Name: A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico para controle de crises em ratos. Este método permite administração local precisa do neurotransmissor inibitório, oferecendo nova abordagem terapêutica para epilepsia.

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C.M.P. reconhece o financiamento de um subsídio da Whitaker International Scholar administrado pelo Instituto de educação internacional. A AK foi patrocinada pelo IEF Marie Curie (n º 625372). A aw reconhece o financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (acordo de subvenção n. º 716867). A aw também reconhece a iniciativa de excelência da Universidade Aix-Marseille-A * MIDEX, um programa francês "investissements d' avenir". Os autores reconhecem o Dr. ilke Uguz, o Dr. Sahika inal, o Dr. Vincenzo curto, o Dr. Mary Donahue, o Dr. Marc ferro, e o Zsófia Maglóczky para sua participação em discussões frutuosas.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes éticas do Institut de NEUROSCIENCES des Systèmes e aprovados pelos comitês de ética e escritórios veterinários locais.
Nota: Dezessete machos adultos OF1 camundongos foram utilizados para os experimentos. Camundongos foram arrastada para um ciclo de luz/escuro 12 h com alimentos e água disponível ad libitum.
1. anestesia
<ol><li>Injete intraperitonealmente uma mistura de cetamina e xilazina (100 mg/kg de peso corporal e 10 mg/kg de peso corporal, respetivamente) para anestesiizar o animal.</li>
	<li>
Verifique o nível de anestesia observando a frequência respiratória e mexendo e verificando a resposta do mouse à dor. Nota: quando a respiração do rato se torna regular, nenhum mexendo pode ser observado, e o animal não reage aos pinches da cauda, a anestesia é profundamente bastante para continuar.<ol>
<li>Coloque o animal numa almofada de aquecimento programável eletricamente. Cubra a sonda de temperatura retal com um produto à base de geléia de petróleo (ver tabela de materiais) e coloque-o suavemente no reto (1 – 2 cm de profundidade) do mouse para monitorar sua temperatura corporal. Manter uma temperatura corporal entre 36,5 e 37,5 ° c durante os procedimentos cirúrgicos e gravações experimentais.</li>
		<li>Monitore o nível de anestesia, verificando os reflexos do mouse, movimentos Whisker, e sua frequência de respiração. Tendo em conta o nível de anestesia registrada pelo menos a cada 30 min, dar uma pequena dose de um coquetel de cetamina-xilazina (20 – 50 μL, a mesma concentração usada como antes) por via intramuscular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cirurgia/craniotomia
<ol><li>Fixe a cabeça do rato num quadro estereotódico. Usando uma agulha de 30 G, injete a ropivacaína analgésica local (5 μL, 7,5 mg/mL, ver tabela de materiais) por via subcutânea no local da incisão planejada. Aguarde 5 minutos para que ele tenha efeito.</li>
	<li>Faça uma linha média de corte reto na pele acima do crânio com um bisturi. Puxe delicadamente a pele para os lados com fórceps fino e prenda-a de lado com os grampos do Hermostaticas do buldogue para deixar o crânio expor para um trabalho mais adicional.</li>
	<li>Limpe o crânio da fáscia com um bisturi ou qualquer ferramenta similar. Em caso de sangramento superficial, retire o sangue com cotonetes de algodão ou pequenos pedaços de papel toalha.</li>
	<li>Tome um poli (3,4-ethylenedioxythiophene) o poliestireno sulfonato (pedot: PSS)-parafuso à terra revestido (tamanho: #00, diâmetro: 0, 47 dentro, comprimento: 1/8 dentro, veja a tabela de materiais) com um fio soldado e conecte-o com um conector ao headstage do amplificador.</li>
	<li>Umedecer o crânio no local de furo desejado e perfurar um furo em alta velocidade usando uma broca fina, redonda (com um diâmetro de 0,4 milímetros) no crânio acima do cerebelo até que a dura seja visível. Põr o parafuso à terra no furo e parafuse-o dentro com uma chave de fenda da precisão até que alcangue a parte superior do cerebelo. Nota: O parafuso de cabeça foi revestido com uma solução de PEDOT: PSS contendo 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) por peso seguido de cozimento a 140 ° c para 90 min. PEDOT: PSS é um polímero conjugado com uma capacitância volumétrica que é conhecido por ser biocompatível. GOPS é um cross-linker misturado com PEDOT: PSS para aumentar a estabilidade em meios aquosos (Figura 2).</li>
