Name: Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Aprenda um método de sequenciamento por semicondutor para teste genético pré-implante de aneuploidia em embriões. Esta técnica oferece alta reprodutibilidade, baixo custo e tempo de execução de apenas 2 a 4 horas.

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Este estudo foi apoiado pelo fundo de investigação geral (ref n º 14162417) de Hong Kong, a Fundação Nacional de ciências naturais da China (ref n º 81860272), o principal plano de investigação da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi (ref no. AB16380219), e a concessão da Fundação da ciência de Postdoutorado de China (ref no. 2018M630993) de China.

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Os autores não têm nada a revelar.

Diferente de outras químicas de sequenciamento, o sequenciador descrito aqui usa semicondutores para a detecção de nucleotídeos. A microplaqueta própria é um dispositivo eletrônico que detecte íons de hidrogênio pela incorporação base polymerase-conduzida17, que permite o tempo de sequenciamento de 2 − 4 h do programa do Proton. Além disso, a microplaqueta é uma microplaqueta do micropoço que permita a localização de uma molécula do alvo, que seja diferente da química de sequenciamento da pilha de...

A escolha de embriões viáveis de boa qualidade com números normais de cópia cromossômica (euploid) para transferência na reprodução assistida ajuda a melhorar os resultados da gravidez. Tradicionalmente, o sistema de nivelamento morfológico bem estabelecido é amplamente utilizado para a avaliação embrionária devido à sua fácil disponibilidade e natureza não invasiva. No entanto, demonstrou-se que a avaliação morfológica só pode fornecer informações limitadas sobre a qualidade do embrião1 e o potencial de implantação2. Uma razão fundamental é a sua incapacidade na avaliação da composição cromossômica dos embriões.
O aneuploidia cromossomático (número anormal da cópia dos cromossomas) é uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação ou à perda da gravidez. A ocorrência de aneuploidia tem sido bem documentada em embriões humanos, representando 60% − 70% em embriões de fase de clivagem3,4 e 50% − 60% em blastocistos5. Isso, em certa medida, contribuiu para o gargalo na melhoria da taxa de gestação do tratamento de fertilização in vitro (FIV), que tem mantido em torno de 35% − 40%6,7. Portanto, a seleção de embriões ADN para transferência é acreditado para ser benéfico para melhorar os resultados da gravidez. Para isso, o teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) tem sido desenvolvido para investigar a viabilidade embrionária utilizando abordagens genéticas. Há um número crescente de ensaios controlados randomizados e estudos de coorte que apoiam o papel crucial da PGT-A. Provou-se que a aplicação de PGT-A diminui a taxa de aborto espontâneo e aumenta a taxa de gravidez clínica e taxa de implantação8, taxa de gravidez em curso e taxa de natalidade ao vivo9.
Historicamente, os métodos diferentes foram aplicados em PGT-A, tal como A hibridação in situ da fluorescência (peixes), A hibridação genomic comparativa (CGH), o array-CGH, e o polimorfismo único do nucleotide (SNP)-microarray. Estudos prévios indicaram que a PGT-A para embriões em fase de clivagem por FISH produz resultados que são pouco consistentes com aqueles obtidos por triagem cromossômica abrangente (CCS) de blastocistos correspondentes usando 59273array-CGH ou SNP-microarray5927310. Estas discrepâncias podem ser atribuídas ao mosaicism cromossomático, aos artefatos técnicos dos peixes, ou à Self-correção embrionário de erros cromossomáticos da segregação durante o desenvolvimento11. Tem sido amplamente reconhecido que o uso de biópsias de blastocist trofectoderma (te) para PGT-A baseado em array, como array-CGH ou SNP-microarray, é eficaz para identificar o desequilíbrio cromossômico em embriões10,12. Recentemente, o sequenciamento de célula única de última geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica no PGT-a13,14,15, o que o torna um alternativa promissora aos métodos atualmente disponíveis.
Aqui, apresentamos um método NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido, robusto e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões humanos. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação do genoma inteiro (WGA) do espécime biópsia do embrião, usando um jogo de WGA da único-pilha, seguido pela construção da biblioteca de sequenciação, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento do semicondutor.
Através da detecção dos íons H+ que são liberados de cada incorporação de trifosfato de deoxyribonucleosside durante a síntese da costa do ADN, o sistema transfere os sinais químicos (mudança do pH) capturados pelos elementos do semicondutor para dirigir dados digitais , que são interpretados mais na informação da seqüência do ADN. Eliminando a exigência para a deteção ótica cara e as reações de sequenciação complexas, esta química de sequenciação simples reduz o custo total do reagente e encurta o tempo running de sequenciamento em 2 − 4 horas16. Mais importante, com base nas especificações de desempenho do fabricante, a plataforma de sequenciamento de semicondutores pode gerar até 15 GB de dados de sequenciamento (depende da qualidade da biblioteca) por execução, que é significativamente maior do que alguns dos outros sequenciadores produzindo somente em torno de 3 − 4 dados do GB (com 2 x 75 BP leu o comprimento)17. Em aplicações clínicas de PGT-A, esta plataforma pode conseguir 24 amostras por a microplaqueta que gera até 80 milhões leituras17 e pelo menos 1 milhão leituras originais de cada amostra. A profundidade de leitura pode garantir que cada amostra tenha pelo menos 0,05 x de cobertura total do genoma. As vantagens acima desta plataforma fazem-lhe um método ideal da seleção e assim, facilitam suas aplicações largas em PGT-A18.