Name: Montagem de Nanobastões de Ouro em Metamoléculas Plasmônicas Quirais Usando Modelos de Origami de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a montar nanobastões de ouro em metamoléculas plasmônicas quirais usando origami de DNA. Este método permite criar estruturas tridimensionais com respostas quiropticas fortes para aplicações em sensoriamento.

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Os autores agradecer S. Voutilainen pela sua assistência com espectrómetro de CD. Os autores reconhecem a disponibilização de instalações e suporte técnico pela Universidade Aalto no OtaNano - Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC). Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (grant 308992) e a Convenção n. º 71364 de subvenção Horizonte 2020 inovação programa de investigação e da União Europeia sob o Marie Skłodowska-Curie.

1. projeto do origami DNA
<ol><li>Identifica o arranjo espacial relativo desejado de AuNRs e a forma adequada do modelo de origami de DNA (Figura 1A). Estime os parâmetros estruturais do AuNRs e os modelos de origami. Localize as posições aproximadas dos agrafos que precisam de mais modificação (Figura 1B).</li>
	<li>Baixe e instale o circunflexo18 para a concepção de um modelo de origami de DNA. No circunflexo, rotear os andaime e grampo vertentes de acordo com a forma desejada do modelo e gerar a sequência de fibras descontínuas clicando Seq ferramenta. Clique em Ferramenta de pintura e marcar as fibras descontínuas que exigem maior modificação (Figura 1C).</li>
	<li>Clique na Ferramenta exportar para exportar as sequências de DNA descontínuas (Figura 1C) para um arquivo. csv.</li>
	<li>Projeto double-stranded bloqueios para corrigir o ângulo de Θ entre os dois feixes de origami. Dependendo da orientação relativa dos dois pacotes, construção de origami pode adaptar-se - ou mão esquerda direita (LH/RH) quiral configuração espacial (Figura 1B).</li>
	<li>Importe o arquivo. csv a staples para um aplicativo de planilha. Adicione uma sequência de10 polyA na extremidade dos grampos utilizados para montagem de AuNR (alças). Modifica as fibras descontínuas nos sites bloqueio projetado com sequências de bloqueio. Nota: Os assemblies nos resultados representativos contêm 36 alças salientes na extremidade 3' dos fios descontínuas, 18 em cada pacote de origami de DNA, igualmente distribuídas em duas paralelas hélices cada 21 nt. A distância entre a primeira e a última posição do punho é 168 nt, aproximadamente 57 nm (consulte o arquivo anexado circunflexo).</li>
</ol>2. montagem dos modelos de origami de DNA
<ol><li>Prepare um estoque de trabalho de fibras descontínuas (SM), incluindo vertentes com alças e bloqueios, através da mistura de quantidades iguais de concentração normalizado oligonucleotides descontínuas (por exemplo,, 100 µM). Nota: Origami estruturas geralmente contêm várias centenas de fibras descontínuas. Staples são normalmente comprados de lojas especializadas na síntese química de oligonucleotídeos de DNA em multiwell (por exemplo, 96 poços) placas.</li>
	<li>Para 500 µ l de origami de nM 10, misture 50 µ l de Tris-EDTA (TE, 10x), 100 µ l de MgCl2 (100 mM), 25 µ l de NaCl (100 mM), 175 µ l de H2O, 100 µ l de SM (0,5 µM), 5 µ l de vertentes de bloqueio (5 µM) e um andaime de 50 µ l (100 nM).</li>
	<li>Recoze a mistura em um thermocycler de 80 ° C a 20 ° C, conforme descrito na tabela 1.</li>
</ol>3. purificação de origami de DNA
Nota: Esta seção descreve o protocolo para a purificação do gel de agarose. Modelos de origami de DNA também podem ser purificados usando abordagens alternativas38,39.
<ol><li>Para o 1% gel, dissolver 1 g de agarose em 100 mL de Tris-borato-EDTA (TBE, 0.5 x) aquecendo a mistura em um forno de microondas. Adicione 10 µ l de 10.000 x DNA mancha de acordo com a especificação de mancha. Para minimizar a exposição à luz UV para a etapa de extração (passo 3.6), use uma mancha de DNA que pode ser visualizada sob excitação azul.</li>
