seguida, conecte o cateter ao ventilador e verifique a posição do tubo traqueal inflando manualmente os pulmões.

Proteja a posição com fita adesiva. Para a medição da pressão do ventrículo direito, faça uma incisão de pele de um centímetro sobre o processo xifoide e o abdômen superior e começando na linha média distal para o xifoide e movendo-se cuidadosamente lateralmente em ambos os lados, separando a pele sobre o peito e a parede abdominal. Abrindo a cavidade abdominal, corte o diafragma cuidadosamente, tomando cuidado para não ferir o coração batendo ou os pulmões.

E use um aplicador de ponta de algodão para remover suavemente o pericárdio. Leve o cateter de pressão perto do mouse e use um aplicador de ponta de algodão equipado com uma agulha para fazer uma facada na parte distal atípica do ventrículo direito. Substitua cuidadosamente a agulha por cateter de pressão, inserindo o cateter de pressão paralelo à direção do ventrículo direito com a ponta voltada para a artéria pulmonar.

Observe o rastreamento da onda de pressão para garantir o posicionamento correto do cateter. Uma vez estabilizado o sinal de pressão, pausar as respirações e obter pelo menos três medidas. Quando todas as medidas tiverem sido registradas, devolva cuidadosamente o cateter ao tubo de centrífuga cheio de PBS no banho de água.

Aqui, são mostradas curvas representativas de pressão e uma análise quantitativa da pressão ventricular direita no final do período de observação. A análise histológica das artérias pulmonares remodeladas após o tratamento de hipóxia mais su5416 revela um aumento na espessura da parede medial em comparação com os animais normóxicos. A coloração de agglutinina do germe de trigo para avaliar a hipertrofia cardiomiócito indica que a exposição à hipóxia mais a exposição su5416 resulta em um aumento acentuado no tamanho do cardiomiócito e hipertrofia ventricular direita.

Além disso, a avaliação morfométrica da hipertrofia ventricular direita por medição do índice Fulton confirma um aumento da hipertrofia ventricular direita nos animais hipoxicéricos. A realização das medições funcionais é importante para evitar sangramento, pois isso pode impactar negativamente os resultados do estudo. Este protocolo também pode ser usado para induzir hipertensão pulmonar em ratos com apenas pequenas modificações.

Notavelmente, apenas uma injeção de Sugen em ratos é suficiente para induzir hipertensão pulmonar.