Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus
12 de abril de 2019
Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos
Este protocolo apresentou um método fácil e confiável para medir a atividade fosfattase alcaalizada na cultura biofilme S.aureus. Isso nos ajudará a entender a função da ALP na formação de biofilmes. A maior vantagem dessa técnica é o alto rendimento.
É muito sensível e fácil de realizar. Demonstrando o procedimento estará Kevin Danikowski, um ex-aluno da Harper College. Para preparar a TSB, adicione o digestor pancreático da caseína, o digestão papaic da farelo de soja, cloreto de sódio, dextrose e fosfato de dipotassium em água destilada.
Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em uma autoclave para esterilizar antes de usar. Para preparar um TSA, adicione ágar ao TSB e coloque-o na autoclave para esterilização. Então deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Em seguida, despeje-o na placa de Petri a uma proporção de 20 mililitros por prato. Para preparar um meio de cultura de biofilme, adicione glicose ao TSB autoclavado para alcançar a concentração de 10 gramas por litro. Usando um kit de filtragem de vácuo, filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,2 micômetro.
Para inocular, use um laço de inoculação esterilizado para escolher uma colônia individual de Staph aureus da placa de Petri e colocá-la no tubo de cultura preenchido com 10 mililitros de TSB. Coloque o tubo na incubadora para crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Com uma micropipette, desenhe 100 microliters de cultura durante a noite e transfira-o para um tubo de cultura cheio de 10 mililitros de TSB com glicose para uma diluição de proporção de volume de 1:100.
Vórtice suavemente para misturar para uma concentração consistente. Use uma micropipette para transferir 200 microliters de cultura diluída em um total de 18 poços de uma placa de poço de 96. Incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 24 horas para formação de biofilme.
Para a melhor formação de biofilme de S.aureus, é melhor escolher uma placa de fundo 96 plana ou redonda. Depois disso, incline ligeiramente a placa para decantar o sobrenante por aspiração da borda de cada poço. Lave cada poço com 1X PBS.
Coloque a placa na centrífuga para girar por cinco minutos a 8.000 revoluções por minuto e decante o supernatante por aspiração. Adicione 75 microliters de substrato ALP tamponado que consiste em PNPP comercialmente disponível para cada poço e use um temporizador para registrar cada ponto de tempo em triplicado. Após cada ponto de tempo de incubação, adicione 75 microlitadores de cinco hidróxido de sódio molar a cada um dos três poços para parar a reação.
Centrifugar a placa por cinco minutos a 800 revoluções por minuto. Use uma pipeta para transferir 100 microliters de supernascer em uma nova placa de poço 96 para medição calórica. Use um leitor de placas de 96 poços para medir a absorção de cada poço em 405 nanômetros.
Use os poços de ponto de tempo de 30 minutos para controlar o ruído de fundo. Repita todo o experimento em três placas de 96 poços. Este protocolo desenvolve um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP no biofilme S.aureus que não requer isolamento de proteínas.
O resultado representativo da atividade da ALP mostra uma tendência crescente de até 75 minutos. Após 75 minutos, não foi observado aumento da atividade da ALP. É muito importante estabelecer uma boa cultura de biofilm e pode levar alguns testes para dominar.
Você pode confirmar a formação de biofilmes realizando ensaios violeta cristalinas como relatado anteriormente por nós e outros ou você pode pré-tratar a placa com plasma humano para facilitar a formação de biofilm. Após seu desenvolvimento, você pode rastrear potenciais inibidores de ALP que podem interferir na formação de biofilmes. O resultado fornecerá informações importantes para o gerenciamento de biofilmes na área médica.
Cinco hidróxido de sódio molar podem ser perigosos em caso de contato. Certifique-se de usar equipamento de proteção individual durante o manuseio.
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Visão Geral
Este manuscrito apresenta um método de alto rendimento para quantificar a atividade da fosfatase alcalina em culturas de biofilme de S. aureus utilizando uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. O método foi desenvolvido para ser sensível e fácil de executar, facilitando a pesquisa sobre o papel da fosfatase alcalina na formação de biofilme.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Pesquisa em Biofilmes
- Enzimologia
Antecedentes
- A fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima envolvida em diversos processos biológicos.
- Compreender o papel da ALP na formação de biofilmes é fundamental para estudos microbiológicos.
- Métodos de alto rendimento são essenciais para a coleta eficiente de dados em pesquisas.