	<li>Esfriar a solução para cerca de 40 ° C e lentamente, adicionar 1 mL de MgCl2 (1.3 M) agitando. Conversão de gel e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Definir o dispositivo de eletroforese e despeje buffer corrente de frio (4 ° C) (0.5 x TBE com 11 mM MgCl2) na caixa de gel. Coloque a caixa de gel em banho de água gelada.</li>
	<li>Adicione o amortecedor do carregamento para as amostras de origami (tampão de carregamento 6 x contém 15% polysucrose 400 e 0,25% bromofenol em água). Carrega as amostras em poços com um volume adequado de acordo com o pente usado (por exemplo,, 50 µ l para um pente 8 poços de 1,5 mm de espessura).</li>
	<li>Execute a eletroforese para 2h em 80 V. Nota: Para caracterizar o origami e separar a estrutura aberta e fechada, uso 2% gel em vez de 1% e prolongar o tempo de execução para 4 h.</li>
	<li>Imagem do gel com a câmera do gel (Figura 2). Use um transiluminador de luz azul para visualizar as bandas, cortar a banda de origami, esmagar o gel em um parafilm e extrair o líquido. O rendimento de recuperação é de aproximadamente 40%.</li>
	<li>Pipetar o líquido para uma unidade de filtro centrífugo e centrifugação a 3.000 x g por 5 min. medir a absorção da solução de origami em 260 nm com um espectrómetro de UV-visível (UV-VIS). Estime a concentração de origami usando um coeficiente de extinção de 1,3 x 108 M-1·cm-1. Nota: A concentração típica da solução de origami após purificação do gel de agarose é 1-2 nM.</li>
	<li>Armazene os modelos de origami purificado a 4 ° C para uso posterior.</li>
</ol>4. síntese de ouro nanorods
Nota: O protocolo para a síntese de AuNR é adaptado do anterior literatura40 com pequenas modificações.
<ol><li>Lavar todos os copos com água régia por 5 min, enxague com água, proceda à sonicação é com água ultrapura e secá-lo antes de usar.</li>
	<li>Preparar a 0,2 M brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB), 1mm HAuCl4, 4mm AgNO3, 64 mM L (+)-ácido ascórbico e 6 mM NaBH4. Use água fria (4 ° C) para dissolver NaBH4 e mantê-lo em uma geladeira a 4 ° C. Solução de ácido ascórbico deve ser preparados na hora. Cuidado: CTAB é perigoso em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante), inalação e ingestão. Use vestuário de protecção adequado. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. NaBH4 é extremamente perigosos em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante), inalação e ingestão. Use um respirador de vapor e poeira, um jaleco, luvas e óculos de mergulho. Certifique-se de usar um respirador aprovado/certificado ou equivalente.</li>
	<li>Prepare sementes Au.<ol>
<li>Adicione 500 µ l de CTAB (0,2 M), 250 µ l de água ultrapura e 250 µ l de HAuCl4 mM (1) dentro de um frasco de vidro. Misture a 450 rpm, à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Aumente a taxa de agita a 1.200 rpm. Adicione 100 µ l de solução fria de4 NaBH (6 mM, 4 ° C). Depois de 2 min, pare a agitação e incubar a solução em um banho de água a 30 ° C por 30 min antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare AuNRs.<ol>
<li>Dissolva 0,55 g de CTAB e 0,037 g de ácido 2,6-benzoico em 15 mL de água quente (60-65 ° C) em um balão de fundo redondo. Arrefecer a solução a 30 ° C, adicionar 600 µ l de AgNO3 (4 mM) e agitar a 450 rpm por 2 min. Então, deixe a solução imperturbada por 15 min a 30 ° C.</li>
		<li>Adicionar 15 mL de HAuCl4 mM (1) para a solução e agitar a 450 rpm por 15 min. Adicionar 120 µ l de L (+)-ácido ascórbico (64 mM), em seguida, imediatamente, misture a 1.200 rpm para 30 µ l de adicionar 12 s. de sementes de Au e continue mexendo a 1.200 rpm por 30 s.</li>
		<li>Incube a solução em um banho de água a 30 ° C, durante 18 h. Não perturbar a solução e usar um tampão para tapar o balão.</li>
		<li>Transferir a solução resultante para tubos de centrífuga e centrifugar a 9.500 x g por 12 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante, dispersar a pelota em 20 mL de água ultrapura e executar mais de um passo de centrifugação.</li>