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, Ca2+ e Mg2+ solução</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M NaOH (1,0N)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>Para solução derretida. Tubos Eppendorf LoBind de grau molecular</td></tr><tr><td>, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 Sistema de Purificação de Água ou Equivalente 18 M&Omega; sistema de água</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de amplificação PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo sistema de amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Enzima de amplificação PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo sistema de amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td><td>de amplificação Ion OneTouch</td><td>no kit: Suprimentos Ion OneTouch 2 (peça nº A26367). Componente de kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Ion PI Annealing Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de captura</td><td></td><td></td><td></td>de grânulos MyOne</tr><tr><td>Instrumento bioanalisador Agilent 2100</td><td>Solução</td><td>de</td> quebra Agilent G2939AA <td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch (tampa preta)</td><td></td><td></td><td>No kit: Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Peça nº A26429). Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Cell extraction buffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo SurePlex DNA Amplification System, número de catálogo: PR-40-415101-00.</td></tr><tr><td>Enzima de extração de células PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo Sistema de Amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Kit de chip de íon PI v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Minifuga de chip de íon, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Íon PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Íon PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Íon PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Íon Plus Kit de biblioteca de fragmentos</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Biblioteca de Fragmentos Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&ndash; Banho Seco de Temperatura</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBPróximo dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBPróximo dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrumento</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher Número de catálogo: 4474778.</td></tr><tr><td>Kit de Biblioteca de Fragmentos Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher Número de catálogo: 4469495. Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>Isso pode ser substituído pelo etanol absoluto de grau molecular de qualquer marca.</td></tr><tr><td>Tampão de diluição enzimática de extração PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo Sistema de Amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-01.</td></tr><tr><td>Tampão de diluição enzimática de extração PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo Sistema de Amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-02.</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>Este modelo foi substituído pelo Fluorômetro Qubit 4, Número de catálogo: Q33226.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit ds DNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Foaming Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Índice para código de barras de bibliotecas</td><td>BaseCare</td><td></td><td>este é um índice preparado internamente. Os usuários podem comprar produtos comerciais dos kits de adaptadores de código de barras ThermoFisher Ion Xpress (Cat. No. 4474517)</td></tr><tr><td>Ion PI Loading Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 ímã (rack magnético)</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrífuga</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Íon Plus Kit de Biblioteca</td><td>de Fragmentos ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Isso pode ser substituído por outra marca.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Água sem nuclease</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo Sistema de Amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Garrafa</td><td></td><td></td> de óleo <td>Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Peça nº A26429). Componente de kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Kit de Biblioteca de Fragmentos Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente de kit estendido na Folha 3</td></tr><tr><td>padrão</td><td></td><td></td> de DNA de fita dupla <td>Este é um padrão de DNA preparado internamente para calibração de Qubit antes da quantificação da biblioteca.</td></tr><tr><td>Tampão de pré-amplificação PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo sistema de amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Enzima de pré-amplificação PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Isso pode ser substituído pelo Sistema de Amplificação de DNA SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Biblioteca Amplificação Primer Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente do kit estendido na Folha 3</td></tr><tr><td>Filtro</td><td></td><td></td> de reação Ion OneTouch <td>Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Roteador</td><td></td><td></td> de recuperação <td>Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Tubos de</td><td></td><td></td> recuperação <td>Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> <td>de ressuspensão ISP</td></tr><tr><td>Íon Proton</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>Este modelo é importado pela Da An Gene Co., LTD. da Sun Yat-Sen University da ThermoFisher e foi certificado pela China Food and Drug Administration para aplicação clínica. O número de catálogo no ThermoFisher é 4476610.</td></tr><tr><td>Ion PI Oi? Q Sequenciamento Polimerase</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sequenciamento Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>servidor para sequenciador</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sphere Particles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix Alta Fidelidade</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25mm Filtros de Seringa</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>Tamanho dos poros: 0,45&mu;m. Especificamente para fluidos aquosos.</td></tr><tr><td>Ion PI Oi? Q W2 Solução</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 Solução</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>O Ion PGM Hi? Q View Kit de Sequenciamento</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>Componente do kit estendido na Folha 2</td></tr><tr><td>Kit de Biblioteca de Fragmentos Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente do kit estendido na Folha 3</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 execução de sequenciamento por inicialização)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>Componente do kit estendido na Folha 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi? Q OT2 200 Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>Componente do kit estendido na Folha 5</td></tr></tbody></table>

sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

O aneuploidy cromossomático, uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação, ou à perda da gravidez, foi poço-documentado em embriões humanos. O teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) é um teste genético que melhora significativamente os desfechos reprodutivos detectando anormalidades cromossômicas de embriões. O sequenciamento de próxima geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica na PGT-A. Aqui, apresentamos um método de NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação total do genoma (WGA) do espécime biópsia do embrião, seguida pela construção da biblioteca de sequenciamento, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento de semicondutores. Geralmente, para um aplicativo PGT-A, 24 amostras podem ser carregadas e sequenciadas em cada chip gerando 60 − 80 milhões de leituras em um comprimento médio de leitura de 150 pares de base. O método fornece um protocolo refinado para executar a amplificação do modelo e o enriquecimento da biblioteca de sequenciamento, tornando a detecção de PGT-A reprodutível, alta taxa de transferência, econômica e timesaving. O tempo de funcionamento deste sequenciador de semicondutores é de apenas 2 − 4 horas, encurtando o tempo de resposta de receber amostras para emitir relatórios em 5 dias. Todas estas vantagens fazem deste ensaio um método ideal para detectar aneuploidias cromossomáticos de embriões e, assim, facilitar a sua ampla aplicação em PGT-A.

Com base neste protocolo modificado, a plataforma de sequenciamento de semicondutores foi pela primeira vez, aplicada para PGT-A. Nós testamos em biópsias dos blastômeros da clivagem-fase e dos embriões do Blastocyst-estágio. Sugere-se que as pilhas biópsia submetem-se a WGA o mais cedo possível para impedir toda a degradação do ADN. Um estudo precedente comparou o desempenho de métodos diferentes de WGA e indicou que o método que nós descrevemos aqui teve a melhor uniformidade no tamanho...

Aqui, apresentamos um método de sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) com as vantagens de tempo de resposta curto, baixo custo e alta taxa de transferência.

