Name: Um Método Laboratorial para Medir o Bocejo Contagioso em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprenda a medir o bocejo contagioso em ratos machos usando um método não invasivo com estímulos visuais e olfativos. Este protocolo ajuda pesquisadores a estudar comportamentos sociais em neurociência.

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A. M. foi parcialmente financiada pela Vicerrectoría de Docencia, benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Estamos especialmente endividados para o pessoal da instalação animal "Claude Bernard" para o uso dos ratos para a filmagem. Agradecemos aos árbitros anônimos por seus comentários sobre as primeiras versões deste manuscrito. A apresentação é menos estridente e mais equilibrado por causa de seus comentários pensativos

Os protocolos experimentais e a criação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais.
1. materiais
<ol><li>Encontre uma lista completa dos materiais usados para implementar o método na tabela de materiais. Use a Figura 1 e procure aconselhamento especializado para construir uma tabela em forma de T invertida, gaiolas de observação e divisores de gaiola. Siga as indicações de segurança para o uso de ferramentas afiadas e materiais potencialmente perigosos.</li>
	<li>Faça uma tabela em forma de T invertida, colando duas barras de madeira como trilho (45 cm de comprimento, separadas 0,6 cm uns dos outros) na parte superior e no meio de um pedaço de madeira (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). Então, coloc uma segunda parte de madeira (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) verticalmente entre as barras Rail-like. Assegure-se de que este segundo pedaço de madeira impeça o par de ratos de um lado de ver o outro par no lado oposto (Figura 1).</li>
	<li>Use vidro e acrílico para criar oito gaiolas de observação. Assegure-se de que cada gaiola (19 cm de largura, 19 cm de comprimento, 10 cm de altura, 3 mm de espessura) tenha 24 furos equidistantes (5 mm de diâmetro) dispostos em três fileiras no meio de um dos seus lados. Faça este lado do acrílico (3 milímetros de espessura) e encurte a altura do lado oposto por 0,7 cm para permitir que o rato respire.<ol>
<li>Certifique-se de cada gaiola de observação tem uma tampa deslizante feita de acrílico para evitar que o rato de criação e distraindo-se durante o período de observação de 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer quatro divisores de acrílico (19 cm de largura, 30 cm de altura, 3 mm de espessura). Perfure 24 furos (diâmetro de 5 milímetros) que combinam aqueles nas gaiolas da observação, cada um em um divisor desobstruído e em um divisor opaco.</li>
	<li>Prepare as folhas de dados com antecedência para registrar a ocorrência de bocejos. Incluir, no título de cada folha de dados, o nome do observador, condição experimental (ou seja, ratos familiares ou desconhecidos), situação de teste relevante (OC, VC, VOC, NVOC), a data, e os tempos iniciais e finais da observação. Divida o resto da folha de dados em duas colunas, cada uma com o número do rato escrito na parte superior, para gravar o comportamento de bocejo dos ratos.</li>
</ol>2. procedimento
<ol><li>Casa 144 ratos machos em grupos de quatro em gaiolas de plástico (gaiolas de casa) de desmame até chegar a 2,5 meses de idade. Não use ratos fêmeas, porque tendem a mostrar uma maior variação no comportamento devido aos ciclos hormonais, que podem ser confundidos com os efeitos da situação do teste. Certifique-se de que os ratos em cada gaiola não são irmãos. Nota: pode ser difícil obter todos os ratos juntos. Nesse caso, crie blocos de pelo menos 8 ratos familiares e 8 ratos desconhecidos para que cada situação de teste seja representada uma vez em cada condição experimental30.</li>
	<li>Para identificar os ratos, marcá-los com números simbólicos nas caudas usando um marcador comercial. Por exemplo, represente os números de 1 a 4 combinando pontos e linhas (por exemplo, um ponto para o número 1 e uma linha para o número 4). Identifique ratos familiares e desconhecidos usando cores diferentes. Nota: Manuseie os ratos seguindo as instruções de segurança fornecidas pelo pessoal da instalação animal e cumpra as recomendações relativas à utilização correcta de animais de laboratório na instituição onde serão realizados experimentos.</li>