	<li>Com a ajuda do frame Stereotaxic, Meça as coordenadas Stereotaxic para a região desejada do cérebro. Por exemplo, a região de interesse é o hipocampo, anteroposterior (AP)-1,8 mm e mediolateral (ML) 1,8 mm do ponto de Bregma baseado no Atlas cerebral para camundongos32. Nota: Estas são coordenadas para o hemisfério direito (Figura 2).</li>
	<li>Diluir uma área de aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro do crânio acima da região alvo usando uma broca odontológica confiável (ver tabela de materiais) ajustada a uma velocidade rápida até que uma membrana óssea fina, bem polida e transparente permaneça.</li>
	<li>Então, se a espessura da membrana óssea for suficientemente fina (< 200 μm), faça um pequeno furo com pinça fina e remova suavemente a camada fina do osso33. Use agulha gancho-derrubado feito-à-medida para remover o dura. Minimize o tamanho da craniotomia e da durotomia para evitar o desenvolvimento de edemas e para minimizar pulsações cardíacas e/ou respiratórias do cérebro. Nota: A craniotomia deve ser preenchida com uma gota de solução salina para evitar a secagem e, em seguida, reabastada regularmente durante o experimento (Figura 2).</li>
</ol>3. inserção da sonda multicanais de silício
<ol><li>Use os braços Stereotaxic em um ângulo ligeiro do AP (20 °) para que a ponta de prova do silicone deixe o espaço amplo para o posicionamento dos outros dois implantes e para ter a gravação e os locais da injeção do elétrodo, da bomba de íon, e da micropipeta tão perto como possível. Nota: Eletrodos, seringas e bombas de íons foram cobertos com uma gota de solução de mancha DiI (1, 1 '-Dioctadecyl-3,3,3 ',3 '-perclorato de tetramedilindocarbocyanina [DiI]), para a visualização post hoc dos traços de implante (0,5 mg/ml DiI em dimetil sulfóxido).</li>
	<li>Coloc a ponta de prova do silicone no braço Stereotaxic Unido a um suporte magnético e coloc o ao lado do frame Stereotaxic. Ajuste o ângulo AP (20 °), e conecte então a ponta de prova ao headstage e ao parafuso à terra.</li>
	<li>
Abaixe lentamente a sonda de silício no hipocampo com a ajuda do braço estereotódico mícron-preciso ou de um micromanipulador motorizado para evitar movimentos laterais (Figura 2 e Figura 3).
	<ol>
<li>Inicie o software de gravação e registre — com o headstage, o amplificador conectado e um computador — sinais neuronais elétricos enquanto move a sonda de silício multicanal do topo do córtex até que a posição dorsoventral (DV) direcionada seja atingida (- 1.800 μm da superfície cortical). Grave e assista ao sinal de potencial de campo local (LFP) durante a penetração na tela do computador. Nota: Controlar a descida da sonda de modo que ele está se movendo lentamente e continuamente durante a gravação, para ter um melhor controle visual para a penetração e para atingir a zona-alvo.</li>
		<li>Use a atividade de ondulação na camada piramidal da formação do hipocampal no LFP gravado como um marcador da zona alvo. Nota: A atividade de ondulação é visível em um ou dois canais vizinhos da sonda multicanais de silício (si) com uma distância de 100 μm entre os locais de gravação (Figura 4).</li>
		<li>Grave sinais de LFP das camadas do córtex e do hipocampo simultaneamente através do software do amplificador multicanal (ver tabela de materiais) com a ajuda das sondas de si multicanal (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inserção de μFIP
<ol><li>Conecte os tubos (veja a tabela de materiais) à entrada do μFIP e encha a ponta de prova com a solução de 0, 5 M GABA. Retire os tubos e feche a entrada com a embalagem de película de parafina. Ligue os cabos eléctricos à unidade de medição de origem.</li>
	<li>Insira o μFIP com a ajuda do braço estereotaxico em um ângulo mediolateral (MP) (20 °). A sonda si permanece inserida durante todo o processo. Nota: μfip é muito flexível e pode beneficiar da sustentação de um pincel pequeno e limpo para mantê-lo reto até que alcangue a superfície do cérebro. Após essa etapa, μFIP pode ser abaixado suavemente com movimentos axiais.</li>
	<li>Abaixe o μFIP lentamente com movimentos axiais e nunca deixe dobrar durante a trajetória até atingir a coordenada dorsoventral (DV) (-1.200 μm da superfície cortical). Nota: Tente colocar os dois dispositivos (μFIP e sonda de silício) o mais próximo possível, considerando a distância de 300 μm da saída da ponta μFIP. Cuidado: Evite quaisquer problemas mecânicos entre os dispositivos e seus conectores durante a inserção (Figura 2b e Figura 3B).</li>
</ol>5. preparação de dispositivos para indução de apreensão