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

O protocolo que apresentamos aqui é um semicondutor rápido e de baixo custo, métodos baseados em sequenciamento para triagem de aneuploidia em embriões. O protocolo refinado para a realização da amplificação do modelo e os arranjos da biblioteca de sequenciamento torna a detecção PGTA reproduzível, de alto rendimento, econômica e de economia de tempo. O tempo de execução deste sequenciador semi-condutor é de apenas duas a quatro horas.Encurtando o tempo de retorno do recebimento de amostras para a emissão de relatórios em cinco dias. Este método fornece sequenciamento de genoma para triagem de aneuploide, variação de número de cópia e chamadas de polimorfismo de nucleotídeos únicos. Devido a diferentes químicas de sequenciamento, a biblioteca preparada por este protocolo não pode ser sequenciada diretamente em outros sistemas de sequenciamento.Mas o mesmo sequenciador, mas diferente preparação da biblioteca, é capaz de fazer triagem pré-natal não invasiva. Demonstrando o procedimento será Xiangchun Guo, um técnico do nosso laboratório. Para começar o sequenciamento, vórtice cada biblioteca diluída e gire brevemente quatro vezes na mini centrífuga por três segundos cada vez.Em seguida, pegue cinco microliters de cada biblioteca, para se juntar ao tubo sem núcleo, um ponto cinco mililitros. Vórtice a biblioteca mista e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Adicione 150 microliters da solução de quebra, a dois novos tubos de recuperação.Instale os novos tubos de recuperação, o roteador de recuperação e a placa de amplificação. Misture invertendo a garrafa de óleo três vezes. Certifique-se de que tanto a solução de óleo quanto a solução de recuperação estão pelo menos dois terços cheios.Vortex o buffer mestre mix PCR por 30 segundos e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Vórtice as partículas da esfera e a biblioteca mista por um minuto e giro brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Em seguida, prepare uma mistura de ligadura de 2400 microlitres, adicionando 172 microliters de água sem nuclease, oito microliters da biblioteca mista, 120 microliters da mistura enzimática, e 100 microliters das partículas da esfera, ao tubo contendo 2000 microliters do buffer de mix principal PCR.Coloque uma pipeta em 800 microliters e carregue a mistura de ligadura ao filtro de reação através da porta da amostra. Inverta a garrafa de óleo três vezes e use uma pipeta P1000 para adicionar 200 microliters do óleo de reação ao filtro de reação. Selecione o proton do programa e selecione o botão assistido, para garantir que o dispositivo tenha sido configurado corretamente, seguindo as instruções no monitor.Em seguida, clique em "Em seguida, para iniciar o programa". Carregue 100 microliters da amostra do produto PCR emulsion, 130 microliters das contas lavadas, 300 microliters da solução de lavagem ES e 300 microliters da solução de derretimento na tira de oito tubos. Coloque a tira de oito tubos no sistema de enriquecimento.Instale uma ponta de pipeta e um novo tubo zero ponto dois mililitros e inicie o programa. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitros a 15.500 vezes G durante cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha dez microliters do produto de enriquecimento.Adicione 200 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitro novamente. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do produto de enriquecimento.Adicione 90 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Para preparar o modelo, vórtice o controle positivo e girar brevemente. Adicione cinco microliters do controle positivo a 100 microliters do produto de enriquecimento.Vórtice e centrífuga a 15.500 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do modelo. Em seguida, adicione 20 microliters do primer de sequenciamento e 15 microliters do tampão de ressarcimento ao tubo de modelo.Vórtice do tubo e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Incubar o tubo em um cicloviário térmico com uma tampa aquecida. Em seguida, adicione 10 microliters do tampão de carga ao tubo.Misture por pipetting para cima e para baixo. Misture os 55 microliters da amostra por tubulação para cima e para baixo e carregue a amostra para o poço de carregamento do chip. Mantenha a ponta de pipeta usada e o tubo PCR de dois mililitros de ponto zero.Coloque o chip na mini centrífuga do chip quando alguma amostra entrar no chip. Verifique a posição e centrifufique o chip por 10 minutos. Prepare 50% de tampão de enraizamento adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de água sem nuclease em um tubo de um ponto cinco mililitros.Prepare a solução de descarga, adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de 100%2-propanol em um tubo de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, prepare a mistura de espuma, adicionando 49 microlitadores do buffer de 50% de enraizamento e um microliter da solução de espuma para dois novos tubos de um ponto cinco mililitros. Pipeta ar em uma das misturas de espuma, e carregar 120 microliters das bolhas no poço de carregamento.Transfira o líquido expelido excessivo da saída bem para o poço de carregamento, e centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga do chip. Repita o processo para a segunda mistura de espuma. Adicione 55 microliters do buffer de 50% de ressarcimento ao tubo mantido em ponto zero dois mililitros.Use a ponta de pipeta mantida para pipeta para cima e para baixo. Carregue todos os 55 microliters do tampão de ressarcimento até o poço de carregamento. Centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga de chip designada.Carregue 100 microliters da solução de descarga no poço de carregamento do chip e descarte o líquido expelido do poço de saída. Repita esta etapa de carregamento uma vez. Carregue 100 microliters do buffer de 50%, no poço de carregamento do chip.Repita esta etapa de carregamento para um total de três vezes. Adicione 60 microliters do buffer de 50% de enraizamento e seis microliters da enzima sequenciamento em um novo tubo de cinco mililitros de um ponto. Misture por pipetting para cima e para baixo.Pipeta lentamente 65 microliters desta solução mista no poço de carregamento do chip, evitando bolhas. Mantenha o chip longe da luz e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Finalmente, após a incubação, carregue imediatamente o chip no sequenciador e clique em Iniciar a Sequência de Execução na tela para iniciar o sequenciamento.Uma análise estatística retrospectiva em 186 estágio de decote e 1135 embriões de estágio blastocisto resultou em taxas de sucesso de mais de 95% de WGA em ambos os tipos de amostras. As taxas de falha de controle de qualidade de sequenciamento foram de 3,4% no grupo de estágio de decote e apenas 1,9% no grupo de estágio blastocisto. Além da aneuploidia, os dados de sequenciamento podem ser usados para outras análises.Por exemplo, copiam variações numénicas com um tamanho inferior a cinco megabase, ou análise de DNA mycondrial, dependendo da profundidade e qualidade do sequenciamento. Com a melhoria na chamada do número de cópias, os pesquisadores podem investigar ainda mais o futuro do mosaico cromossômico em embriões em estágio inicial humano.