	<li>Escolha aleatoriamente quais gaiolas casa vai abrigar o grupo de ratos familiares e que irá abrigar o grupo desconhecido. Por exemplo, suponha que existam 16 ratos disponíveis vivendo em quatro gaiolas domésticas: número de gaiolas de casa 1 a 4, em seguida, use R (baixá-lo em http://cran.r-project.org/) da seguinte maneira [após o prompt (>)]: > amostra (4, 4) [1] 4 3 2 1<ol>
<li>Agrupe os ratos familiares (ou desconhecidos) em gaiolas domésticas 4 e 3, e agrupe os ratos desconhecidos (ou familiares) em gaiolas domésticas 2 e 1. Certifique-se de que o pessoal da instalação animal mantém a identidade de cada gaiola e manuseia os ratos da mesma forma que todos os outros ratos na instalação animal.</li>
		<li>Use o programa R novamente e escolha aleatoriamente ratos para formar cada par em cada condição experimental. Assegure-se de que os ratos em cada par de ratos familiares originam da mesma gaiola Home, e assegure-se de que o oposto seja verdadeiro para os pares no grupo desconhecido. Escolha aleatoriamente pares de ratos para cada situação de teste em cada condição experimental.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize duas sessões de teste por dia com duas das oito situações de teste possíveis (quatro para cada ratos familiares e desconhecidos) por sessão de teste (i.e., período de observação de 60 min). Realize as duas sessões de teste consecutivamente dentro de 3 h. Nota: Certifique-se de realizar todas as sessões de teste (quatro pares de ratos por dia), tanto de manhã ou à tarde para evitar quaisquer fatores de confusão. Execute uma réplica completa (oito situações de teste) do experimento em dois dias consecutivos.<ol>
<li>Certifique-se de usar as situações de teste em uma seqüência aleatória para cada repetição do experimento. Por exemplo, use os números 1 a 8 para identificar cada situação de teste e, em seguida, use R da seguinte maneira: > amostra (8, 8) [1] 8 7 4 6 5 1 2 3</li>
		<li>Alocar situações de teste 8 e 7 para testar a sessão 1, testar situações 4 e 6 para testar a sessão 2 e assim por diante. Em seguida, escolha aleatoriamente o lado da tabela em forma de T invertida, onde cada par de ratos (situação de teste) será colocado.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita o mesmo procedimento (etapas 2,3 a 2.4.2) para uma segunda repetição (ou seja, bloco) do experimento. Nota: se o objetivo do estudo é testar os efeitos de uma condição social (ou seja, dois ratos interagindo) na frequência de bocejo, use um rato colocado em uma gaiola de observação ao lado de uma gaiola de observação vazia como um controle para cada uma das quatro situações de teste. Realize este experimento 2x para cada situação de teste para um grupo de controle de oito ratos.</li>
	<li>Configurar a sessão de teste, transferindo os primeiros quatro ratos da instalação animal para a sala de observação, onde permanecerá por 15 min para aclimatar ao ambiente novo. Transportar os ratos em gaiolas individuais e mantê-los separados uns dos outros durante o transporte e na sala de observação. Nota: siga as instruções de segurança para transportar animais fornecidos pelo pessoal da instalação animal e utilize as roupas indicadas para trabalhar com animais em laboratório. Os ratos não terão acesso a alimentos e água enquanto estão na sala de observação.</li>
	<li>Após o período de aclimatização ter passado, coloque a tabela em forma de T invertida em uma mesa retangular maior. Certifique-se que há uma lâmpada do teto que ilumina suficientemente o quarto ao fazer observações.</li>
	<li>Coloque o papel de filtro na parte inferior de cada gaiola de observação e coloque as gaiolas em pares em cada lado da tabela em forma de T invertida. Posicione o divisor correspondente entre cada par de gaiolas. Nota: o papel de filtro facilita a limpeza das gaiolas e proporciona uma superfície áspera na qual os ratos podem mover-se sem escorregar.</li>
	<li>Coloc estrategicamente duas câmaras de vídeo digitais tais que cada um registra o comportamento de bocejo de cada par de ratos. Certifique-se que as câmaras de vídeo são fixadas com segurança aos tripés e orientadas corretamente às gaiolas da observação. Conecte as câmaras de vídeo a um computador desktop para monitorar simultaneamente o comportamento dos ratos. Nota: armazene as informações digitais em drives flash para arquivar permanentemente as sessões experimentais. Use Flash drives com uma alta capacidade de armazenamento.</li>