<ol><li>Mude a agulha metálica da seringa (10 μL) (ver tabela de materiais). Retire a parte metálica da agulha, coloque e fixe a micropipeta (diâmetro exterior [OD]: 1,2 mm, diâmetro interno [ID]: 0,75 mm, diâmetro da ponta: 20 – 50 μm com ± 0,5 cm de afilamento da haste) e, em seguida, substitua o elemento de fixação da agulha.</li>
	<li>Posicione a seringa e a micropipeta de borosilicato anexada em um ângulo de 20 ° deslocamentos (LM) para a injeção de 4ap (50 mm em líquido cefalorraquidiano artificial [ACSF]). Atenção: Não utilize a agulha metálica da seringa ou uma micropipeta com uma ponta maior que 50 μm.</li>
	<li>Desenhe 500 nL – 1 μL de 50 mM 4AP com a ajuda de uma bomba de microinjecção automatizada.</li>
</ol>6. inserção da pipeta de vidro unida a uma seringa para a injeção 4AP
<ol><li>Abaixe a micropipeta de vidro anexada à seringa para a posição DV direcionada (-1.500 μm) e, em seguida, injete 250 nL da solução 4AP (Figura 2 e Figura 3). Inicie a gravação com o software de gravação. Assista à tela e aguarde até que o primeiro pico Interictal apareça.</li>
	<li>Inicie a entrega de GABA por μFIP imediatamente com a aparência do primeiro ponto Interictal. Forneça o GABA aplicando 1 V entre a fonte e o alvo para 100 s seguidos por 1 s fora, por 30 ciclos. Com a ajuda do software de gravação, recorde de um mínimo de 2 h. Nota: A massa total do GABA entregue é de cerca de 1 nmol (Figura 5).</li>
	<li>No final do experimento, retire suavemente as sondas inseridas e o parafuso de aterramento, e retire o animal do equipamento estereotódico. Os animais foram eutanasiados usando uma overdose de drogas (i. p. 100mg/kg pentobarbital). A morte foi confirmada pela cessação da respiração e da circulação.</li>
</ol>7. avaliação da colocação dos implantes
<ol><li>Após a eutanização do animal, perfuse-o transcardialmente, primeiro com 50 mL de soro fisiológico e, em seguida, com 150 mL de uma solução fixativa gelada contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato de 0,1 M (PB)34. Atenção: O PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>Decapitar o animal, e depois remover a pele e o músculo do topo e dos lados do crânio. Partindo do forame Magnum, faça incisões laterais no crânio em direção às orelhas e uma incisão sagital da linha média, tomando muito cuidado para não danificar o cérebro. Retire suavemente o crânio com um aparador de ossos. Retire o cérebro e, em seguida, corte um bloco de tecido da região de interesse (a partir do ponto Bregma,-1 a-3 mm AP) com a ajuda de uma matriz cerebral (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Cole o bloco do tecido ao suporte do espécime de um do, põr o carrinho nele, e ajuste o do à espessura de 40 μm em um banho do PB faz seções do coronal de 40 μm.</li>
	<li>Lave extensivamente com 0,1 M PB. Siga o protocolo histológico para a coloração ácida de glial fibrilary (GFAP) que mancha31.</li>
	<li>Monte seções em lâminas e cubra-as com um meio de montagem contendo 2-(4-amidinofenil)-1H-indole-6-carboxamidina (DAPI) (ver tabela de materiais).</li>
</ol>8. microscopia confocal
<ol><li>Coloc as corrediças com as seções coronais manchadas um objetivo 20x de um microscópio confocal. Selecione a região de destino.</li>
	<li>Escolha os conjuntos de filtros de excitação e emissão (exc/EMS) ideais para os corantes da seguinte forma: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm e fluoresceina (ver tabela de materiais) = 490/525 nm. Nota: Desde que a mancha varia por a seção, uma escala apropriada da excitação e da deteção mínimas e máximas precisa de ser determinada para cada seção, onde as regiões menos densas e as mais densas ambos mostram a emissão.</li>
	<li>Escolha a região menos densa e ajuste a intensidade do laser e a deteção aos valores elevados, e verifique então nas regiões as mais mais densas se estes valores causam o supersaturação da emissão detectada. Em caso afirmativo, diminua os valores e verifique-os novamente com a região menos densa. Iterar essas etapas até chegar à detecção mais alta possível em níveis de coloração baixos e níveis adequados, não saturados em áreas altamente manchadas. Repita este processo para todos os corantes.</li>
	<li>Use a função da varredura da telha do microscópio com 512 x 512 pixéis por a telha para obter uma grande vista geral dos locais da inserção da ponta de prova com uma definição adequada para o processamento post hoc.</li>
</ol>

