Name: Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprenda a quantificar atividade da fosfatase alcalina em biofilmes de S. aureus usando placas de 96 poços. Este método de alta sensibilidade facilita estudos sobre formação de biofilmes bacterianos.

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Agradecemos a William Rainey Harper College e a Universidade de Illinois em Chicago para a facilidade de conduzir as experiências. Agradecemos também o McGraw Hill Foundation por seu apoio generoso.

1. preparação média
<ol><li>Preparar 1 L de Tryptic Soy caldo (TSB): em 1 L de água destilada, adicione 15 g de digerir pancreático de caseína, 5g de papaic digest de farelo de soja, 3 g de cloreto de sódio, 2,5 g de dextrose e 2,5 g de fosfato dipotássico. Esterilize antes do uso.</li>
	<li>Para Tryptic Soy Agar (TSA), adicione 15 g de ágar-ágar para 1 L de TSB, autoclave. Então deixe esfriar até a temperatura de quarto. Em seguida, despeje em uma proporção de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).</li>
	<li>Meio de cultura de biofilme: adicionar 10 g de glicose para 1 L de TSB autoclavado. Esterilize por filtração através de um filtro de 0,2 µm.</li>
</ol>2. formação de biofilmes de S. aureus na placa de cultura de tecido bem 96
Nota: O biofilme de S. aureus é cultivado como descrito anteriormente,6,21.
<ol><li>Inocular uma colônia individual de S. aureus de TSA em 10 mL de TSB e crescer durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Dilua a cultura durante a noite em 10 mL de TSB/glicose (10 g/L) na proporção de 1: 100 (v/v). Vórtice suavemente a mistura para uma concentração consistente.</li>
	<li>Transferi 200 mL de cultura diluída em um total de 18 poços (mais para grupos experimentais, um controle de não-biofilme que sugerem uma relação com atividade ALP6) de um 96 prato bem. Use trigêmeos para cada ponto de tempo: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min. Consulte a etapa 3.2.</li>
	<li>Incube a placa bem 96 a 37 ° C por 24 h para a formação de biofilme6,21.</li>
	<li>Decante o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Cada um Lave bem com 1 x solução de tampão fosfato (PBS, pH 7,4), centrifugue por 5 min a 15.000 x g e decante o sobrenadante por aspiração.</li>
</ol>3. medida da atividade da ALP em S. aureus biofilme
Nota: Atividade ALP foi medida como descrito6,18.
<ol><li>Adicione 75 mL de substrato ALP tamponado consistindo pNPP comercialmente disponível para cada poço da etapa 2.6 e começar a gravar o tempo. Grave cada ponto do tempo em triplicado.</li>
	<li>Após a incubação por um tempo variado: 0 min (controle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min respectivamente, adicionam 75 µ l de 5 M NaOH para parar a reação.</li>
	<li>Centrifugue a placa durante 5 min à 15.000 x g.</li>
	<li>Transferi 100 µ l do sobrenadante para um novo prato bem 96 para medição colorimétrica.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada bem em 405 nm usando um 96 placa bem leitor. Use o tempo min 0 ponto poços de controle para o ruído de fundo 405 nm.</li>
	<li>Repita todo o experimento em três individuais 96 placas bem.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
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<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No nosso ensaio, usamos pNPP como o substrato ALP. Esta é uma solução de trabalho projetada para ELISA e a diluição não é necessária. Após a hidrólise por ALP, um produto amarelo desenvolve e pode ser medido em 405 nm. No final da reação enzimática, brevemente centrifugadas a placa bem 96 e transferido o sobrenadante para um prato bem 96 fresco para medir a absorvância usando o leitor de placa. Achamos que essa etapa de centrifugação extra é crítica, pois aumenta a consistência de absorbância em 405 nm, provavelmente, el...