		<li>Disperse a pelota final em 3 mL de água destilada. Estime a concentração de AuNRs de uma medida de absorção UV-VIS utilizando o coeficiente de extinção para a ressonância plasmon longitudinal. O coeficiente de extinção pode ser predito usando AuNR forma parâmetros41. Armazene o AuNRs a 4 ° C para utilização posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. functionalization de ouro nanorods com ADN single-stranded
Nota: Esta seção descreve o protocolo para AuNR functionalization com DNA de cadeia simples (ssDNA), seguindo a rota de so-called baixo pH adaptada do anterior literatura42. Os AuNRs cobertos com DNA são purificados por centrifugação; Alternativamente, a purificação pode ser executada usando a eletroforese em gel de agarose.
<ol><li>Incubar a 20 µ l de polyT thiol-acrescida de DNA (1 mM) com 20 µ l de acabadas tris(2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP, 14 mM) por 1h reduzir as ligações de bissulfeto. Nota: O formulário de grupos tiol laços com AuNRs, e a sequência de polyT se com a alça de10 polyA sobre o origami, em que muitos ou poucos pares de base pode levar a um mau funcionamento ou uma montagem instável. Atenção: TCEP pode causar queimaduras graves e lesões oculares. Use luvas protetoras/protetor roupa/óculos de protecção de proteção/rosto.</li>
	<li>Mix 150 µ l de AuNRs (10 nM) e 40 µ l de thiol-DNA tratado TCEP (0,5 mM). Adicione 1% sulfato dodecyl de sódio (SDS) para a solução de AuNR para alcançar uma concentração final de SDS de 0,05%. Ajuste o pH a 2,5-3 com ~ 1 µ l de HCl (1 M).</li>
	<li>Incube durante 2 h, agitando a 70 rpm. Nota: A relação AuNR-para-DNA deve ser da ordem de 1:5, 000-15.000, dependendo do tamanho das barras. Para o AuNRs (70 nm, x 30 nm) preparado seguinte, recomenda-se o protocolo descrito na seção 4, um excesso de 13.000 de thiol-DNA.</li>
	<li>Adicione NaCl para alcançar uma concertação de NaCl final de 0,5 M e incubar durante 4 h à temperatura ambiente e agitando a 70 rpm. Nota: Uma mudança de cor nesta etapa pode indicar uma falha functionalization de DNA.</li>
	<li>Ajustar o pH a ~8.5 com amortecedor de TBE (10x) e incubar durante uma noite.</li>
	<li>Lave o DNA-AuNRs 4 x misturando as amostras com 1 mL de tampão de lavagem (0.5 x TBE com 0,1% SDS) e centrifugar 7.000 x g por 30 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o DNA-AuNRs no líquido remanescente (~ 40 µ l). Estime a concentração de DNA-AuNRs de uma medida de absorção UV-VIS, conforme descrito na etapa 4.4.5. Nota: A solução pode tornar-se ligeiramente turva em passos 5.3-5.4 devido a substituição do CTAB da superfície da AuNRs por thiol-DNA. A solução deve tornar-se evidente após aquecimento até ~ 35 ° C por 5 min.</li>
</ol>6. montagem de ouro nanorods em modelos de origami de DNA
<ol><li>Adicione a solução de DNA purificado-AuNRs, para uma concentração final de 10 mM MgCl2 . Misture o DNA-AuNRs purificado e origami para uma proporção de 10:1. Nota: Uma menor taxa pode diminuir o rendimento de produto43.</li>
	<li>Recoze a mistura na batedeira com um controle de temperatura de 40 ° C a 20 ° C e agitando a 400 rpm, seguindo o procedimento na tabela 2. Nota: Para a caracterização do CD, a amostra pode ser medida após esta etapa sem mais purificação.</li>
	<li>Use a electroforese do gel do agarose 0.7% (3,5 h a 80 V) para purificar as estruturas de origami-AuNR final.</li>
	<li>Use um transiluminador de luz branca para a imagem latente. Cortar a faixa de produto (dímero de origami-AuNR) (Figura 3), esmagar o gel em um parafilm e extrair o líquido. Pipeta o líquido em uma unidade de filtro centrífugo e centrifugação a 3.000 x g por 5 min. Ressuspender o origami-AuNRs na solução. O rendimento da recuperação do gel é aproximadamente 50%.</li>
	<li>Estime a concentração das estruturas de origami-AuNR de uma medida de absorção UV-VIS, conforme descrito na etapa 4.4.5.</li>
</ol>7. imagem de microscopia eletrônica de transmissão
Nota: Este formiato de uranilo (OVNI) protocolo de coloração é adaptado a partir de literatura anterior44.