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<li>Szente, M., Baranyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+aminopyridine-induced+ictal+seizure+activity+in+the+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex.</a> Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).</li>
<li>Proctor, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+drug+delivery+for+seizure+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic drug delivery for seizure control.</a> Science Advances. 4 (8), eaau1291(2018).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%E2%80%99s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates+Fourth+Edition%22">Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+stabilizing+craniotomy-duratomy+technique+for+single-cell+anatomo-electrophysiological+exploration+of+living+intact+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+epilepsy+and+pharmacoresistant+epilepsy+in+adults%3A+a+population-based+study+in+a+Western+European+country%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country.</a> Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Desenvolvendo um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, SLEs poderia com sucesso ser controlado com a ajuda de um μFIP implantado no foco epileptic. Os agradecimentos a sua capacidade para entregar GABA com precisão temporal e espacial, SLEs 4AP-induzidos foram controlados no início das apreensões. O tratamento da epilepsia é teoricamente possível se o controle das descargas da rede neural é conseguido no lugar do começo da apreensão. O protocolo apresentado provou isso possível se a localiz...

A epilepsia é a quarta desordem neurológica mais comum: cerca de 1% da população sofre de epilepsia, e cerca de um terço dos afetados têm convulsões recorrentes. Na maioria dos casos, as convulsões podem ser controladas com medicação. No entanto, o tratamento medicamentoso precisa ser ajustado para cada paciente individualmente, onde a dosagem adequada pode levar anos para encontrar1,2. Adicionalmente, a maior parte da medicação tem efeitos colaterais graves que reduzem a qualidade de vida3,4,5,6,7. Finalmente, em 30% dos casos os pacientes são resistentes à medicação, e no caso de um locus gerador de convulsão único constante, apenas a neurocirurgia resectiva pode atenuar a ocorrência de convulsões8. Conseqüentemente, uma iniciativa principal na pesquisa moderna da epilepsia é descobrir as estratégias novas que podem impedir apreensões periódicas nos pacientes em risco, ao reduzir a necessidade de terapias fortes da droga e de cirurgias resective invasoras.
As apreensões epilépticas ocorrem quando há um desequilíbrio dentro dos circuitos excitatórios e inibitórios durante todo o cérebro (epilepsia generalizada) ou em uma parte localizada do cérebro (epilepsia focal), tais que os neurônios corriam em uma forma anormal9 , 10 de , 11. as Drogas antiepilépticas podem atuar de duas maneiras diferentes na prevenção da apreensão: diminuindo a excitação ou aumentando a inibição12. Especificamente, eles podem modificar a atividade elétrica das células neuronais, afetando os canais iônicos na membrana celular13 ou agir sobre a transmissão química entre os neurônios, afetando o NEUROTRANSMISSOR inibidor GABA ou o excitatório glutamato nas sinapses14,15. Para alguns medicamentos, o modo de ação é desconhecido18. Além disso, os tratamentos medicamentoso têm um efeito contínuo sobre os pacientes e não podem se adaptar à dinâmica de prevalência de crises convulsivas. Idealmente, drogas com mecanismos específicos de ação atuariam nos processos epilépticos subjacentes. Um tratamento óptimo não tocaria o interictalmente do cérebro mas actuaria imediatamente quando uma apreensão começa se tornar. Em contraste com isso, em todos os casos de epilepsia, a medicação agora significa um tratamento sistemático, afetando todo o cérebro e todo o corpo do paciente9.