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ubiquitously é expresso em ambas as células procariotas e eucariotas1. Isso pode catalisar a hidrólise de monofosfato de moléculas diferentes, tais como nucleotídeos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato e anidridos de ácido fosfórico. Em humanos, ALP eucariótica está presente em muitos tecidos, incluindo fígado, ossos, intestino e placenta2. Ela desempenha papel importante na fosforilação de proteínas, bem como do crescimento celular, apoptose, processos de células-tronco e mineralização óssea normal. Eucariótica ALP é um indicador chave do soro para a presença de doenças nos ossos, fígado e outros tecidos/órgãos quando elevada3,4.
ALP procariótica foi detectada em uma variedade de células bacterianas, incluindo e. coli5,6,de S. aureus7 e algumas bactérias do rúmen comum no solos8. Atividade bacteriana de ALP tem sido usada como um biossensor na detecção de pesticidas, metais pesados9 e contaminação bacteriana10. A expressão constitutiva de ALP tem sido usada para identificar os estafilococos11 e para diferenciar Serratia Enterobacter12. Sugere-se ainda mais que a produção de ALP constitutiva está correlacionada com patogenicidade em estafilococos13. Embora o ALP tem sido estudada em diferentes configurações3,4, ainda pouco é relatado pela sua atividade e função em culturas de biofilmes.
Um biofilme tem sido documentado para ter uma vida diferente funcionamento bacteriana em comparação com o seu homólogo de vida livre célula bacteriana14. Em S. aureus, a formação de biofilme foi identificada em uma variedade de condições clínicas e contas para a resistência aos antibióticos e inflamação crônica15,16. Muitas moléculas tinham sido relatadas para ser encontrado em uma matriz de biofilme como polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios, mas o mecanismo de formação de biofilme não é totalmente compreendida14. Para entender o papel de ALP na formação de biofilmes, nós cultivadas biofilmes de S. aureus em placas de cultura de pocos 96 e mede a atividade ALP usando pará-nitrofenilfosfato (pNPP).
A molécula pNPP é um substrato de ready-to-use para ALP e tem sido amplamente utilizado para medir a atividade ALP6,17,18. Este ensaio colorimétrico baseia-se na conversão de pará-nitrofenil fosfato (pNPP) para pará-nitrofenol, resultando em um produto colorido em 405 nm. Comparado a outro ensaio ALP convencional, tais como eletroforese19, precipitação de aglutininas (WGA) de germe de trigo, do gel de agarose e WGA-HPLC20, este ensaio é altamente específico, sensível, fácil de reproduzir e mais importante, permite para alta taxa de transferência.

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrofenilfosfato (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>As concentrações típicas de substratos líquidos pNPP, frequentemente usados em ensaios imunoenzimáticos (ELISA), variam entre 10 a 50 mM. Semelhante à maioria dos substratos líquidos pNPP prontos para uso, como o usado aqui, a concentração exata de pNPP não é divulgada devido à sua natureza proprietária.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Tríptica &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L Digestão Pancreática de Caseína............ 15.0 Resumo Papaico do Farelo de Soja......... 5.00 Cloreto de sódio.............................. 3.00 Dextrose........................................ &nbsp; 2,50 Fosfato dipotássico.................. 2,50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 placas boas</td><td></td> BD <td>6902D09</td> da cultura de tecidos <td>deram forma à parte inferior</td></tr></tbody></table>

colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de s. aureus

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) é uma enzima comum expressada em células procariotas e eucariotas. Ele catalisa a hidrólise de monoésteres de fosfato de muitas moléculas em pH básico e desempenha um papel indispensável no metabolismo de fosfato. Nos seres humanos, eucariótica ALP é um dos sinais de enzimática mais frequentemente utilizados no diagnóstico de várias doenças, tais como colestase e raquitismo. Em S. aureus, ALP é detectado exclusivamente na membrana celular; também é expressa como uma forma secretória também. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na formação de biofilme.
O objetivo deste manuscrito é desenvolver um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP em S. aureus biofilme que não necessita de isolamento da proteína. Usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato, medimos a atividade da ALP em S. aureus biofilme formado em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Atividade baseou-se na formação do produto solúvel reação medido por 405 absorvância nm. A natureza de alta taxa de transferência do método 96 cultura pocos placa fornece um método sensível e reprodutível para ensaios de atividade ALP. O mesmo experimental setup também pode ser estendido para medir outros marcadores moleculares extracelulares relacionados à formação de biofilme.

