Name: Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar oligossacarídeos do leite humano fucosilados usando biossensores de células inteiras geneticamente codificados. Este método de alta vazão simplifica a análise de HMOs em pesquisas de biotecnologia.

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Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização Universidade do estado de Iowa. Fe foi parcialmente financiado pela NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cátedra. T.J.M. foi parcialmente apoiado pela Karen e Denny Vaughn faculdade Fellowship. Os autores agradecer o Iowa University fluxo Cytometry instituição estadual e do W.M. Keck Metabolomics Research Laboratory para assistência com fluorescência e estudos de LC-MS.

1. condições de cultura e indução de célula
Nota: Nos experimentos seguintes, três cepas são utilizadas: Escherichia coli BL21 (DE3) com um vetor vazio, Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcA14 e pET28:green proteína fluorescente (GFP) e Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcB14 e pET28:GFP. Todas as cepas são cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) ou media mínimos com antibióticos apropriados. Prepare soluções estoque de 1.000 x canamicina (50 mg/mL) e carbenicilina (100mg/mL) em deionizada (DI) de água.
<ol><li>
Preparação de meios de comunicação
	<ol>
<li>Prepare a LB mídia adicionando 25g de LB estoque de pó para 1 litro de água DI. Autoclave a 121 ° C por 20 min esterilizar a solução de. Espere até a temperatura de mídia LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição de 1 µ l de estoque de antibiótico para cada 1 mL de LB mídia.</li>
		<li>Para preparar placas LB, adicione o ágar 15 g à mídia LB antes da esterilização. Espere até a temperatura de ágar LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição do antibiótico.</li>
		<li>1.1.3 para as células biosensing, prepare mídia ou placas com antibióticos duas, canamicina e carbenicilina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indutores de hidrato de carbono
	<ol>
<li>Preparar soluções estoque das indutores de carboidratos no molares equivalentes a 20 g/L de lactose: 29 g/L de 2'-FL e 3-FL. Nota: Cada 200 µ l de células exigirão 20 µ l de 2'-FL ou 3-FL.</li>
		<li>Induzir a 200 µ l de células com concentração final de 2,0 g/L de lactose ou 2,9 g/L de concentração final de 2'-FL/3-FL. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e deixe as culturas a crescer durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura celular
	<ol>
<li>No dia anterior a semente do experimento 5 mL de LB suplementado com canamicina e carbenicilina de uma colônia bacteriana fresca, utilizando uma técnica estéril.</li>
		<li>Incubar as culturas a 37 ° C, com agitação e crescem as culturas durante a noite.</li>
		<li>Transferi 50 µ l de cultura durante a noite para 5 mL de fresco LB/M9 mídia com canamicina e carbenicilina. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e crescer até cultura chegou a densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,5-0,7. Nesta fase de log de mid, as células podem ser induzidas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. medida da fluorescência e limites de detecção
<ol><li>
Preparação de células por citometria de fluxo
	<ol>
<li>Transferi as culturas durante a noite para tubos de 1,5 mL e centrifugar 12.500 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 µ l de 1 x fosfato salino (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM de NaCl em água DI, pH 7,2) para preparar uma suspensão de célula única e transferir a única célula suspensão de tubos de citometria de fluxo de 5 mL.</li>
		<li>Manter as células no escuro a 4 ° C até rodando as amostras em um citômetro de fluxo. Para melhores resultados, analise as células mais rapidamente possível.</li>
		<li>Selecione 488 nm do laser para excitar a GFP. Recolha os níveis de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, gated para dispersão de frente e lateral evitar detritos e agregados de células) com um filtro de passa-banda 525/50 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calibrando o biosensor
	<ol>
<li>Para fazer uma curva de calibração, faça diluições de 8 – 10 de padrão 2'-FL na escala 0 – 2.500 mg/L.</li>
		<li>Cultura de células de biosensing o 2'-FL (contendo pAfcA e pET28:GFP) e induzi-los com as diluições padrão, conforme descrito anteriormente na seção 1.3. Realize três repetições biológicas para cada diluição.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detecção e quantificação de 2'-FL em uma cepa de produtor
<ol><li>
Cultivo da estirpe de produtor
	<ol>
<li>Para fazer a media mínimos, preparar soluções separadas de 1 M K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e 1 M de tiamina-HCl. esterilizar as soluções usando um filtro de 0,22 µm. Misture M9 mídia pó de caldo com 1 L de água DI. Autoclave a solução M9 a 121 ° C durante 15 min. esfriar a solução até 50 ° C. Adicione MgSO4, CaCl2, K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e tiamina para concentrações finais de 2mm, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, respectivamente.</li>
		<li>Inicie uma cultura de 2'-FL produzir tensão, por exemplo, JM109 gwBC-F2, em 5 mL de LB mídia e deixá-lo crescer durante a noite a 37 ° C, conforme descrito no Baumgartner et al.12.</li>