	<li>Após o período de aclimatização, coloque os ratos nas gaiolas de observação de acordo com a alocação previamente determinada. Defina o foco automático da filmadora e inicie a gravação de vídeo simultaneamente com um cronômetro. Pare a gravação de vídeo no final do período de observação de 60 min. Nota: enquanto os experimentadores podem estar fora da sala durante a sessão de teste e observando remotamente, recomenda-se que uma pessoa está na sala de observação (o mais longe possível do ambiente experimental), enquanto monitorando o comportamento dos ratos para Certifique-se de que a sessão de teste prossegue sem interrupção.</li>
	<li>Quando a observação terminar, devolva os ratos para suas gaiolas domésticas na instalação animal. Peça ao pessoal da instalação animal para garantir que os ratos tenham acesso a alimentos e água novamente. Limpe cuidadosamente as gaiolas de observação usando um detergente não tóxico e prepare a preparação experimental para realizar as segundas e finais sessões de teste do dia. Nota: Limpe a madeira para remover quaisquer aromas deixados pelos ratos quando colocados nas gaiolas de observação, o que pode afetar o comportamento do próximo par de ratos testados.</li>
	<li>Treinar um a dois voluntários parcialmente cegos para os tratamentos atribuídos para identificar e gravar bocejar usando um método de amostragem de todas as ocorrências. Certifique-se de que os observadores usem a definição de bocejo descrita na seção de introdução.</li>
	<li>Reproduzir e projetar cada vídeo em uma tela de computador usando qualquer sistema de reprodução padrão. Peça ao observador para ver cada vídeo e observar e gravar o comportamento de bocejo usando as folhas de dados previamente preparadas, em seguida, permitir-lhe rever os vídeos em velocidades mais lentas para aumentar a capacidade de observar e medir bocejar.<ol>
<li>Peça aos observadores para marcar bocejar usando um sistema de notação semelhante ao seguinte: Use linhas verticais com o minuto escrito como um sobrescrito para representar a ocorrência de um bocejo (por exemplo, | 3 | | 6 . º | 9, indicando um bocejo no minuto 3, dois bocejos no minuto 6, e um bocejo no minuto 9). Pontuação bocejando como uma seqüência (por exemplo, 1,2, 2,2, 3,2, 5,0, 5,8) para gravá-lo com maior precisão (minutos arredondados para uma casa decimal).</li>
		<li>Alternativamente, insira diretamente os dados dos vídeos em um computador usando programas de coleta de dados padrão. Certifique-se de que o observador está familiarizado com esses programas. Observação: se necessário, permita que o observador exiba cada vídeo em mais de uma sessão. Assegure-se de que um observador vista todos os vídeos correspondentes a um bloco de experimentos. Se dois observadores diferentes viram esses vídeos, pode haver um risco de que as diferenças em suas habilidades para observar e gravar bocejo irá confundir os efeitos das situações de teste. É importante marcar a confiabilidade intraobservador entre diferentes observadores em 10%-20% dos vídeos para garantir que o bocejo seja anotado da mesma forma.</li>
	</ol></li>
</ol>3. processamento de dados
<ol><li>Transsequenciar a sequência temporal de bocejos em cada rato das folhas de dados para uma folha de cálculo. Assegure-se de que há uma coluna para cada rato com um título curto (por exemplo, FR1. l e FR1. r para indicar o primeiro par de ratos familiares nos lados esquerdo e direito, respectivamente). Certifique-se de que todas as colunas têm o mesmo comprimento preenchendo as células vazias com 0 ou NA (veja abaixo). Nota: Use o guia Geral fornecido como um documento complementar para compreender plenamente as seguintes etapas para processar os dados, medir bocejo contagioso e obter curvas de bocejo contagiosas.<ol>
<li>Se o bocejo foi gravado para o minuto mais próximo, digite o número de bocejos em cada minuto relevante e use 0 (sem bocejo) para preencher as células quando nenhum bocejo ocorreu em um determinado minuto. Guarde a folha de cálculo como um ficheiro de texto (. txt).</li>
		<li>Se o bocejo foi gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, digite a seqüência de cima para baixo e use "NA" para preencher os espaços vazios de colunas (ratos) em que os números de bocejos (linhas) é menor do que a da coluna com o número máximo (linhas) de bocejos gravados para um r Em. Guarde a folha de cálculo como um ficheiro de texto (. txt). Nota: como R tem a capacidade de trabalhar com células vazias, a folha de cálculo pode ser guardada com colunas de comprimentos diferentes. Use as opções de ajuda fornecidas pelo R para manipular dados ausentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniciar R. importe os dados do arquivo no qual eles foram localizados anteriormente.</li>