A Figura 1 mostra um resultado representativo da atividade da ALP de biofilme culturas de S. aureus em placas de cultura de pocos 96. 75 μL de solução de pNPP disponível comercialmente foi adicionado para cada bem e incubados à temperatura ambiente. Após incubação de diferentes épocas (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min, respectivamente) 75 μL de 5 M de NaOH foi adicionado para parar a reação. O produto então foi medido em um leitor de pl...

Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos

Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Este protocolo apresentou um método fácil e confiável para medir a atividade fosfattase alcaalizada na cultura biofilme S.aureus. Isso nos ajudará a entender a função da ALP na formação de biofilmes. A maior vantagem dessa técnica é o alto rendimento.É muito sensível e fácil de realizar. Demonstrando o procedimento estará Kevin Danikowski, um ex-aluno da Harper College. Para preparar a TSB, adicione o digestor pancreático da caseína, o digestão papaic da farelo de soja, cloreto de sódio, dextrose e fosfato de dipotassium em água destilada.Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em uma autoclave para esterilizar antes de usar. Para preparar um TSA, adicione ágar ao TSB e coloque-o na autoclave para esterilização. Então deixe esfriar até a temperatura ambiente.Em seguida, despeje-o na placa de Petri a uma proporção de 20 mililitros por prato. Para preparar um meio de cultura de biofilme, adicione glicose ao TSB autoclavado para alcançar a concentração de 10 gramas por litro. Usando um kit de filtragem de vácuo, filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,2 micômetro.Para inocular, use um laço de inoculação esterilizado para escolher uma colônia individual de Staph aureus da placa de Petri e colocá-la no tubo de cultura preenchido com 10 mililitros de TSB. Coloque o tubo na incubadora para crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Com uma micropipette, desenhe 100 microliters de cultura durante a noite e transfira-o para um tubo de cultura cheio de 10 mililitros de TSB com glicose para uma diluição de proporção de volume de 1:100.Vórtice suavemente para misturar para uma concentração consistente. Use uma micropipette para transferir 200 microliters de cultura diluída em um total de 18 poços de uma placa de poço de 96. Incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 24 horas para formação de biofilme.Para a melhor formação de biofilme de S.aureus, é melhor escolher uma placa de fundo 96 plana ou redonda. Depois disso, incline ligeiramente a placa para decantar o sobrenante por aspiração da borda de cada poço. Lave cada poço com 1X PBS.Coloque a placa na centrífuga para girar por cinco minutos a 8.000 revoluções por minuto e decante o supernatante por aspiração. Adicione 75 microliters de substrato ALP tamponado que consiste em PNPP comercialmente disponível para cada poço e use um temporizador para registrar cada ponto de tempo em triplicado. Após cada ponto de tempo de incubação, adicione 75 microlitadores de cinco hidróxido de sódio molar a cada um dos três poços para parar a reação.Centrifugar a placa por cinco minutos a 800 revoluções por minuto. Use uma pipeta para transferir 100 microliters de supernascer em uma nova placa de poço 96 para medição calórica. Use um leitor de placas de 96 poços para medir a absorção de cada poço em 405 nanômetros.Use os poços de ponto de tempo de 30 minutos para controlar o ruído de fundo. Repita todo o experimento em três placas de 96 poços. Este protocolo desenvolve um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP no biofilme S.aureus que não requer isolamento de proteínas.O resultado representativo da atividade da ALP mostra uma tendência crescente de até 75 minutos. Após 75 minutos, não foi observado aumento da atividade da ALP. É muito importante estabelecer uma boa cultura de biofilm e pode levar alguns testes para dominar.Você pode confirmar a formação de biofilmes realizando ensaios violeta cristalinas como relatado anteriormente por nós e outros ou você pode pré-tratar a placa com plasma humano para facilitar a formação de biofilm. Após seu desenvolvimento, você pode rastrear potenciais inibidores de ALP que podem interferir na formação de biofilmes. O resultado fornecerá informações importantes para o gerenciamento de biofilmes na área médica.Cinco hidróxido de sódio molar podem ser perigosos em caso de contato. Certifique-se de usar equipamento de proteção individual durante o manuseio.