<ol><li>Mix de 200 µ l de solução de UFo (0,75%) e 1 µ l de NaOH (5m) e vórtice imediatamente para 2-3 min. centrifugar a solução mancha durante 3-4 minutos a 14.000 x g. Protege a mancha da exposição à luz (por exemplo, por envolvê-lo em papel alumínio). Cuidado: UFo é tóxico se inalado ou ingerido e pode causar irritação nos olhos. No caso de exposição breve ou baixa poluição, use um dispositivo de filtro respiratório. No caso de exposição intensa ou mais longa, use um dispositivo de protecção respiratório autónomo. Use luvas. O material da luva deve ser impermeável e resistente ao UFo e suas soluções. Use óculos de protecção firmemente selados.</li>
	<li>Brilho da descarga-grades TEM carbono/formvar-revestido para 6 s imediatamente antes da utilização para aumentar a Hidrofilia e promover a degola das estruturas. Pipetar 5 µ l amostra gotas na grelha TEM, incubar durante 5-8 min e remova a gota tocando suavemente num filtro de papel com a borda da grade.</li>
	<li>Pipete uma grande (~ 20 µ l) e um pequeno (~ 10 µ l) gota da solução em um parafilm mancha. Coloque a grelha sobre a mancha pequena gota de solução e seque imediatamente, tocando o papel de filtro com a borda da grade. Em seguida, colocá-lo na gota de solução a grande mancha por 30 s.</li>
	<li>Remova o líquido da grelha, tocando o papel de filtro com a borda da grade. Coloque a grelha no suporte de grade. Espere para a grade secar pelo menos 10 min.</li>
	<li>Caracteriza as amostras de origami (Figura 4), AuNRs (Figura 5) e origami-AuNRs pela TEM (Figura 6).</li>
</ol>8. medição de Dicroísmo circular
<ol><li>Purge o espectrómetro de CD com N2 por 20 min. Nota: A maioria os espectrómetros de CD exigem purga com N2 antes da ignição da lâmpada. Verifique no manual do espectrómetro de CD.</li>
	<li>Defina a largura de banda, intervalo de varredura e passo de aquisição. Nota: O intervalo de varredura depende das propriedades ópticas dos AuNRs, que dependem do tamanho da AuNRs.</li>
	<li>Medida em branco CD com buffer.</li>
	<li>Medir os espectros de CD de amostras de origami-AuNR (Figura 7). Nota: Use quarts ou cubetas de vidro para medição de CD. Cubetas plásticas são impróprias para espectroscopia de CD. Também, a maioria dos espectrômetros de CD permitem a aquisição simultânea de dados de CD e absorção.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo apresenta o fluxo de trabalho inteiro de projeto, montagem, purificação e caracterização de ADN origami-baseado quirais assembleias de AuNRs. Os modelos de origami de DNA usados no protocolo são particularmente adequados para o fabrico de conjuntos de estímulos-responsivo. Vários tipos de respostas e functionalizes pode ser incorporada as vertentes de bloqueio que definem o estado quiral de origami modelo (Figura 1B)24,25,26,31. Para assemblies estáticos, modelos mais simples em forma de bloco são muitas vezes suficientes14,,45,46,47.
A abordagem baseada em origami de DNA para a fabricação de plasmônico nanostructure herda as limitações do ADN origami técnica48. O tamanho dos modelos de origami é normalmente limitado pelo tamanho da strand, andaime. A estabilidade das estruturas de DNA é reduzida em condições de lei-sal. O custo de grampo sintético fios permanece bastante elevado. No entanto, esperam-se desenvolvimentos recentes no campo da nanotecnologia de ADN estrutural para superar essas limitações49,50,,51,52,53,54 , 55.
Em comparação com outras abordagens moleculares para gerar assemblies quirais de AuNRs34,35,36,37, origami de DNA fornece um alto nível de precisão espacial e programação.
Para conseguir respostas ópticas confiáveis e reprodutíveis de assemblies quirais, recomendamos vivamente que adapta os protocolos para a síntese de AuNR40, desde que a qualidade e propriedades ópticas de produtos comerciais podem variar entre lotes. Recozimento (etapa adicional 6.2) muitas vezes é crucial para assegurar a correta fixação do AuNRs de modelos de origami de DNA (Figura 6).
Finalmente, o protocolo descrito aqui não é limitado aos assemblies quirais. Origami de DNA fornece uma plataforma muito flexível para a fabricação de nanoestruturas plasmônico complexo9,10.