		<li>Subcultura em 1%, conforme descrito anteriormente na etapa 1.3.3 em 250 mL da mídia mínima preparada na etapa 3.1.1. Adicionar o glicerol a uma concentração final de 10 g/L e incubar a cultura a 37 ° C.</li>
		<li>Quando a cultura atinge uma OD600 de 0,5-0,7, adicionar isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0.5 mM e lactose para uma concentração final de 2 g/L.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e permitir culturas cresça para 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de 2'-FL
	<ol>
<li>Transferi as culturas durante a noite para tubos de 50ml estéril e centrifugar 900 x g por 15 min.</li>
		<li>3.2.2 descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água DI. Repeti a etapa de lavagem três vezes para remover à lactose residual e finalmente re-suspender em 5 mL de água Desionizada.</li>
		<li>Para lisar a suspensão de células, use um sonicador em 30% de energia, em 30 pulsos de s. Manter as células no gelo em todos os momentos.</li>
		<li>Centrifugar as células lisadas por 25 min a 2.000 x g. Remover o sobrenadante, passá-lo através de um estéril (por exemplo, de 0,22 µm) filtrar e armazená-lo em 4 ° C até análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificação com biosensor
	<ol>
<li>Inocular uma cultura de células de 2'-FL biosensing e no log de meio da fase, induzir com equivalente lisado celular concentrações estimadas de 2'-FL usado para fazer a curva de calibração, conforme descrito na seção 2.2. Executar a calibração no mesmo ambiente que a amostra a analisar (por exemplo, lisado celular total) adicionando diluições de 2'-FL para controle (ou seja, não-produtor) lisado antes de induzir células biosensor filtrado celular.</li>
		<li>Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Gera uma curva de dose-resposta plotando a saída de fluorescência contra a concentração de oligossacarídeo. Compare a resposta das normas para o lisado celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. seletiva remoção de lactose
Nota: As células biosensing são sensíveis à lactose e é desejável que o biosensor detectar seletivamente a planos de saúde de lactose. Uma estratégia incluiria lavagem de células, conforme descrito na seção 3.2. Três outras estratégias são descritas abaixo.
<ol><li>
Tratamento com comercial purificado β-galactosidase
	<ol>
<li>Dissolver o liofilizado β-galactosidase para 1.000 (lactase FCC) unidades/mL, em 1 mM MgCl2 ou uso comercial do β-galactosidase na solução.</li>
		<li>Para determinar a concentração óptima de enzima necessária, crescer um inóculo de 2'-FL biosensing células e induzir com lactose 2 g/L e 2,9 g / L 2'-FL em meados fase log.</li>
		<li>A 100 culturas µ l, adicionar quantidades variáveis de β-galactosidase, até 12 unidades e deixe as culturas a crescer durante a noite a 37 ° C, com agitação contínua.</li>
		<li>Medir a fluorescência, conforme descrito na seção 2.1 e calcular as unidades ideais da enzima necessária pela determinação da concentração mínima de enzima para alcançar a desejada atenuação do sinal.</li>
		<li>A 2'-FL produzindo células cultivadas por 24 h, adicionar ideais unidades de β-galactosidase e incubar durante uma noite a 37 ° C. Prossiga com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pré-tratamento com LacZ + tensão
	<ol>
<li>Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a cultura a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Inocular uma Escherichia coli BL21 (DE3) cultura em LB, cultivá-la para log de meio da fase a 37 ° C e adicionar 50 mL de cultura (2:1) para a cultura de 24 h.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 3 h. prosseguir com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Precipitação de lactose com etanol Nota: Esta seção é adaptada do Matsuki et al.12.<ol>
<li>Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Adicione dois volumes de etanol 100% para a cultura, agite bem e incubar a 37 ° C por 4 h.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de 900 x g durante 15 min. recolher o sobrenadante e incubar durante uma noite a 4 ° C, que precipita a lactose.</li>
		<li>Remova a lactose precipitada, passando a solução através de um filtro de papel (11 µm). Recolha o filtrado que é a célula do lisado contendo o 2'-FL, que pode ser quantificada pelo seguinte seção 3.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li>
<li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry%3A+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li>
<li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li>
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<li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).</li>
<li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+%28HMOs%29+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li>
<li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2%E2%80%99-fucosyllactose%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939(2016).</li>
<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos uma estratégia de alto rendimento para a detecção de ligação específica de fucosilado oligossacarídeos do leite humano. Isso foi conseguido através da construção de biossensores de célula inteira por engenharia genética de e. coli , que, após indução com os glicanos específicos, responder com um sinal fluorescente. O protocolo também detalhes sobre como o biosensor pode ser usado para detectar e quantificar a planos de saúde em uma estirpe bacteriana metabolicamente engenharia.
<p class="jove_co...