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Bioengineering

Bioengenharia

Biofilmes formados nas superfícies dos dentes são altamente complexos e expostos a constante inata e exógenos desafios ambientais, que modulam sua arquitetura, fisiologia e transcriptoma. Nós desenvolvemos uma caixa de ferramentas para examinar a composição, organização estrutural e expressão gênica de biofilmes orais, que pode ser adaptado para outras áreas de pesquisa biofilme.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Fonte: Vidilaseris, K., et al. Triagem para inibidores de pirofosfatase ligados à membrana de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para rastrear inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana (mPPase) quantificando a liberação de ortofosfato. O método permite a identificação de compostos que inibem a mPPase de Thermotoga maritima, um potencial alvo de drogas antimicrobianas.

Triagem de inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana usando um ensaio colorimétrico 

Fonte: Tay, S. B., et al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum.  J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para quantificar a biomassa de biofilme em uma bactéria patogênica, comparando controles não tratados com amostras tratadas com uma enzima que apaga quórum. A enzima interrompe a sinalização bacteriana durante a incubação inicial, reduzindo a adesão celular. Após lavagem e incubação adicional, poços de controle...

Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar a interação neutrófilo-biofilme. As bactérias patogênicas embutidas no biofilme e neutrófilos isolados foram marcadas usando marcadores fluorescentes, e a resposta imune pelos neutrófilos e a evasão da resposta imune pelas bactérias foram avaliadas usando um microscópio de fluorescência.

Um ensaio in vitro para estudar a interação entre neutrófilos e biofilme

Ao contrário do que a observada para eucariotos, há uma escassez de estudos que despolarização detalhes membrana e concentração de íons mudanças nas bactérias, principalmente como seu pequeno tamanho faz com que os métodos convencionais de medição difícil. Aqui, os protocolos de detalhe para monitoramento de tais eventos no patógeno Gram-positivo significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescência.

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Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.

Monitoramento de pH extracelular em biofilmes transversais usando microscopia confocal

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para a dosagem de isolevuglandinas em tecidos por imunofluorescência usando o anticorpo ScFv D11 conjugado à fosfatase alcalina. Modelos de hipertensão em camundongos e humanos são usados para explicar os procedimentos passo a passo e os princípios fundamentais associados à dosagem de isolevuvolina em amostras de tecido.

Detecção direta de isolevuvolinas em tecidos usando uma proteína de fusão D11 scFv-fosfatase alcalina e imunofluorescência

O presente protocolo descreve o estudo das interações neutrófilo-biofilme. Os biofilmes de Staphylococcus aureus são estabelecidos in vitro e incubados com neutrófilos humanos derivados do sangue periférico. A resposta de explosão oxidativa dos neutrófilos é quantificada e a localização dos neutrófilos dentro do biofilme é determinada por microscopia.

Ensaios In vitro padronizados para visualizar e quantificar interações entre neutrófilos humanos e biofilmes de Staphylococcus aureus

Aprenda a quantificar atividade da fosfatase alcalina em biofilmes de S. aureus usando placas de 96 poços. Este método de alta sensibilidade facilita estudos sobre formação de biofilmes bacterianos.

Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

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