	<li>Guarde os códigos de programa com a extensão ". R "(fornecido como material complementar), em seguida, baixar o código do programa específico (Ver guia geral), dependendo se bocejos foram gravados como números inteiros ou fracionários. Execute o programa para cada par de ratos e o número desejado de prazos.<ol>
<li>Execute o programa novamente, agora usando uma distribuição aleatória do número de bocejos de cada rato (Ver guia geral). Siga as mesmas etapas (etapas 3,3 a 3.3.1) para todas as condições experimentais (ou seja, ratos familiares e desconhecidos) e/ou todas as situações de teste. Proceda como indicado no guia geral e exporte os resultados para o Excel. Observação: em vez de importar um programa salvo anteriormente, como sugerido acima usando um editor de texto, copie e cole diretamente o programa no espaço de trabalho do R.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para criar curvas de contágio de bocejo, use os dados salvos anteriormente em uma planilha. Subtrair as taxas de não-contágio das taxas de contágio para cada par de ratos, janela de tempo e situação de teste. Separe as análises dos dados observados e dos dados artificiais (distribuídos aleatoriamente).<ol>
<li>Em seguida, calcule intervalos de confiança (CI) para cada janela de tempo e situação de teste usando um procedimento de bootstrap (consulte o guia geral). Separe as análises para ratos familiares e desconhecidos. Em seguida, combine os dados artificiais das quatro situações de teste para cada condição experimental e calcule o CI para cada janela de tempo usando um procedimento de bootstrap.</li>
		<li>Em seguida, crie plotagens para cada situação de teste e condição experimental (consulte a Figura 2 e a Figura 3). Finalmente, realize uma análise de regressão múltipla para comparar a intensidade do contágio de bocejo entre situações de teste (veja abaixo).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+transfer+of+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Social transfer of pain in mice.</a> Science Advances. 2, e1600855(2016).</li>
<li>Joly-Mascheroni, R. M., Senju, A., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+catch+human+yawns%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dogs catch human yawns.</a> Biology Letters. 4 (5), 446-448 (2008).</li>
<li>Barthalmus, G. T., Zielinski, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+skin+mucus+induces+oral+dyskinesias+that+promote+escape+from+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Xenopus skin mucus induces oral dyskinesias that promote escape from snakes.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 30 (4), 957-959 (1988).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Há etapas críticas no método que devem ser levados em conta para obter resultados bem-sucedidos. Ratos familiares devem compartilhar gaiolas domésticas por pelo menos 1,5 meses após o desmame e antes de executar os experimentos. Entretanto, os ratos desconhecidos devem viver em gaiolas Home separadas. Em ambos os casos, os pares de ratos devem vir de diferentes ninhadas, mas ser tão semelhantes na idade possível. Em relação às gaiolas de observação, seus furos devem corresponder àqueles nos divisores, porque esta é a úni...

Tradicionalmente, o comportamento comunicatório tem sido estudado a partir de duas perspectivas. De uma perspectiva, os etologistas observam e registram o comportamento dos animais em configurações naturais e tentam reconhecer seu valor adaptativo1. O sentido particular ou os sentidos envolvidos não foram o interesse preliminar destes estudos. De outra perspectiva, os fisiologistas estão mais interessados em desvendar os mecanismos pelos quais os animais se comunicam1; assim, estudos laboratoriais têm proporcionado métodos para abordar o papel que as modalidades sensoriais desempenham na comunicação2,3. Essas duas perspectivas são de fato complementares, pois o conhecimento do valor adaptativo e dos mecanismos imediatos é necessário para obter uma compreensão compreensiva dos comportamentos comunicatórios na vida social dos animais.