- Os biofilmes são comunidades complexas de microrganismos que podem impactar a saúde e a indústria.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para medir a atividade de FAL em biofilmes.
- Aprimorar o entendimento da função da FAL na formação de biofilmes.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente adotado por pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Preparação de TSB utilizando digestão pancreática de caseína, digestão papáica de farelo de soja, cloreto de sódio, dextrose e fosfato de dipotássio.
- Utilização de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços para análise de alto rendimento.
- Medição da atividade de fosfatase alcalina em culturas de biofilme de S. aureus.
- Demonstração do procedimento por Kevin Danikowski, ex-aluno do Harper College.
Resultados Principais
- O método quantifica com sucesso a atividade de ALP em culturas de biofilme.
- A alta sensibilidade da técnica permite medições precisas.
- O protocolo é simples e pode ser facilmente implementado em diversos laboratórios.
- Os conhecimentos obtidos com este estudo podem orientar pesquisas futuras sobre biofilmes.
Conclusões
- O método estabelecido é eficaz para o estudo da fosfatase alcalina em biofilmes.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão da dinâmica dos biofilmes.
- Estudos futuros podem se basear neste protocolo para explorar outros aspectos da biologia dos biofilmes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a quantificação rápida e de alto rendimento da atividade da fosfatase alcalina em biofilmes de S. aureus sem isolamento proteico, apoiando a validação precoce de alvos na descoberta de agentes antimicrobianos. Ao fornecer uma leitura sensível e reprodutível da atividade enzimática extracelular, facilita a eliminação de riscos mecanicistas em hipóteses terapêuticas relacionadas a biofilmes. A compatibilidade do ensaio com formatos de placas de 96 poços permite sua integração perfeita em cascatas de triagem para identificação de compostos líderes e construção de confiança preditiva.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa a hipótese terapêutica de que a fosfatase alcalina contribui para a formação e persistência de biofilmes.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo por meio da medição quantitativa da atividade enzimática em sistemas de biofilme intactos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar a modulação da FAL à inibição de fenótipos de biofilme.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara um formato padronizado e de alto rendimento para avaliar os efeitos de compostos sobre marcadores enzimáticos extracelulares.
- Saída Quantitativa: Gera medições baseadas em absorbância a 405 nm, que permitem análise de resposta à dose e confirmação de hits.
- Escalabilidade: Utiliza formato de placa de 96 poços para apoiar triagem de médio rendimento de bibliotecas de inibidores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Relaciona a atividade de fosfatase alcalina com o biofilme de S. aureus, um fator de virulência chave em infecções crônicas e relacionadas a dispositivos.
- Continuidade Translacional: Fornece uma leitura alinhada a biomarcadores que conecta a descoberta científica aos testes pré-clínicos de eficácia.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço ou interrupção do desenvolvimento com base no engajamento do alvo e no impacto fenotípico em modelos de biofilme.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na fase inicial da descoberta, permitindo a validação do alvo para orientar a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de estratégias anti-biofilme.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição da fosfatase alcalina (ALP) como um indicador funcional do metabolismo do biofilme.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis adequadas para triagem de bibliotecas de compostos em placas de microtitulação.
- Análises: Oferece medições cinéticas e em ponto final que permitem comparação estatística entre condições tratadas e controles.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se ao desenvolvimento de biomarcadores ao associar a atividade enzimática à formação de biofilme e à possível intervenção terapêutica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de enzimas extracelulares em biofilmes microbianos em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista sobre o papel da fosfatase alcalina (ALP) no biofilme.
- Valor Operacional: Oferece padronização, sensibilidade e reprodutibilidade por meio de uma leitura colorimétrica simples.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a triagem rápida de moduladores da ALP com vínculos fenotípicos claros ao biofilme.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao conectar a modulação do alvo à eficácia anti-biofilme.
Considerações de Implementação
- Exige conhecimento básico em microbiologia para o cultivo estéril de biofilmes e manipulação de S. aureus.
- Depende do acesso a um leitor de placas de 96 poços capaz de medir absorbância a 405 nm.
- Necessita padronização das condições de formação de biofilme entre poços e placas para comparações confiáveis.
- Envolve considerações de otimização ao ser estendido a outras espécies bacterianas ou marcadores extracelulares.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de controle da absorbância de fundo e garantia de adequada interrupção da reação com NaOH.