DNA de nanoestruturas, origami de DNA em particular, têm sido amplamente utilizadas para organizar as moléculas e outros componentes de escala nanométrica (por exemplo, proteínas e nanopartículas [NPs]), com precisão de nanômetros em geometrias arbitrárias quase1,2 , 3 , 4 , 5. a capacidade de organizar metal NPs em modelos de origami de DNA com um alto rendimento e precisão permite a fabricação de estruturas plasmônico com propriedades óticas romance6,7,8, 9 , 10. técnica de origami de DNA é especialmente útil para a geração de estruturas plasmônico quirais, que exigem arquiteturas genuinamente tridimensional11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20.
Este protocolo descreve detalhadamente todo o processo de fabricação de ADN origami-modelo quiral módulos (assemblies) de AuNRs. O software usado para o projeto21 e estrutura previsão22,23 de origami de DNA é intuitiva e livremente disponíveis. O origami fabricação e síntese de AuNR usam equipamento de laboratório de bioquímica comum (por exemplo, thermocyclers, eletroforese em gel, pratos quentes, centrífugas). As estruturas são caracterizadas usando espectroscopia TEM e CD padrão.
Fabricação de nanoestruturas plasmônico semelhantes com métodos de cima para baixo (por exemplo, litografia de feixe de elétrons) exigiria equipamento bastante complicado e caro. Além disso, modelos de origami de DNA fornecem a possibilidade de incorporar reconfigurabilidade estrutural em assemblies plasmônico24,25,26,,27,28,29 ,30,31,32,33, que é extremamente desafiador para estruturas fabricadas com técnicas de litografia. Em comparação com outras abordagens moleculares34,35,36,37, fabricação baseada em origami de DNA fornece um alto nível de precisão espacial e programação.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2,6-dihidroxibenzóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D109606-25</td><td>98+%</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA1141414</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul&nbsp;</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-06</td><td>FastGene LED Transiluminador</td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Acros Organics</td><td>403160050</td><td>Para gel de agarorose buffer de carregamento</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo</td><td>Merck Millipore</td><td>42600</td><td>Extração de DNA de agarose</td></tr><tr><td>Espectrômetro de CD Chirascan&nbsp;</td><td>Cubeta de Fotofísica</td><td></td><td></td>Aplicada</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hellma&nbsp;</td><td>105-202-85-40</td><td>Tubos de quartzo SUPRASIL</td></tr><tr><td>DNA lobind</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biospectrometer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6135000904</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP525-10</td><td>Polysucrose 400 (Para gel de agarorose&nbsp; buffer de carregamento)</td></tr><tr><td>Conjuntos de eletroforese em gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> Sistema <tr>de imagem em<td>gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Gel Doc XR+&nbsp;</td></tr><tr><td>HAuCl4&bull; 3H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA3640006</td><td>99,99%</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Brometo de Scharlau</td><td>AC07441000</td><td>1M</td></tr><tr><td>Hexadeciltrimetilamônio (CTAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9151-100</td><td>BioXtra, ácido 98+%</td></tr><tr><td>L(+)-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td>99+%</td></tr><tr><td>M13p7560 andaime filamento</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500</td><td>BioXtra, 99+%</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Acros Organics</td><td>200050250</td><td>99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-500</td><td>BioXtra, 99.5+%</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500</td><td>BioXtra, 98+%</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668-1EA</td><td>PARAFILM M</td></tr><tr><td>Tampão PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>de PCR ProFlex</td> de Biologia Molecular <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255-250</td><td>99+%</td></tr><tr><td>Staple strands</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sybr Safe</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S33102</td><td>Para mancha de DNA</td></tr><tr><td>TBE tampão (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>TE buffer (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP24771</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>FEI Tecnai F12</td></tr><tr><td>Thiol-functionalized&nbsp; ssDNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biomers.net</tr><tr><td>Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI20491</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura (Tipo 1)</td><td></td><td></td><td>Sistema Milli-Q Direct 8</td></tr><tr><td>Uranyl Formate</td><td>Tebu-bio</td><td>24762-1</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz branca</td><td>UVP</td><td>TW-26</td><td></td></tr></tbody></table>