O comportamento de bocejo é um componente conspícuo do repertório comportamental em várias espécies de vertebrados4, variando de peixes a primatas5. Pode ser descrita como uma abertura lenta da boca e manutenção de sua posição aberta, seguida por um fechamento mais rápido da boca5. A duração de toda a sequência depende da espécie; por exemplo, primatas bocejam para durações mais longas do que as espécies não-primatas6. Em muitas espécies, sendo os seres humanos a exceção, os machos tendem a bocejar mais freqüentemente do que as fêmeas7. Esta característica pôde sustentam a função comunicatory possível de bocejar, embora os testes padrões regulares do bocejo e de sua freqüência diária possam igualmente sugerir uma função physiological. Em ratos, o bocejo espontâneo segue um ritmo circadiano, com picos de alta freqüência ocorrendo na manhã e tarde8,9.
Uma característica interessante do comportamento de bocejo é que pode ser um ato contagioso (quando o estímulo liberador de um comportamento passa a ser outro animal se comportando da mesma forma10) em várias espécies de vertebrados11,12, 13,14,15,16, incluindo pássaros17 e roedores18. Além disso, evidências recentes indicaram que o bocejo contagioso pode refletir um papel comunicatório, pois o bocejo de um rato pode afetar o estado fisiológico de outro quando exposto a pistas olfativas19. No entanto, se o bocejo tem ou não um papel comunicatório ainda está em debate20,21, e analisando o bocejo contagioso é um primeiro passo essencial para resolver esta questão.
Por outro lado, o bocejo contagioso tem sido ligado à capacidade de um animal de empatia com as perspectivas de outros animais; Portanto, indivíduos estreitamente relacionados são mais propensos a mostrar contágio4. Esta hipótese tem sido freqüentemente testada em condições laboratoriais em que os animais são apresentados com estímulos de bocejo no vídeo12,13; Portanto, o contágio só pode ocorrer através de pistas visuais. Outras investigações avaliaram o contágio de bocejo em condições mais naturais usando grupos de animais14,15. Um grande problema disso é que os animais socialmente interagindo muitas vezes respondem a pistas e sinais de troca que são transmitidos através de combinações de modalidades sensoriais. Desentangling os sentidos reais envolvidos em um determinado comportamento de seus efeitos combinados nem sempre é uma tarefa fácil. Tipicamente, os pesquisadores dificultam farmacologicamente ou cirurgicamente o uso de um animal de um determinado senso, então inferem o papel desse sentido no comportamento relevante2,3,18,22. Felizmente, existem outros métodos em que apenas barreiras físicas são usadas para permitir ou impedir a comunicação entre os animais23,24,25, obtendo assim maior validade biológica.
O método proposto aqui foi projetado especificamente para estudar o bocejo contagioso em ratos familiares e desconhecidos em um ambiente social. De acordo com a hipótese empática, o primeiro grupo deve ser mais suscetível ao bocejo contagioso. O método não exige que os animais sejam cirurgicamente ou farmacologicamente privados de quaisquer sentidos. Em vez disso, ele funciona colocando os ratos em gaiolas adjacentes com furos e obstruindo fisicamente sua comunicação usando divisores claros ou opacos com ou sem furos. Assim, quatro condições de teste podem ser examinadas: (1) Comunicação olfativa (OC, divisor opaco perfurado), (2) comunicação visual (VC, divisor claro não perfurado), (3) comunicação visual e olfativa (VOC, divisor claro perfurado) e (4) nem comunicação visual e olfatória (NVOC, divisor opaco não perfurado). Conseqüentemente, os investigadores podem comparar as contribuições relativas de olfactory, Visual, e até certo ponto, indicações auditivas no contágio do bocejo. Essa abordagem não é nova, pois métodos semelhantes têm sido utilizados para isolar os sentidos envolvidos em determinados comportamentos comunicatórios em animais como lagartos23 e camundongos26. Na verdade, Gallup e colegas27 usaram um método semelhante para demonstrar o papel das pistas visuais no bocejo contagioso em budgerigars. As principais características destes métodos são a simulação de um contexto social e o stress mínimo infligido aos animais. Além disso, o uso de animais interagindo aumenta a validade biológica das conclusões.