semiconductor-sequencing-for-preimplantation-genetic-testing-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.

Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

O presente estudo relata um protocolo de triagem cromossômica de embriões humanos que utiliza meio de cultura usado, o que evita a biópsia embrionária e permite a identificação de ploidia cromossômica usando NGS. O presente artigo apresenta o procedimento detalhado, incluindo a preparação do meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA), preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise dos dados.

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.

Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores

Este protocolo propõe procedimentos laboratoriais holísticos necessários para detectar polimorfismos de nucleotídeo único em amostras de câncer gástrico com base em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons. As sequências-alvo, adaptadores de ligação, amplificação e purificação de biblioteca e critérios de controle de qualidade também são descritos em detalhes.

Detecção de polimorfismo de nucleotídeo único multigênico em câncer gástrico com base na plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Relatamos métodos sobre a manipulação genética molecular da cepa Yarrowia lipolytica Po1g para melhorar a eficiência da deleção de genes. As cepas de Y. lipolytica resultantes têm aplicações potenciais na produção de biocombustíveis e bioquímicos.

Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Aprenda um método de sequenciamento por semicondutor para teste genético pré-implante de aneuploidia em embriões. Esta técnica oferece alta reprodutibilidade, baixo custo e tempo de execução de apenas 2 a 4 horas.

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

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