montagem de nanobastões de ouro em metamoléculas plasmônicas quirais usando modelos de origami de dna

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

O endereçamento inerente de estruturas de DNA origami faz deles modelos ideais para o arranjo de nanopartículas de metal em nanoestruturas plasmônico complexos. A elevada precisão espacial de um conjunto de DNA origami-modelo permite controlar o acoplamento entre plasmônico ressonâncias de partículas individuais e permite alfaiataria propriedades óticas de nanoestruturas as construído. Recentemente, sistemas plasmônico quirais atraíram muita atenção devido a forte correlação existente entre a configuração espacial de plasmônico módulos (assemblies) e suas respostas ópticas (por exemplo, Dicroísmo circular [CD]). Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho inteiro para a geração de DNA baseado em origami quirais assembleias de ouro nanorods (AuNRs). O protocolo inclui uma descrição detalhada dos princípios de projeto e procedimentos experimentais para a fabricação de modelos de origami de DNA, a síntese de AuNRs e a montagem de estruturas de origami-AuNR. Além disso, a caracterização de estruturas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e espectroscopia de CD está incluída. O protocolo descrito não está limitado a configurações quirais e pode ser adaptado para a construção de várias arquiteturas plasmônico.

TEM imagens de modelos de origami de DNA, AuNRs e os assemblies de origami-AuNR final são mostradas na Figura 4, Figura 5e Figura 6A, respectivamente. Devido a sua preferência de ligação a redes TEM, origami-AuNR assemblies são geralmente vistos como feixes paralelos de origami e hastes (Figura 6A). Recozimento térmico é necessário para o correto alinhamento de AuNRs em modelos de origami (Figura 6A, B). O protocolo permite altos rendimentos da Assembleia de AuNRs em metamolecules quiral com forte plasmônico CD respostas (Figura 7).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>79 - 71</td>
			<td>1 ° C/1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>70 - 66</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>65 - 60</td>
			<td>1 ° C/30 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>59 - 37</td>
			<td>1 ° C/60 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>36 - 30</td>
			<td>1 ° C/15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>29 - 20</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>Segure</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Temperaturas e taxas para o recozimento térmico de modelos de origami de DNA.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo (min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>36</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>32</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>Segure</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: temperaturas e tempos de exploração para recozimento de modelos de origami AuNRs e DNA. A taxa de resfriamento entre os passos é fixada em 0,1 ° C/min. As amostras de ADN origami-AuNR são recozidas agitando a 400 rpm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig1.jpg"> Figura 1 : Design de ADN origami-modelo metamolecules quiral. (A) identificar o arranjo espacial relativo desejado de ouro nanorods (AuNRs) e uma forma adequada do modelo de origami de DNA. (B) estimar os parâmetros estruturais da AuNRs (DAuNR, LAuNR) e o modelo de origami (Worigami, Lorigami, Θ). Localize as posições aproximadas dos grampos do que mais precisam de modificação. (C) Design de modelos de origami de DNA usando o circunflexo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig2.jpg"> Figura 2 : A electroforese do gel do agarose de origami. (A) purificação com eletroforese em gel de agarose 1% para 2 h, a 80 V. (B) caracterização com eletroforese em gel de agarose 2% para 4 h a 80 V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig3.jpg"> Figura 3 : A purificação de electroforese do gel de agarose de origami-AuNRs. Gel (0,7%) foi executada por 3,5 h em 80 V para as amostras preparadas seguindo o procedimento de montagem com diferentes proporções de DNA-AuNR-para-origami (20:1, 5:1) e amostras (proporção de DNA-AuNRs-para-origami de 10:1), com ou sem processo de recozimento. Para imagens de temperatura das amostras nas faixas 1, 2 e 3, veja a Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig4.jpg"> Figura 4 : Imagem TEM representante dos modelos de origami de DNA. A estrutura de origami consiste de dois pacotes de 14-hélice (80 nm, x 16 nm, x 8 nm) ligados entre si por Costa do andaime. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig5.jpg"> Figura 5 : Imagem de representante TEM do AuNRs. As dimensões médias de AuNRs sintetizada são 70 x 30 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig6.jpg"> Figura 6 : Imagens TEM de assemblies de origami-AuNR. (A) AuNR dímeros em origami após recozimento (banda 1 na Figura 3). (B) AuNR dímeros em origami sem recozimento (banda 2 na Figura 3). (C) Origami-AuNR agrega (banda 3 na Figura 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig7.jpg"> Figura 7 : CD espectros dos assemblies de origami-AuNR. Espectros de CD das estruturas fechadas (os modelos de origami fixadas por fios de bloqueio em uma configuração destra, com 50° entre dois feixes de origami) e a estrutura aberta (os modelos de origami sem fios de bloqueio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos o protocolo detalhado para a DNA baseado em origami montagem de nanorods ouro em metamolecules plasmônico quiral com forte chiroptical respostas. O protocolo não está limitado a configurações quirais e pode ser facilmente adaptado para a preparação de várias arquiteturas plasmônico.