Existem várias maneiras de medir o bocejo contagioso25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicação pessoal, 2015) nos ajudou a adaptar numericamente um método anteriormente empregado pelos primatólogos13,14 para uma análise mais precoce dos dados utilizados aqui18. Apresentado neste protocolo é uma versão melhorada deste método com uma gama mais ampla de aplicações. Consiste na ponderação do número total de bocejos de um rato, dentro e fora de uma janela de tempo dada, pela proporção de tempo de observação correspondente aos bocejos dentro e fora da janela de tempo.
Por exemplo, se se supor que os ratos A e B são observados por 12 min, seu bocejo é gravado ao minuto o mais próximo, e uma janela de tempo de 3 minutos é ajustada para medir bocejo contagioso. Em seguida, as seguintes sequências de bocejos para cada um desses ratos são consideradas: Rat A (0, 0, 0, 1, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 2, 1) e Rat B (0, 1, 1, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 0,0, 3). Deve-se notar que cada número (0-3) corresponde ao número de bocejos marcados em cada minuto. Para o rato A, durante os minutos 1, 10 e 11 (números em negrito), o rato B não bocejo dentro dos 3 min precedentes (a janela de tempo escolhida) ou dentro desse minuto. Naqueles minutos, um rato bocejos um total de 2 vezes. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A sem nenhum estímulo do bocejo (taxa do bocejo do não-borne-bocejo) é 2/3 (isto é, 0,67 yawns/min). Nos 9 min restantes, o rato B boceja pelo menos uma vez no mesmo minuto ou nos 3 minutos precedentes. Rat a bocejos um total de quatro vezes naqueles 9 min. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A em resposta a um estímulo do bocejo (taxa do bocejo do borne-bocejo) é 4/9 (isto é, 0,44 yawns/min). A aplicação do mesmo procedimento para Rat B produz uma taxa de bocejo não pós-bocejo de 2/3 (i.e., 0,66) e taxa de bocejo pós-bocejo de 5/9 (0,55).
Por outro lado, se o bocejo é gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, o contágio de bocejo resultará em um tempo pós-bocejo ajustado. Por exemplo, se os seguintes tempos de bocejo forem gravados durante um período de observação de 12 min para os ratos A e B: rato A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) e Rat B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Para o rato a, os períodos de tempo sobre que o rato B não bocejo dentro da escala passada de 3 minutos de 0 a 1,2 de minuto e de 8,1 a 11,2 minutos (isto é, 3,1 minutos), que rende um total de 4,3 minutos do tempo do não-borne-bocejo. O número de vezes que um rato bocejos durante esses tempos é três (números em negrito), assim que a taxa de bocejo não-post-bocejo é 3/4.3 (ou seja, 0,69), enquanto a taxa de bocejo pós-bocejo é 3/7.7 (ou seja, 0,38; o denominador de 12-4.3 min). Similarmente, para o rato B, os períodos de tempo sobre que rato A não bocejo dentro dos 3 minutos passados variam de 0 a 2,3 minutos e de 8,8 a 10,4 minutos, que rende um total de 3,9 minutos. O número de vezes que o rato B bocejos dentro daqueles períodos é um, assim que a taxa do bocejo do não-borne-bocejo é 1/3.9 (isto é, 0,25). Consequentemente, a taxa do bocejo do borne-bocejo é 6/8.1 (isto é, 0,74).
Enquanto um fósforo próximo-contemporâneo no comportamento é um critério ideal para demonstrar a presença de um contágio, aspectos como as restrições sobre o que um indivíduo atende, tempo de reação a um estímulo, distribuição do comportamento ao longo do tempo (por exemplo, bocejo pode ocorrer em episódios), e tempo para aclimatizar ao cenário experimental todos dão origem a diferenças de espécies, dificultando a utilização de uma janela de tempo única. Esta pode ser a razão pela qual os pesquisadores usaram janelas de tempo que variam de segundos5 a vários minutos11, o que cria problemas ao comparar os resultados28. Por causa disso, propõe-se repetir o procedimento descrito acima para uma série de janelas de tempo para obter curvas de contágio de bocejo e comparar as curvas de contágio de bocejo entre as espécies.