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são derivados de lactose oligossacarídeos, geralmente composto por monômeros de açúcar de três a oito. Eles têm uma redução de lactose (Gal-β1, 4-Glc) terminam e são mais alongados por ligações glicosídicas (β-1,3 - ou β-1,6-) para glicose (Glc), galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc). Além disso, a fucose (Fuc, α-1,2 - ou α-1,3-) ou ácido siálico (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2,6-) resíduos são frequentemente adicionados1.
Análise atual de oligossacarídeos e outros carboidratos é limitada em escopo e throughput pela necessidade de espectrometria cromatográfica/de massa (MS) tecnologia2,3,4,5, 6 , 7, que pode demorar mais ou menos uma hora por exemplo, para não mencionar a necessidade de equipamento caro, colunas especializadas e agentes derivatizing e conhecimentos sobre o funcionamento deste equipamento8. Ligações de oligossacarídeo são particularmente difíceis de determinar, exigir avançado MS9,10 ou de técnicas de ressonância magnética nuclear (NMR)11. Otimização rápida da síntese desses oligossacarídeos assim é limitada pela taxa de transferência deste passo lento e analítico.
Neste estudo, demonstramos a deteção de ligação específica de fucosilado trissacarídeo baseada em lactose planos de saúde, enfocando o 2'-fucosyllactose (2'-FL) que é o HMO mais abundante no leite humano, usando um geneticamente codificado toda célula Escherichia coli Biosensor com um limite de detecção em 4 mg/L. Uma característica importante deste biosensor é sua capacidade de distinguir entre trissacarídeos isoméricos. O princípio de projeto baseia-se na expressão de fucosidases específico em e. coli que liberar à lactose de planos de saúde, cuja presença é detectada pelo operon lac , que por sua vez, gera um sinal fluorescente. Conseguimos isso através da construção de um sistema de dois-plasmídeo, um abrigando o enlace específico fucosidase e o outro uma proteína fluorescente repórter. Esta plataforma de biosensor é apropriada para seleção da elevado-produção por citometria de fluxo ou leitor de microplaca. Também demonstramos a utilização do biosensor para quantificar o 2'-FL produzido por uma cepa de engenharia12. Dentro deste estudo, também apresentamos três estratégias na remoção seletiva de lactose que pode resultar em falso sinal positivo do biosensor, dado que a tensão de engenharia produtor é cultivada em lactose.
Os biosensores geneticamente codificados tomados em conjunto, permitem-nos detectar e quantificar a planos de saúde de uma forma de ligação específica, que é difícil mesmo com cromatografia em fase gasosa, MS, ou NMR técnicas. Devido a sua alta produtividade e facilidade de uso, este método deve ter difundidas aplicações na engenharia metabólica e síntese dos planos de saúde.

<table><tbody><tr><td>2'-Fucosil-lactose&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-Fucosil-lactose&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio, Dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose), Citômetro</td> de Fluxo <td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td>Anidro</tr><tr><td></td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>1100 Series HPLC</td></tr><tr><td>Coluna de HPLC</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 coluna de fase reversa</td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11815024</tr><tr><td>Caldo LB, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, Sais Minimimais, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio, Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Armadilha Seletiva de Massa SL detector</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são componentes de hidrato de carbono complexo do leite materno que exibem abundantes benefícios na saúde infantil. No entanto, otimização de sua síntese biotecnológica é limitada pela relativamente baixa taxa de transferência da deteção e quantificação de monossacarídeo e ligações. Técnicas convencionais de análise de glicano incluem métodos cromatográficos/massa-espectrometria com taxa de transferência na ordem de centenas de amostras por dia sem automação. Aqui, demonstramos um biossensor bacteriano geneticamente codificado para a elevado-throughput, enlace específico detecção e quantificação das estruturas fucosilado HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, que alcançamos através de heteróloga expressão de fucosidases. Como a presença de lactose no leite ou em processos biotecnológicos poderia levar a falsos positivos, demonstraremos também a redução do sinal de lactose usando diferentes estratégias. Devido a alta taxa de transferência desta técnica, muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas, permitindo a otimização da fabricação de HMO.

