Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica
11 de setembro de 2019
Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.
Este protocolo descreve a preparação simples para imagens AFM de vesículas extracelulares em formas hidratadas e dessecadas, sua imobilização eletrostática, varredura superficial, identificação vesical e análise e interpretação de dados. A principal vantagem desta técnica é a conveniente fixação eletrostática de vesículas na superfície da pele e a análise pós-imagem para explicar a distorção de forma causada pela imobilização. Os resultados de dimensionamento de vesículas obtidos são consistentes com a Imagem CrioTEM Padrão Ouro que permanece cara e técnica desafiadora.
Se você é um novo usuário de AFM, comece com a caracterização de amostras secas antes de proceder a amostras hidratadas. Porque existem inúmeros fatores adicionais que podem impactar a aquisição de amostras hidratadas. Para começar, isole vesículas extracelulares de um bioe fluido, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.
Em seguida, conecte firmemente um disco mica a um disco de espécime de aço inoxidável magnético. Aperte o disco mica usando uma navalha afiada para expor uma nova camada de material. À temperatura ambiente, trate a superfície superior de mica por dez segundos com cem micro litros de uma solução de cloreto de níquel II de dez milimolar.
Isso modifica a carga da superfície de negativa para positiva. Borrihe a solução de cloreto de níquel II com um lenço livre de fiapos ou papel de mancha. Em seguida, lave a superfície mica três vezes com água deionizada e seque-a com um fluxo de nitrogênio seco.
Coloque o disco da amostra AFM com a mica modificada da superfície anexa em uma placa de petri. Em seguida, diluir os exossomos com PBS para obter uma concentração entre quatro e quarenta bilhões de partículas por mililitro de solução. Validar a concentração de partículas diluídas usando análise de rastreamento de partículas nano.
Forme uma gota de sessile na superfície do mica esvaziando cem microlitadores da solução exososome diluída de uma pipeta. Em seguida, coloque a tampa sobre a placa de petri e sele-a com filme parafen para reduzir a evaporação da amostra. Incubar na geladeira por doze horas.
Após a incubação, aspire de 80 a 90% da amostra cuidadosamente sem perturbar a superfície. Neste ponto, os exossomos serão eletroestáticamente imobilizados no substrato mica. Ao fotografar amostras hidratadas, enxágue a superfície três vezes com PBS.
Tome cuidado para manter a amostra hidratada durante todo o processo de lavagem. Depois de lavar a superfície mica com PBS, remova 80 a 90% do líquido e pipeta quarenta microliters de PBS fresco para cobrir a amostra. A amostra hidratada está pronta para a imagem.
Ao fotografar os EV dessecados, remova os sais da superfície enxaguando o substrato três vezes com água desionizada. Depois de aspirar o máximo de líquido possível, sem tocar na superfície, seque o resto com um fluxo de nitrogênio seco. Para fotografar as vesículas extracelulares dessecadas, selecione uma cantilever projetada para digitalização no ar em modos de gravação e imagem sem contato e monte-a no suporte da sonda.
Coloque a amostra no estágio AFM. O disco de amostra de aço inoxidável magnético imobilizará a amostra no palco. Coloque o suporte da sonda no AFM.
Dê tempo para a preparação e o estágio equilibrarem-se termicamente. Use o modo de toque para digitalizar uma área que é 5x5 mícrons rastered em 512 linhas a uma taxa de varredura de um hertz. Adquira as imagens de altura e fase, pois fornecem informações complementares sobre a topografia e as propriedades superficiais da amostra.
O tempo de varredura aumentará com uma área de imagem e o número de linhas selecionadas para formar a imagem, mas diminuirá com a taxa de digitalização. Uma vez que as taxas de varredura rápida podem afetar a qualidade da imagem, a velocidade de rastering deve ser um equilíbrio entre o tempo de aquisição e a qualidade da imagem. Para imaginar vesículas hidratadas, selecione um cantilever apropriado para digitalizar amostras macias e hidratadas e monte o cantilever em um suporte de sonda projetado para digitalização em líquidos.
Molhe a ponta do cantilever com PBS para reduzir a probabilidade de introduzir bolhas de ar no líquido durante a varredura. Em seguida, imobilize a amostra no estágio AFM. Uma vez que a amostra equilibre termicamente, imagem a superfície mica hidratada no modo de toque.
