Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting
12 de fevereiro de 2019
Este protocolo demonstra a análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul. Aqui, é descrito o método aplicado para culturas de células humanas.
A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa azul permite a análise de complexos em tato do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. É uma técnica conveniente e barata que pode ser usada para sobrepor a montagem de complexos inteiros do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. Para preparar os lises mitocondriais, primeiro use a solução PBS gelada para lavar suavemente as células uma vez.
Raspe as células e pelota-as a 4 graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, lave a pelota celular duas vezes com o PBS gelado e a centrífuga a quatro graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de 100x inibidor de protease a 20 mililitros de PBS.
Suspenda-as as células da mistura inibidora de protease PBS a uma concentração proteica final de cinco miligramas por mililitro. Para preparar 3,3 milimônios em PBS com inibidor de protease, dissolva quatro miligramas de digitonina em um mililitro de PBS a 100 graus Celsius até que nenhum precipitado seja visível. Esfrie no gelo imediatamente e adicione 10 microlitrais de 100x inibidor de protease a um mililitro da solução digitonin.
Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease de digitonina às células na concentração final de 1,65 mililitro. Misture bem e incuba no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease PBS às células ao volume final de 1,5 mililitros.
Centrífuga a 4 graus Celsius a 10.000 G por 10 minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente a pelota mitocondrial no tampão mitocondrial. Prepare um mililitro de montá-loreal fresco de 10% em solução inibidora de PBS.
Adicione 10% de montagem loreal às mitocôndrias na concentração final de 1%Incubar no gelo por pelo menos 15 minutos. Centrífuga a 4 graus Celsius a 20.000 G por 20 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo e adicione o tampão de amostra.
Para preparar o gel de gradiente para a página nativa azul, primeiro coloque o fabricante de gradiente em uma placa de mexida e conecte-o com uma tubulação flexível à bomba peristáltica. Coloque um conjunto de infusão com uma agulha na tubulação. Coloque um agitador magnético na câmara proximal do fabricante de gradientes e lave a tubulação com água destilada na velocidade máxima da bomba por 10 minutos.
Em seguida, esvazie a tubulação e o fabricante de gradientes. Use uma pipeta para remover qualquer sobra de água destilada no canal entre as câmaras do fabricante de gradientes. Feche o canal e a tubulação com a válvula.
Monte duas placas de vidro no suporte e coloque-a no suporte. Usando o orifício na parte inferior do suporte de gel, coloque a agulha conectada ao tubo entre as placas de vidro. Para fazer um gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primeiro prepare soluções de 6% e 15% de gel e mantenha-as no gelo.
Misture-os suavemente para evitar fazer bolhas de ar. Em seguida, carregue a extremidade proximal da câmara de tubos de misturador de gel gradiente com 2,6 mililitros do gel de 6% e a extremidade distal com 2,1 mililitros do gel de 15%. Em seguida, ligue o agitador magnético e abra a tubulação e o canal entre as câmaras do criador de gradientes.
Ligue imediatamente a bomba peristáltica para cinco mililitros por minuto. Encha as placas de vidro e remova a agulha quando não houver gel na tubulação. Sobreponha suavemente o gel com água destilada e mantenha o gel à temperatura ambiente por pelo menos uma hora.
Lave a tubulação imediatamente preenchendo as câmaras de gradiente com água destilada e usando a bomba peristáltica na velocidade máxima. Adicione seis mililitros da água destilada a três mililitros do tampão de gel 3x para fazer 1x tampão de gel. Com um papel filtro, remova suavemente a água destilada da superfície do gel.
Lave a superfície do gel com o tampão de gel 1x e remova suavemente o tampão com o papel do filtro. Prepare gel de 4% de empilhamento de acordo com o manuscrito. Misture suavemente para evitar fazer bolhas de ar.
Em seguida, coloque o pente entre as placas de vidro e despeje o gel de empilhamento sob o pente. Mergulhe o pente completamente. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por pelo menos 30 minutos.
Em seguida, retire o pente e use uma pipeta para lavar os poços com tampão de gel 1x. Para realizar a eletroforese de gel nativo azul, primeiro, adicione o tampão de cátodo azul ao de gel. Use uma pipeta para lavar e encher os poços com o tampão de cátodo azul.
Em seguida, carregue de 5 a 30 microgramas de amostras de proteínas nos poços. Encha suavemente a fita de gel até a parte superior com o tampão de cátodo azul e o tanque com o tampão de ânodo. Primeiro, execute o gel a uma tensão constante de 40 volts por 15 minutos.
Em seguida, aumente a tensão para 80 volts. Execute o gel até que o corante atinja 2/3 do comprimento do gel. Substitua o tampão do cátodo azul pelo tampão do cátodo e continue a eletroforese até que a frente de corante escora o gel.
Recupere as placas de vidro e transfira as proteínas para a membrana PVDF por manchas semi-secas. Use uma tensão constante de 25 volts e uma corrente limitada a um ampere por 30 minutos. A montagem dos complexos da cadeia respiratória nas células neuroblastoma humanas foi inibida no tratamento de clororamfenícol em comparação com as células de controle sem tratamento.
Em contraste, os complexos codificados pelos genes nucleares foram regulados. A degradação dos complexos de fosforilação oxidativa foi observada em múltiplos ciclos de congelamento. A qualidade do gel pode afetar a detecção dos complexos de fosforilação oxidativa.