As curvas equivalentes do contágio do bocejo podem ser comparadas distribuindo aleatòria o número de bocejos observados para cada rato sobre o período de observação. Assim, o método proposto para medir o contágio do bocejo oferece dois tipos de controles: a (1) taxa de bocejo ocorrendo fora da janela de tempo (tempo não pós-bocejo) e (2) curva de contágio de bocejo artificial obtida a partir da distribuição aleatória do número de bocejos. Portanto, essa abordagem para analisar o contágio do bocejo é um passo em frente de outros procedimentos, como aqueles que comparam a porcentagem ou frequência de bocejo dentro de uma única janela de tempo àquela que ocorre fora desta janela25, sem ter em conta o quadros de tempos reais. O método é complementado por um programa baseado em R29 para calcular convenientemente e objetivamente a probabilidade de bocejar contagioso para uma ou mais janelas de tempo.
Para ilustrar a utilidade deste método e das vantagens do programa baseado em R, é utilizado um conjunto de dados de um estudo publicado anteriormente18 . A condição experimental consistiu em 144 ratos machos alocados a uma condição familiar ou desconhecida. Os ratos em cada condição experimental foram subdivididos em quatro subgrupos de nove pares e expostos a qualquer uma das quatro situações de teste descritas acima. Os comportamentos de bocejo dos ratos em cada condição experimental e a situação do teste foram gravados então durante um período de 60 minutos.

<table><tbody><tr><td>Divisórias de acrílico</td><td>Feitas à mão</td><td>Não disponíveis</td><td>Duas divisórias, uma transparente e outra opaca, terão 24 furos cada. Os outros dois divisores, um transparente e outro opaco, não terão furos. Veja o texto principal para detalhes da construção.</td></tr><tr><td>Um programa baseado em R</td><td>Benem&eacute; rita Universidad Aut&oacute; noma de Puebla</td><td>Não disponível</td><td>Este é o programa usado para avaliar o contágio do bocejo em ratos. Consulte o texto principal para obter informações sobre a forma como o programa é usado.</td></tr><tr><td>Fichas técnicas</td><td>O usuário pode elaborá-las</td><td>Não disponível</td><td>Esses formulários serão usados para que o observador registre a frequência do comportamento de bocejar visualizando as gravações de vídeo. Alternativamente, um caderno pode ser usado desde que você siga as sugestões dadas no texto principal.</td></tr><tr><td>Computador de mesa</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Certifique-se de que o computador tenha uma placa de vídeo capaz de processar convenientemente as gravações de vídeo do comportamento de bocejo.&nbsp;</td></tr><tr><td>Filmadoras digitais</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Eles serão usados para gravar em vídeo o comportamento de bocejar de cada par de ratos; haverá 2 pares de ratos por sessão experimental.</td></tr>Unidade <tr><td>flash</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Cada sessão experimental durará 60 minutos e, portanto, você precisará de memória suficiente para armazenar a gravação de vídeo.</td></tr><tr><td>Gaiolas de vidro</td><td>Artesanal</td><td>Não disponível</td><td>Cada gaiola (19 X 19 X 10 cm de altura) terá 24 orifícios (0,5 cm de diâmetro) formando três fileiras no meio de um de seus lados. Veja o texto principal para mais detalhes sobre sua construção. Recomenda-se fabricar uma gaiola extra no caso de uma delas ser quebrada acidentalmente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Marcadores</td><td>Sharpie ou qualquer outro fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Marcadores permanentes para numerar os ratos. Veja o texto principal para ver uma maneira de usar símbolos de pintura na cauda do rato.</td></tr><tr><td>Lápis</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Eles são usados pelo observador para registrar a frequência de bocejos. É importante que o observador tenha sido previamente treinado para reconhecer o comportamento de bocejo e operar o sistema de reprodução de vídeo.</td></tr><tr><td>Software R</td><td>Equipe principal de desenvolvimento R</td><td>Não disponível</td><td>Baixar R em: http://cran.r-project.org/&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Barras de madeira semelhantes a trilhos</td><td>Artesanal</td><td>Não disponível</td><td>Eles serão fixados no meio da folha de madeira retangular formando um trilho, onde uma segunda folha de madeira é colocada. Consulte o texto principal para obter instruções adicionais para construção.