Nós projetamos um biossensor celular específico para o 2'-FL que pode ser usado em conjunto com a produção biotecnológica do oligossacarídeo. Isto baseia-se na clivagem enzimática específica de modificação de açúcares terminais gerando à lactose e, assim, a ativação do operon do lac , levando à expressão de uma proteína fluorescente repórter sob um promotor inducible à lactose, proporcionalmente à quantidade de 2'-FL. Para demonstrar a sua especificidade de ligação, 3-fucosyllact...

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave envolvidas na produção de oligossacarídeos de leite humano. Primeiro, quanto do produto eu tenho? E segundo, qual é a ligação específica de carboidratos?O objetivo aqui é simplificar e acelerar o processo de quantificação e caracterização desses oligossacarídeos de leite humano. Este método tem duas vantagens em relação ao estado atual da arte. Primeiro, é agradável para a triagem de alto rendimento.Então, você pode imaginar testar milhares de condições diferentes ou talvez até mesmo uma biblioteca de enzimas de síntese em um dia usando essa técnica. Além disso, usa a especificidade única do substrato que a natureza evoluiu nas enzimas para nos dar informações sobre a ligação de carboidratos desses oligossacarídeos. Acreditamos que este método pode melhorar a produção de oligossacarídeos de leite humano, o que, por sua vez, pode levar a uma fórmula infantil de melhor qualidade que imita mais de perto o leite materno humano e ajuda a diminuir a distância entre bebês amamentados e alimentados com fórmulas.Recomenda-se a discrição do usuário ao decidir qual método usar para remoção de lactose com base no custo, rendimento e d

analysis-fucosylated-human-milk-trisaccharides-biotechnological

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Comece com uma cultura de biossensor bacteriano suspensa em um meio.Essas bactérias modificadas produzem um fator de transcrição que, ao se ligar a um metabólito fecal específico, ativa um promotor associado a um gene repórter fluorescente.A essa cultura, adicione uma amostra de fezes humanas filtrada contendo metabólitos, como o lactato, que estão envolvidos nas interações hospedeiro-microbioma.Dilua essa mistura com um meio fresco para manter um volume de reação ideal.Incubar sem tremer para...

Detecção de Metabólitos Fecais Humanos usando um Biossensor Bacteriano

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Apresentamos um método modular automatizado de alto rendimento para a identificação e caracterização de exopolissacarídeos microbianos em pequena escala. Este método combina uma pré-seleção rápida para analisar a quantidade total de polissacarídeos secretados com uma impressão digital detalhada de carboidratos para permitir a triagem rápida de cepas bacterianas recém-isoladas ou coleções inteiras de cepas.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Um protocolo detalhado para a purificação e a análise subseqüente de um anticorpo monoclonal do líquido de cultura de pilha colhido (HCCF) de microbioreactors automatizados foi descrito. O uso de análises para determinar os atributos críticos de qualidade (CQAs) e maximizar o volume de amostra limitado para extrair informações vitais também é apresentado.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Um sistema para a análise automatizada e rápida de glicanos em proteínas foi desenvolvido anteriormente. Este artigo apresenta o protocolo para "análise glicoqualitativa", otimizado para um amplo espectro de usuários, como aqueles envolvidos na análise de estruturas de glicanos em biofármacos e outros materiais glicoconjugados.

Avaliação rápida glicoqualitativa de proteínas recombinantes usando um sistema totalmente automatizado

Estudos recentes destacam os papéis das enzimas da microbiota intestinal humana no metabolismo dos glicosídeos C. Aqui, apresentamos uma metodologia abrangente que integra técnicas de química analítica (LC-MS / MS e NMR) com abordagens de biologia estrutural para caracterizar sistematicamente as cadeias de reação estruturais e enzimáticas dessas enzimas metabolizadoras de glicosídeos C.

Abordagens de Biologia Estrutural e Química Analítica para Caracterização de Enzimas Metabólicas de C-Glicosídeos na Microbiota Intestinal Humana

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda a detectar e quantificar oligossacarídeos do leite humano fucosilados usando biossensores de células inteiras geneticamente codificados. Este método de alta vazão simplifica a análise de HMOs em pesquisas de biotecnologia.

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

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