As apreensões epilépticas podem aparecer muitos anos após o insulto inicial tal como o traumatismo de cérebro. O período entre o insulto inicial e a ocorrência das primeiras apreensões espontâneas é caracterizado por reorganizações moleculars e celulares consideráveis, incluindo a morte neuronal com o desaparecimento de conexões de rede neuronal e axonal sprouting/neosynaptogenesis com a aparência de conexões novas19,20,21. Uma vez que as apreensões se tornam recorrentes, sua frequência e gravidade tendem a aumentar, envolvendo mais regiões cerebrais. É importante distinguir os locais do início da apreensão (regiões epileptogenic) das redes da propagação, porque as réguas da gênese e da propagação da apreensão podem diferir. Pesquisas realizadas em tecidos humanos e modelos experimentais de epilepsia forneceram dados importantes sobre a reorganização dos circuitos e sua capacidade de gerar convulsões20,21,22, 23. no entanto, é difícil determinar se essas reorganizações são respostas adaptativas ou se elas são causalmente relacionadas à epileptogênese ou à gênese da convulsão e à propagação12.
Portanto, localizando o foco epiléptico e aplicando drogas antiepilépticas localmente são um dos principais desafios na pesquisa contemporânea de epilepsia. Vários experimentos utilizando modelos animais de epilepsia e alguns estudos clínicos objetivam encontrar o início dos eventos convulsivos e definir os mecanismos subjacentes no cérebro24,25,26,27. Para tanto, desenvolvemos um novo protocolo experimental utilizando o modelo de epilepsia induzido pelo 4ap28,29,30,31 em uma preparação aguda de camundongo, o que permite a inserção precisa de três dispositivos na área dada do hipocampo, onde a atividade de rede in vivo é manipulada de forma altamente localizada. A injeção 4AP localizada por uma micropipeta de vidro ajuda a induzir SLEs epileptic em um ponto localizado no hipocampo, quando com a ajuda da ponta de prova polímero-baseada nova do μFIP o controle da atividade da apreensão é conseguido simultaneamente gravando o neuronal atividade elétrica com os locais de gravação do dispositivo. A atividade de campo local de hippocampal é monitorada igualmente com uma ponta de prova multicanal do silicone em uma maneira camada-específica no córtice e no hipocampo simultaneamente.
As pontas de prova recentemente inventadas do μfip trabalham usando um campo elétrico aplicado para empurrar as drogas carregadas armazenadas em um canal microfluídicos através de uma membrana da troca iónica (IEM) e para fora ao tecido circunvizinho (Figura 1). O IEM transporta seletivamente somente um tipo de íon (cátion ou Anion) e, assim, trabalha para limitar a difusão passiva no estado "off" e o transporte de espécies oposta carregadas do tecido circunvizinho no dispositivo. O campo elétrico é criado demanda aplicando uma pequena voltagem (< 1 V) entre o eletrodo de origem que é interno ao canal microfluídico e um eletrodo alvo que é externo ao dispositivo (neste caso, o parafuso de cabeça no modelo animal). A taxa de entrega de fármacos é proporcional à tensão aplicada e à corrente medida entre os eletrodos de origem e alvo. A tunabilidade precisa da entrega de fármacos é uma das principais vantagens do μFIP. Outra vantagem crítica, em comparação com os sistemas de entrega de drogas fluídico ou à base de pressão, é que no μFIP há apenas um aumento de pressão insignificante na tomada de entrega de medicamentos, pois as drogas são entregues em todo o IEM sem sua solução transportadora.
Há uma pequena quantidade de vazamento passivo de GABA quando o μFIP é "desligado", mas isso foi encontrado para não efeito SLEs. O μFIP é feito medida seguindo métodos convencionais da microfabricação que nós relatamos previamente31.
Desde que uma maneira de impedir apreensões periódicas é o bloqueio de descargas da rede no início ou mesmo antes do primeiro evento da apreensão, o método apresentado para entregar o neurotransmissor inibidor GABA no foco epileptic tem grande potencial terapêutico para o controle da apreensão nos pacientes com epilepsia focal. Como o GABA é um substrato endógeno, ele deixa Propriedades neuronais intrínsecas inalteradas em concentrações fisiológicas. A aplicação local de baixos níveis de GABA só afetará as células naturalmente sensíveis à inibição, e só vai causar efeitos semelhantes à inibição fisiológica, ao contrário da estimulação cerebral profunda (DBS), que tem ações inespecíficas, estimulando todas as células da rede neuronal em seu ambiente, causando uma resposta misturada que envolve a excitação e a inibição. Em conclusão, o método proposto fornece uma abordagem mais específica para o controle de crises do que o DBS.