Montagem de Nanobastões de Ouro em Metamoléculas Plasmônicas Quirais Usando Modelos de Origami de DNA

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

Este método permite a fabricação de conjuntos plasmônicos quiral tridimensional com fortes respostas quiropticas. A principal vantagem dessa abordagem é que permite a fabricação de nanoestruturas metálicas complexas usando ferramentas de software livremente disponíveis e equipamentos comuns de laboratório de bioquímica. Demonstrando o procedimento será Yike Huang um estudante de pós-graduação e Minh-Kha Nguyen um pós-doutor do meu laboratório.Use caDNAno para projetar um modelo de origami de DNA. Rote o andaime em fios de grampo de acordo com a forma desejada do modelo. Em seguida, gere as sequências de fios de grampo clicando na ferramenta sequência.Clique na ferramenta de pintura e marque os fios de grampo que requerem mais modificações. Clique na ferramenta de exportação para exportar as sequências de grampos de DNA para um arquivo CSV. Em seguida, importe o arquivo CSV em um aplicativo de planilha.Adicione uma sequência de poliadenina no final dos grampos para ser usado como alças para montagem de nanorod de ouro. Modifique os fios de grampo nos locais de bloqueio projetados com sequências de bloqueio. Prepare um estoque de fios básicos, incluindo fios com alças e travas, misturando quantidades iguais de oligonucleotídeos de grampo normalizados.Em seguida, prepare a mistura de origami conforme detalhado no protocolo de texto. Anneal a mistura no termociclador de 80 graus a 20 graus Celsius. Para um gel de 1%, dissolva um grama de agarose em 100 mililitros de TBE aquecendo a mistura no forno micro-ondas.Adicione 10 microliters de 10.000X de DNA de acordo com a especificação da mancha. Para minimizar a exposição à luz UV na etapa de extração use uma mancha de DNA que pode ser visualizada sob excitação azul. Funda o gel e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, coloque a caixa de gel em um banho de água gelada. Adicione o tampão de carga às amostras de origami e carregue as amostras nos poços com um volume adequado de acordo com o cone utilizado. Execute a eletroforese por duas horas a 80 volts.Imagem do gel com o imager gel. Use um transilluminador de luz azul para visualizar as bandas e cortar a banda de origami. Em seguida, esmague o gel no parafilme e extraia o líquido.O rendimento de recuperação é de aproximadamente 40% Pipeta o líquido em uma unidade de filtro centrífuga e gire a 3.000 vezes G durante cinco minutos. Meça a absorção da solução de origami em 260 nanômetros com um espectrômetro visível UV. Para preparar os nanorods de ouro, dissolva 0,55 gramas de CTAB e 0,037 gramas de 2, 6-Dihydroxibenómico ácido em 15 mililitros de água morna em um frasco fundo redondo.Depois de esfriar a solução a 30 graus Celsius, adicione 600 microliters de quatro nitrato de prata mililitro e mexa a 450 RPM por dois minutos. Deixe a solução intacta por 15 minutos a 30 graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de um tetracloroauto de hidrogênio mililitro à solução e mexa a 450 RPM por 15 minutos.Além disso, adicione 120 microliters de 64 mililitros de ácido L-ascórbico e mexa imediatamente a 1.200 RPM por 30 segundos. Agora, adicione 12 microliters de sementes de ouro e continue mexendo a 1.200 RPM por 30 segundos. Incubar a solução em um banho de água a 30 graus Celsius por 18 horas.Não perturbe a solução e use uma tampa para fechar o frasco. Transfira a solução resultante para tubos de centrífugas e centrífuga a 9.500 vezes G por 12 minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernatante e disperse a pelota em 20 mililitros de água ultra pura.Realize mais um passo de centrifugação e, em seguida, disperse a pelota final em três mililitros de água destilada. Estime a concentração de nanorods de ouro a partir de uma medida de absorção visível UV usando o coeficiente de extinção para a ressonância longitudinal plasmon. Misture 150 microliters de 10 nanorods de ouro nanomolar e 40 microliters de 0,5 mililitros de DNA de tiol tratado.Adicione 1%SDS à solução de nanorod de ouro até que uma concentração final de SDS de 0,05% seja atingida. Ajuste o PH para entre 2,5 e 3 com aproximadamente um microliter de um HCL molar. Incubar por duas horas enquanto treme a 70 RPM.Adicione cloreto de sódio para alcançar uma concentração final de cloreto de sódio de 0,5 molar e incubar por quatro horas à temperatura ambiente enquanto treme a 70 RPM. Em seguida, ajuste o PH para aproximadamente 8,5 com tampão 10X TBE e incubar durante a noite. Lave os nanorods de ouro de DNA quatro vezes misturando as amostras com um mililitro de tampão de lavagem e centrífuga a 7.000 vezes G por 30 minutos.Remova o supernatante e resuspenque os nanorods de ouro de DNA no líquido restante. Estime a concentração de nanorods de ouro de DNA de uma medição de absorção visível UV como antes. Adicione cloreto de magnésio à solução de nanorods de ouro de DNA purificados a uma concentração final de 10 mililitros.Misture os nanorods de ouro de DNA purificados e o origami a uma proporção de 10 para uma e produza a mistura em uma batedeira com um controle de temperatura de 40 graus Celsius a 20 graus Celsius enquanto treme a 400 RPM. Use eletroforese de gel de 0,7% agarose para purificar as estruturas nanorod de ouro origami final. Para a imagem TEM, misture 200 microlitadores de solução formata de 0,75% deuranyl e 1 microliter de cinco hidróxido de sódio molar.Vórtice imediatamente por dois a três minutos. Centrifugar a solução de manchas por três a quatro minutos a 14.000 vezes G.Em seguida, proteja a mancha da exposição à luz, envolvendo-a em papel alumínio. Após o aumento da hidrofalicidade das redes TEM, conforme descrito no protocolo de texto, a pipeta de cinco microliters cai na grade TEM.Após uma incubação de cinco a oito minutos, remova a gota tocando suavemente um papel filtro com a borda da grade. Agora, pipeta uma grande gota e uma pequena gota da solução de manchas em um pedaço de parafilm. Coloque a grade na pequena solução de manchas cair e secar imediatamente tocando no papel do filtro com a borda da grade.Em seguida, coloque-o na grande mancha solução cair por 30 segundos. Mostrado aqui é uma imagem TEM de modelos de dna origami. A estrutura do origami consiste em dois pacotes de hélice de 14 ligados pelo fio do andaime.Aqui, uma imagem tem representativa de nanorods de ouro é mostrada. As dimensões médias dos nanorods de ouro sintetizados são de 70 por 30 nanômetros. Esta imagem mostra nanorod dimers de ouro em origami após a ressardia.Devido à sua preferência vinculante às grades TEM, os conjuntos de nanorod de ouro origami são geralmente vistos como feixes e hastes de origami paralelos. O protocolo permite altos rendimentos da montagem de nanorods de ouro em meta-moléculas quirais com fortes respostas de dicromaísmo circular plasmônico. Aqui estão os espectros das estruturas fechadas e das estruturas abertas.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem propriedades ópticas plasmônicas de complexas nanoestruturas metálicas auto-montadas. Como descrito no protocolo de texto, vários produtos químicos perigosos são usados neste método. Verifique cuidadosamente a ficha de dados de segurança do material e tome as precauções necessárias.