Além disso, a desmontagem da membrana reduziu a relação sinal-ruído. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar de realizar uma preparação simples e eletroforese de gel em condições frias para preservar os complexos OXPHOS em tato. Seguindo a página nativa azul, uma página de SDS de segunda dimensão pode ser aplicada para estudar as subumidas proteicas dos complexos da cadeia respiratória.
A página nativa azul permite que os pesquisadores estudem a montagem de complexos e até mesmo super-complexos do sistema de fosforilação oxidativa.
Visão Geral
Este protocolo apresenta um método para analisar os complexos da cadeia respiratória mitocondrial utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida azul nativa (BN-PAGE). A técnica é aplicada a células humanas cultivadas para avaliar a montagem dos complexos de fosforilação oxidativa mitocondrial.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia mitocondrial
- Fosforilação oxidativa
- Técnicas de eletroforese
Contexto
- Os complexos da cadeia respiratória mitocondrial são cruciais para a produção de ATP.
- Compreender sua montagem e função é essencial nos estudos do metabolismo celular.
- A eletroforese nativa em gel com azul de Coomassie é uma técnica útil para analisar complexos proteicos intactos.
Métodos Utilizados
- Eletroforese em gel de poliacrilamida azul nativa
- Células de neuroblastoma humano
- Técnicas de precipitação proteica e transferência de membrana
Principais Resultados
- O tratamento com cloranfenicol inibiu a montagem dos complexos da cadeia respiratória.
- Foi observada a superexpressão de complexos codificados pelo núcleo nas células tratadas.
- Múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento afetaram a degradação dos complexos de fosforilação oxidativa.
Conclusões
- Este estudo demonstra a viabilidade da BN-PAGE para analisar os complexos mitocondriais.
- Destaca a importância das condições para preservar a integridade dos complexos OXPHOS.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da montagem e estabilidade dos complexos mitocondriais de fosforilação oxidativa (OXPHOS) é essencial para a validação de alvos em pesquisas sobre doenças metabólicas e neurofarmacologia. A eletroforese em gel nativo azul (BN-PAGE) permite a avaliação direta de complexos proteicos intactos, fornecendo subsídios mecanicistas sobre disfunções mitocondriais induzidas por compostos ou respostas adaptativas. Isso auxilia na redução precoce de riscos, ao associar o engajamento do alvo à produção funcional de OXPHOS em modelos celulares humanos relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao resolver os estados de montagem dos complexos OXPHOS, esclarecendo o mecanismo de ação.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo por meio da visualização direta da integridade do complexo sob perturbação por compostos ou genética.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir os efeitos dos complexos codificados pelo DNA mitocondrial e pelos nucleares, informando a confiança no alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Prepara lisados mitocondriais padronizados para separação eletroforética reprodutível de complexos OXPHOS.
- Resultado quantitativo: Gera bandas de complexos resolvíveis, permitindo comparação semi-quantitativa entre diferentes condições experimentais.
- Utilidade da plataforma: Estabelece um método escalável e de baixo custo para avaliação rotineira da montagem de complexos mitocondriais em cascatas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplica-se a células humanas cultivadas, permitindo modelagem translacional de distúrbios mitocondriais e neurotoxicidade.
- Continuidade Mecanística: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica ao confirmar efeitos mediados pelo alvo no processo de montagem da OXPHOS.
- Decisões com Avaliação de Risco: Detecta degradação complexa decorrente de artefatos no manuseio de amostras (por exemplo, ciclos de congelamento-descongelamento), melhorando a confiabilidade dos dados para critérios de prosseguir/não prosseguir.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A BN-PAGE insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a otimização do composto líder, onde a avaliação da responsabilidade mitocondrial orienta a progressão do composto.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao resolver a montagem dos complexos da OXPHOS, esclarecendo os efeitos em nível de via de moduladores.
- Triagem: Permite preparações mitocondriais prontas para ensaios, com integridade dos complexos preservada, para triagem de compostos.
- Análises: Oferece separação eletroforética e detecção por imunoblot dos complexos da OXPHOS como leitura funcional para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a estudos pré-clínicos mediante o uso de células de origem humana, apoiando acompanhamento mecanicista alinhado a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma modular e reutilizável para análise de complexos mitocondriais em diversos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade no mecanismo de ação mitocondrial.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado, econômico e reprodutível para análise dos complexos OXPHOS.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de comprometimentos mitocondriais, reduzindo o risco de desistência em fases tardias.
- Impacto na Carteira: Orienta a priorização ajustada ao risco ao distinguir efeitos mitocondriais específicos do alvo de interrupções complexas fora do alvo ou artifatos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em isolamento mitocondrial e técnicas eletroforéticas nativas.
- Depende do acesso a equipamentos para géis em gradiente, centrífugas de baixa temperatura e infraestrutura para imunodetectação.
- Necessita de protocolos padronizados entre equipes para garantir a preservação dos complexos e a consistência na detecção.
- Deve levar em conta as limitações no manuseio das amostras, incluindo a necessidade de evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, que degradam os complexos OXPHOS.
- Requer a manutenção de condições frias durante toda a preparação e eletroforese para preservar as montagens intactas dos complexos.