Adquira as imagens de altura e fase. Para analisar as imagens tiradas, primeiro vá para os modos SPM selecionados do Processo de Dados, seguido de Tip'e escolha Model Tip'Selecione a geometria e as dimensões da ponta usada para digitalizar a amostra e clique em OK'Corrija os artefatos de erosão da ponta realizando a reconstrução da superfície. Abra a imagem.
No menu, selecione O Processo de Dados', então selecione os modos SPM'seguidos por Tip', então escolha a Reconstrução de Superfície'e clique em OK'Next, selecione Processo de Dados, seguido por Level'e escolha O Nível de Plano', para alinhar o plano de imagem e combinar com o plano XY do laboratório, removendo a inclinação no substrato dos dados da varredura. Alinhar linhas na imagem selecionando o Processo de Dados'seguido por Dados Corretos'' e, em seguida, escolha Alinhar linhas'Várias opções de alinhamento estão disponíveis, incluindo mediana, que é um algoritmo que encontra uma altura média de cada linha de varredura e subtrai-as dos dados. Em seguida, vá para o Processo de Dados'seguido por Dados Corretos' e escolha Remover cicatrizes'Isso removerá erros de varredura comuns conhecidos como Cicatrizes'Para alinhar a superfície mica na altura zero, vá para o menu do Processo de Dados e selecione Base achatada no menu de queda do nível'.
Identifique as vesículas celulares extras na superfície digitalizada indo ao menu do Grains e usando Mark by Threshold'Este algoritmo identifica exossomos imobilizados da superfície como partículas salientes do substrato de superfície zero pela altura acima do limiar selecionado pelo usuário. Selecione um limiar na faixa entre um e três nanômetros. Isso eliminará a maior parte da interferência do solo traseiro.
Por fim, realize a caracterização geométrica e dimensional das vesículas identificadas utilizando os algoritmos de distribuição disponíveis acessíveis a partir do cardápio dos Grãos. Exporte os dados AFM da Gwyddion para análise especializada por outras ferramentas computacionais e programas de computador personalizados. A modificação da superfície do cloreto de níquel resulta em uma imobilização de vesículas celulares extras que dependem do tempo.
A concentração superficial das vesículas imobilizadas é excessivamente densa após 24 horas de incubação, enquanto a incubação de 12 horas leva a menos exosóis e dados de varredura que são mais fáceis de analisar com precisão. Esta imagem AFM mostra exosóis MCF7 hidratados eletroessticamente imobilizados na superfície mica modificada. A imagem de fase AFM correspondente confirma que os grãos na imagem de altura são nanopartículas macias, como deveria ser esperado para vesículas de membrana.
Os dados de altura de três vesículas ao longo da mesma linha são mostrados aqui. Esses perfis ilustram uma forma achatada causada pela atração eletrostática dos exosóis à superfície de carga positiva do mica modificado. A distorção da forma é aparente em uma visão ampliada da vesícula imobilizada e sua seção transversal.
Para estimar o tamanho globular dos exossomos na solução, pode coincidir com os volumes incluídos por envelopes de membrana imobilizada e esférica. A distribuição de tamanho das vesículas globulares na solução foi determinada a partir dos dados AFM de 561 vesículas imobilizadas. Os tamanhos de vesículas nas imagens CryoTEM são consistentes com os resultados da AFM.
Antes de imaginar os exossomos hierárquios, é importante lembrar de enxaguar completamente a superfície com PBS. Isso removerá os exossomos de entrada e impedirá o apego à ponta AFM. Ao fotografar os exossomos dessecados, certifique-se de usar água DI para subir o substrato.
A lavagem DI impedirá a formação de cristais de sal na superfície à medida que o substrato seca. Se presente, os cristais de sal tornarão o processamento da imagem uma tarefa difícil.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento passo a passo para a imobilização livre de marcadores de exossomos e vesículas extracelulares a partir de amostras líquidas, seguido por imagem por microscopia de força atômica (AFM). O método permite a estimativa do tamanho das vesículas e a caracterização de propriedades biofísicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Técnicas de Imagem
Contexto
- As vesículas extracelulares desempenham um papel crucial na comunicação intercelular.
- A microscopia de força atômica (AFM) oferece capacidades de imageamento de alta resolução.
- As técnicas livres de marcadores reduzem o risco de alterar as propriedades das vesículas.
- A imobilização eletrostática é um método conveniente para a preparação da amostra.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para o imageamento de vesículas extracelulares.
- Comparar os resultados de dimensionamento de vesículas com métodos tradicionais, como a criomicroscopia eletrônica de transmissão (CryoTEM).