assembly-gold-nanorods-into-chiral-plasmonic-metamolecules-using-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Origami de DNA é um método poderoso para a fabricação de objetos em nanoescala precisos, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui, nós descrevemos como DNA origami pode ser utilizado para criar um robô robótica capaz de sentir sinais biológicos e responder pela forma de deslocamento, posteriormente retransmitida para o efeito desejado.

Projetando um robô Bio-responsivo de DNA Origami

Nanotubos de solução-suspendable ouro com dimensões controladas podem ser sintetizados por deposição electroquimica em porosos anódica de óxido de alumínio (AAO) membranas utilizando um núcleo de polímero hidrofóbico. Nanotubos de ouro e matrizes de nanotubos de manter a promessa para aplicações em biosensoriamento plasmonic, superfície melhorada espectroscopia Raman, foto-térmico de aquecimento, transporte iônico e molecular, microfluídica, catálise e sensoriamento eletroquímica.

Dirigido modelo de síntese de nanotubos de Ouro plasmônicos com Absorbância IR Tunable

O origami de DNA é um método poderoso para fabricar objetos precisos em nanoescala, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui descrevemos um protocolo para o dobramento de um robô bio-responsivo a partir de origami de DNA, sua purificação e coloração negativa para imagens microscópicas eletrônicas de transmissão (TEM).

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Aqui, um protocolo relativo à protecção de nanoestruturas de origami de DNA em Mg-esgotada e nuclease mídia avançada usando quitosana natural polissacarídeo catiônico e revestimentos sintéticos polyethyleneimine linear (LPEI) é apresentado.

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Este protocolo demonstra medidas de espalhamento Raman intensificado por superfície de molécula única (SERS) usando uma nanoantena de origami de DNA (DONA) combinada com microscopia de força atômica colocalizada (AFM) e medições Raman.

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