<table><tbody><tr><td>4AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab15007</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Neuralynx, Montana, EUA</td><td>Amplificador Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ampliplex</td><td>KJE-1001</td><td></td></tr><tr><td>Atlas Stereotaxique&nbsp;</td><td>Allen Atlas</td><td>978-0470054086</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidro borosilica</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-15</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrix</td><td>WPI&nbsp;</td><td>RBMA-200C</td><td></td></tr><tr><td>Aparador de ossos</td><td>FST</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Conector</td><td>INSTECH</td><td>SC20/15</td><td></td></tr><tr><td>Coton tige</td><td>Monoprix</td><td>EMD 6107OD</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Menzel-Vidro</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>FOREDOM</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>F.S.T.</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Anticorpo Monoclonal</td><td>Thermofisher</td><td>53-9892-80</td><td></td></tr><tr><td>GOPS</td><td>Sigma</td><td>440167-100M</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton seringe&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Componente</td><td>de Parafuso de Cabeça Fornecido</td><td>TX00-2FH</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento&nbsp;</td><td>Aparelho Harvard</td><td>341446</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Injeção</td><td>WPI&nbsp;</td><td>UMP3-3</td><td></td></tr><tr><td>Keithley</td><td>Tektoronix</td><td>216A</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Renaudin</td><td>5787419</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Supertech Instruments</td><td>MH-1</td><td></td></tr><tr><td>Ratos</td><td>Charles River</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador motorizado</td><td>Scientifica, Reino Unido</td><td>IVM</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>7558807</td><td></td></tr><tr><td>NeuroTrace DiI&nbsp;</td>Toalha de papel <td>Thermofisher</td><td>N22880</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KIMBERLY CLARK</td><td>7552000</td><td></td></tr><tr><td>PB</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>PEDOT:PSS</td><td>CLEVIOS</td><td></td><td></td></tr> 81076212 <tr><td>PFA</td><td>Sonda</td> de temperatura retal Acros Organic <td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho</td><td>Harvard</td><td>521591</td><td></td></tr><tr><td>Ropivacaína&nbsp;</td><td>KABI</td><td>1260216</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>F.S.T</td><td>AUST</td><td></td></tr> R195806 <tr><td>Seringue&nbsp;</td><td></td> Braçadeira de serrefine 324826 <td></td><td>médica</td></tr><tr><td></td><td>BD F.S.T</td><td>18050-28</td><td>4 é recomendada</td></tr><tr><td>Sonda de silicone</td><td>NeuroNexus, Michigan, EUA</td><td>A2x16-10mm-50-500-177 ou A1x16-5mm-150-703</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotóxico</td><td>Stoelting</td><td>51733U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Slide</td><td>ThermoScientific</td><td>J38000AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>INSTECH</td><td>Vaselina LS20</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Laboratoire Gilbert</td><td>3518646126611</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield DAPI</td><td>Vector Laboratories, Califórnia, EUA</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT1200S</td><td>Leica Microsystems</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>Sonda de</td> silício <td>Bayer 4007221032311</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Neuromicrosystems Ltd</td><td>A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50</td><td></td></tr></tbody></table>

a entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (gaba) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

Electrophoretic Delivery of &#x3B3;-aminobutyric Acid (GABA) into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

A epilepsia é um grupo de distúrbios neurológicos que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Embora o tratamento com medicação seja útil em 70% dos casos, efeitos colaterais graves afetam a qualidade de vida dos pacientes. Além disso, uma porcentagem elevada de pacientes epileptic é droga-resistente; em seu caso, a neurocirurgia ou a neuroestimulação são necessárias. Conseqüentemente, o objetivo principal da pesquisa da epilepsia é descobrir as terapias novas que são ou capazes de curar a epilepsia sem efeitos secundários ou de impedir apreensões periódicas em pacientes droga-resistentes. A Neuroengenharia fornece novas abordagens usando estratégias e tecnologias inovadoras para encontrar melhores soluções para curar pacientes epilépticos em risco.
Como uma demonstração de um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, um sistema electrophoretic direto in situ da entrega da droga é usado. A saber, uma sonda neural incorporando uma bomba de íon microfluídico (μFIP) para a entrega de medicamentos demanda e gravação simultânea de atividade neural local é implantada e demonstrou ser capaz de controlar a convulsão induzida por 4-aminopyridina (induzida por 4AP) como atividade de evento (SLE). A concentração do ácido γ-aminobutírico (GABA) é mantida na escala physiological pelo controle preciso da entrega de GABA para alcangar um efeito antiepiléptico no foco da apreensão mas para não causar explosões overinibição-induzidas da repercussão. O método permite a deteção da atividade patológica e da intervenção parar apreensões entregando neurotransmissores inibitórios diretamente ao foco epileptic com controle armazenamento preciso.
Em conseqüência dos desenvolvimentos ao método experimental, os SLEs podem ser induzidos em uma maneira altamente localizada que permita o controle da apreensão pela entrega precisamente ajustada de GABA no início da apreensão.

Usando o procedimento apresentado aqui com um modelo da epilepsia 4AP em ratos anestesiados, o controle de apreensões epileptic pode ser conseguido no foco epileptic. A localização precisa dos implantes (Figura 2) ajudou a registrar potenciais de campo hipocampal local (lfps, Figura 4), para induzir pequenas convulsões hipocampais e para entregar GABA no início da apreensão. A localização dos implantes foi verificada após cada ex...

O desafio da pesquisa da epilepsia é desenvolver tratamentos novos para os pacientes onde a terapia clássica é inadequada. Usando um protocolo novo — com a ajuda de um sistema implantáveis da entrega da droga — nós podemos controlar apreensões em ratos anestesiados pela entrega electrophoretic de GABA no foco epileptic.

A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

Epilepsy is a group of neurological disorders which affects millions of people worldwide. Although treatment with medication is helpful in 70% of the ...

Nosso protocolo aproveita a administração local do neurotransmissor inibidor de ocorrência natural GABA usando um dispositivo muito novo, que poderia propor uma nova solução no tratamento de convulsões epilépticas. A bomba de íons microaerofílico nos permite ter um controle muito preciso sobre exatamente quando e onde estamos entregando drogas. O parto eletroforético com problemas poderia ser modificado para atingir outras doenças neurológicas.Outro benefício desta técnica de entrega de drogas é que há um aumento de pressão muito insignificante na tomada de entrega de drogas porque não há fluido que está realmente sendo entregue. Em vez disso, são apenas as moléculas de drogas em si. Uma vez que a localização próxima das sondas será o maior problema, é muito aconselhável testar seus ângulos de alinhamento e posicionamento com sondas falsas no quadro estereotaxic.Comece fixando a cabeça de um rato anestesiado em um quadro estereotaxico e usando uma agulha de calibre 30 para injetar um analgésico local subcutânea no local de incisão planejado. Depois de cinco minutos, use um bisturi para fazer uma incisão no crânio. E use fórceps finos para retrair suavemente a pele.Aperte a pele com