- Facilitar a análise da forma e do tamanho de vesículas em diferentes estados.
Métodos Utilizados
- Isolamento de vesículas extracelulares de biofluidos.
- Imobilização eletrostática em superfícies.
- Imageamento por AFM em formas hidratadas e dessecadas.
- Análise de dados para interpretar as características das vesículas.
Principais Resultados
- Os resultados de dimensionamento de vesículas são consistentes com a imagem de CryoTEM.
- A fixação eletrostática minimiza a distorção de forma durante a imagem.
- Amostras hidratadas requerem manipulação cuidadosa devido a fatores adicionais.
- O protocolo é adequado tanto para usuários novos quanto experientes de AFM.
Conclusões
- O protocolo descrito oferece um método simples e eficaz para a imagem de vesículas.
- Os resultados podem aprimorar a compreensão da biofísica das vesículas.
- Essa técnica fornece uma alternativa economicamente viável aos métodos tradicionais de imagem.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia de força atômica (AFM) oferece uma alternativa econômica e acessível ao criomicroscópio eletrônico de transmissão (crio-TEM) para a determinação do tamanho de vesículas extracelulares (EVs), permitindo uma adoção mais ampla em fluxos de trabalho de descoberta inicial. O protocolo permite a caracterização quantitativa e sem marcação do tamanho e das propriedades biofísicas das EVs em estados hidratados e dessecados, com resultados consistentes com a imagem padrão-ouro. Isso facilita a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas, aumentando a confiança nas hipóteses baseadas em biomarcadores e terapias com EVs.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da medição direta da distribuição de tamanho de EVs, apoiando a redução de riscos biológicos de mecanismos mediados por vesículas.
- Valor Operacional: Fornece dados reprodutíveis de dimensionamento sem marcação, o que reduz a variabilidade em ensaios de validação precoce de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas padronizadas de tamanho de VE adequadas para padronização de ensaios e prontidão para triagem de alto conteúdo.
- Valor Operacional: Permite a reutilização escalonável da plataforma em formatos de amostras hidratadas e desidratadas, melhorando o rendimento em campanhas de triagem baseadas em VE.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Garante a continuidade translacional ao fornecer dados de tamanho alinhados com criomicroscopia eletrônica, apoiando a qualificação de biomarcadores e a relevância do modelo pré-clínico.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio da caracterização consistente de vesículas extracelulares em plataformas distintas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O dimensionamento de VE baseado em AFM insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de candidatos promissores, oferecendo uma leitura quantitativa e escalonável que apoia decisões de avançar ou não antes do investimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a medição precisa de propriedades biofísicas de EVs associadas à origem e função celulares.
- Triagem: Fornece distribuições de tamanho prontas para ensaios e reprodutíveis, aumentando a confiabilidade da avaliação de compostos em vias associadas a EVs.
- Análises: Fornece dados dimensionais e geométricos obtidos a partir de imagens de altura e fase, permitindo comparação estatística de populações de EVs sob diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica por meio da consistência de tamanho com criomicroscopia eletrônica (crio-TEM), apoiando o alinhamento de biomarcadores e a validação de sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável e livre de marcadores, aplicável a múltiplos fluxos de trabalho de isolamento de EVs e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no tamanho e na forma das EVs, redução da ambiguidade mecanicista na sinalização mediada por vesículas.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da determinação do tamanho das EVs em estados hidratados e desidratados.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguimento ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital mediante menor dependência de criomicroscopia eletrônica de transmissão (crio-TEM) e redução de riscos biológicos em fases avançadas em programas direcionados às EVs.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de biomarcadores e terapêuticas baseados em EVs por meio de dados validados e comparáveis entre plataformas sobre o tamanho das vesículas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em operação de AFM, preparação de amostras e técnicas de modificação eletrostática de superfícies.
- Depende do acesso a instrumentação de AFM com capacidades de varredura em líquido e em ar, juntamente com cantiléveres apropriados para imagens hidratadas e desidratadas.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de imobilização (por exemplo, incubação de 12 horas) para garantir concentração superficial e qualidade dos dados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes fontes de VE (por exemplo, exossomos de MCF7) e condições de tampão, a fim de manter a integridade das vesículas durante a imobilização e a aquisição de imagens.
- Inclui limitações práticas, como distorção de forma devido à atração eletrostática, exigindo correção pós-aquisição por meio de algoritmos de convolução da ponta e reconstrução de superfície.
