Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa azul permite a análise de complexos em tato do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. É uma técnica conveniente e barata que pode ser usada para sobrepor a montagem de complexos inteiros do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. Para preparar os lises mitocondriais, primeiro use a solução PBS gelada para lavar suavemente as células uma vez.

Raspe as células e pelota-as a 4 graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, lave a pelota celular duas vezes com o PBS gelado e a centrífuga a quatro graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de 100x inibidor de protease a 20 mililitros de PBS.

Suspenda-as as células da mistura inibidora de protease PBS a uma concentração proteica final de cinco miligramas por mililitro. Para preparar 3,3 milimônios em PBS com inibidor de protease, dissolva quatro miligramas de digitonina em um mililitro de PBS a 100 graus Celsius até que nenhum precipitado seja visível. Esfrie no gelo imediatamente e adicione 10 microlitrais de 100x inibidor de protease a um mililitro da solução digitonin.

Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease de digitonina às células na concentração final de 1,65 mililitro. Misture bem e incuba no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease PBS às células ao volume final de 1,5 mililitros.

Centrífuga a 4 graus Celsius a 10.000 G por 10 minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente a pelota mitocondrial no tampão mitocondrial. Prepare um mililitro de montá-loreal fresco de 10% em solução inibidora de PBS.

Adicione 10% de montagem loreal às mitocôndrias na concentração final de 1%Incubar no gelo por pelo menos 15 minutos. Centrífuga a 4 graus Celsius a 20.000 G por 20 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo e adicione o tampão de amostra.

Para preparar o gel de gradiente para a página nativa azul, primeiro coloque o fabricante de gradiente em uma placa de mexida e conecte-o com uma tubulação flexível à bomba peristáltica. Coloque um conjunto de infusão com uma agulha na tubulação. Coloque um agitador magnético na câmara proximal do fabricante de gradientes e lave a tubulação com água destilada na velocidade máxima da bomba por 10 minutos.

Em seguida, esvazie a tubulação e o fabricante de gradientes. Use uma pipeta para remover qualquer sobra de água destilada no canal entre as câmaras do fabricante de gradientes. Feche o canal e a tubulação com a válvula.

Monte duas placas de vidro no suporte e coloque-a no suporte. Usando o orifício na parte inferior do suporte de gel, coloque a agulha conectada ao tubo entre as placas de vidro. Para fazer um gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primeiro prepare soluções de 6% e 15% de gel e mantenha-as no gelo.

Misture-os suavemente para evitar fazer bolhas de ar. Em seguida, carregue a extremidade proximal da câmara de tubos de misturador de gel gradiente com 2,6 mililitros do gel de 6% e a extremidade distal com 2,1 mililitros do gel de 15%. Em seguida, ligue o agitador magnético e abra a tubulação e o canal entre as câmaras do criador de gradientes.

Ligue imediatamente a bomba peristáltica para cinco mililitros por minuto. Encha as placas de vidro e remova a agulha quando não houver gel na tubulação. Sobreponha suavemente o gel com água destilada e mantenha o gel à temperatura ambiente por pelo menos uma hora.

Lave a tubulação imediatamente preenchendo as câmaras de gradiente com água destilada e usando a bomba peristáltica na velocidade máxima. Adicione seis mililitros da água destilada a três mililitros do tampão de gel 3x para fazer 1x tampão de gel. Com um papel filtro, remova suavemente a água destilada da superfície do gel.

Lave a superfície do gel com o tampão de gel 1x e remova suavemente o tampão com o papel do filtro. Prepare gel de 4% de empilhamento de acordo com o manuscrito. Misture suavemente para evitar fazer bolhas de ar.

Em seguida, coloque o pente entre as placas de vidro e despeje o gel de empilhamento sob o pente. Mergulhe o pente completamente. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por pelo menos 30 minutos.

Em seguida, retire o pente e use uma pipeta para lavar os poços com tampão de gel 1x. Para realizar a eletroforese de gel nativo azul, primeiro, adicione o tampão de cátodo azul ao de gel. Use uma pipeta para lavar e encher os poços com o tampão de cátodo azul.

Em seguida, carregue de 5 a 30 microgramas de amostras de proteínas nos poços. Encha suavemente a fita de gel até a parte superior com o tampão de cátodo azul e o tanque com o tampão de ânodo. Primeiro, execute o gel a uma tensão constante de 40 volts por 15 minutos.

Em seguida, aumente a tensão para 80 volts. Execute o gel até que o corante atinja 2/3 do comprimento do gel. Substitua o tampão do cátodo azul pelo tampão do cátodo e continue a eletroforese até que a frente de corante escora o gel.

Recupere as placas de vidro e transfira as proteínas para a membrana PVDF por manchas semi-secas. Use uma tensão constante de 25 volts e uma corrente limitada a um ampere por 30 minutos. A montagem dos complexos da cadeia respiratória nas células neuroblastoma humanas foi inibida no tratamento de clororamfenícol em comparação com as células de controle sem tratamento.

Em contraste, os complexos codificados pelos genes nucleares foram regulados. A degradação dos complexos de fosforilação oxidativa foi observada em múltiplos ciclos de congelamento. A qualidade do gel pode afetar a detecção dos complexos de fosforilação oxidativa.

Além disso, a desmontagem da membrana reduziu a relação sinal-ruído. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar de realizar uma preparação simples e eletroforese de gel em condições frias para preservar os complexos OXPHOS em tato. Seguindo a página nativa azul, uma página de SDS de segunda dimensão pode ser aplicada para estudar as subumidas proteicas dos complexos da cadeia respiratória.

A página nativa azul permite que os pesquisadores estudem a montagem de complexos e até mesmo super-complexos do sistema de fosforilação oxidativa.