electrophoretic-delivery-aminobutyric-acid-gaba-into-epileptic-focus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste artigo, descrevemos o procedimento de cirurgia e tratamento de dicas para implantação de ultra-fina matriz de microeletrodos poliimida-based (PBM-array) no crânio do rato para a aquisição de alta densidade encefalografia (EEG) em um modelo de mouse.

Gravações de alta densidade EEG dos Ratos movimentando-se livremente usando Polyimide baseado microeletrodos

Este vídeo demonstra o processo de indução de epilepsia em camundongos usando injeções de pentilenotetrazol (PTZ), um antagonista do receptor GABA-A. A administração intraperitoneal repetida de PTZ reduz progressivamente o limiar convulsivo, inibindo o influxo de íons cloreto, interrompendo a neurotransmissão inibitória e levando à hiperexcitabilidade nos neurônios que desencadeiam convulsões. Esse processo resulta em inflamações e no desenvolvimento de convulsões espontâneas, imitando a...

Estabelecendo um modelo de crise epiléptica induzida por pentilenotetrazol em camundongos

Fonte: Slezia, A. et al. A entrega eletroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) no foco epiléptico previne convulsões em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega eletroforética de ácido gama-aminobutírico (GABA) para inibir a atividade convulsiva em um camundongo anestesiado. Ele descreve as etapas envolvidas na implantação da sonda, registro da atividade neural, indução de convulsões e entrega controlada de GABA por meio de uma bomba de íons microfluídica para avaliar...

Entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico de um camundongo anestesiado

Não restrição EEG radiotelemetria é uma abordagem metodológica valiosa para gravar in vivo eletroencefalogramas de longo prazo de roedores que se movem livremente. Este protocolo detalhado descreve epidural estereotáxico e colocação de eletrodos intracerebral profunda em diferentes regiões do cérebro a fim de obter registos fiáveis ​​de CNS ritmicidade e estágios comportamentais relacionadas com o SNC.

Não restrição EEG Radiotelemetria: Epidural e Deep intracerebral estereotáxica EEG Colocação de eletrodos

Este artigo demonstra o desempenho da acupuntura, modelos de epilepsia e a análise do sono em roedores. O procedimento de acupuntura e a identificação dos pontos de acupuntura são descritos. Pilocarpina ou pentilenotetrazol (PTZ) é usado para induzir epilepsia. Eletrocorticograma (ECoG), eletromiograma (EMG), temperatura cerebral e registros de atividade locomotora são empregados para análise do sono.

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.

Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

Este protocolo descreve um método de inflamação química com mielinização e fornece um modelo do rato da epilepsia. Este protocolo também pode ser usado para investigar a vulnerabilidade à indução de convulsões e patogênese após crises epilépticas em ratos.

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Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

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Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

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Este relato descreve os métodos para gerar um modelo de epilepsia do lobo temporal baseado no kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre transgênicos. Camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para determinar o que causa epilepsia e para rastrear novas terapias.

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

A amígdala desempenha um papel fundamental na epilepsia do lobo temporal, que se origina e se propaga a partir dessa estrutura. Este artigo fornece uma descrição detalhada da fabricação de eletrodos cerebrais profundos com funções de gravação e estimulação. Introduz um modelo de epilepsia do lobo temporal medial originária da amígdala.

Usando um eletrodo bipolar para criar um modelo de rato com epilepsia do lobo temporal por acendimento elétrico da amígdala

Aprenda a entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico para controle de crises em ratos. Este método permite administração local precisa do neurotransmissor inibitório, oferecendo nova abordagem terapêutica para epilepsia.

A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

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