</td></tr><tr><td>Mesa retangular</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Esta é a mesa (aproximadamente 2 x 1 m) onde será colocada a mesa em forma de T invertido para realizar a observação do comportamento de bocejo.</td></tr><tr><td>Ratos machos Sprague-Dawley</td><td>Qualquer fornecedor local de animais de laboratório</td><td>Não disponível</td><td>São necessários nove pares de ratos machos por situação de teste para cada grupo, ratos familiares e não familiares, pois com esse tamanho de amostra a variação interindividual que pode existir na frequência de bocejos não afetará severamente as conclusões tiradas da análise estatística realizada aos dados. &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software de planilha</td><td>Microsoft</td><td>Não disponível</td><td>O Excel será o software usado para armazenar as gravações de bocejos inicialmente registradas nas folhas de dados. Revise o texto principal para obter instruções sobre a maneira recomendada de fazer a transcrição.</td></tr><tr><td>Papéis de filtro quadrados</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Eles são usados para cobrir o fundo da gaiola.</td></tr><tr><td>Tripés</td><td>Qualquer fabricante</td><td>Não disponível</td><td>Eles serão usados para fixar as filmadoras na frente de cada par de gaiolas de observação.</td></tr><tr><td>Mesa de madeira em forma de T invertido</td><td>Artesanal</td><td>Não disponível</td><td>Leia as instruções no texto principal para ver a forma de construí-la. Se preferir, um material diferente da madeira pode ser usado. Certifique-se de que qualquer material seja o mais resistente possível à transmissão de ultrassons, que os ratos podem usar para comunicação. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

um método laboratorial para medir o bocejo contagioso em ratos

A Laboratory Method to Measure Contagious Yawning in Rats

A comunicação é um aspecto essencial da vida social animal. Os animais podem influenciar uns aos outros e se reúnem em escolas, rebanhos e rebanhos. A comunicação também é a forma como os sexos interagem durante o namoro e como os rivais resolver disputas sem lutar. No entanto, existem alguns padrões comportamentais para os quais é difícil testar a existência de uma função comunicativa, pois vários tipos de modalidades sensoriais provavelmente estão envolvidos. Por exemplo, o bocejo contagioso é um ato comunicatório em mamíferos que potencialmente ocorre através da visão, audição, cheiro, ou uma combinação desses sentidos, dependendo se os animais são familiares uns aos outros. Portanto, para testar hipóteses sobre o possível papel comunicatório de tais comportamentos, é necessário um método adequado para identificar as modalidades sensoriais participantes.
O método proposto aqui visa obter curvas de contágio de bocejo para ratos familiares e desconhecidos e avaliar a participação relativa de modalidades sensoriais visuais e olfatórios. O método usa materiais baratos, e com algumas pequenas alterações, ele também pode ser usado com outras espécies de roedores, como camundongos. Globalmente, o método envolve a substituição de divisores claros (com ou sem furos) com divisores opacos (com ou sem furos) que permitem ou impedem a comunicação entre ratos colocados em gaiolas adjacentes com furos em lados adjacentes. Conformemente, quatro circunstâncias podem ser testadas: uma comunicação olfactory, uma comunicação visual, uma comunicação visual e olfactory, e nem uma comunicação visual nem olfactory. Como a interação social ocorre entre os ratos, essas condições de teste simulam o que pode ocorrer em um ambiente natural. A este respeito, o método proposto aqui é mais eficaz do que os métodos tradicionais que dependem de apresentações de vídeo cuja validade biológica pode suscitar preocupações. Não obstante, não discrimina entre o papel potencial da audição e os papéis do cheiro e da visão no contágio do bocejo.

Os ratos foram selecionados de uma sublinha previamente produzida de ratos Sprague-Dawley que foram selecionados para o bocejo frequente (aproximadamente 22 bocejos por hora31). No entanto, os nove pares de desconhecidos e nove pares de ratos machos familiares (entre 2,5 e 3 meses de idade) utilizados por situação de teste bocejou aproximadamente 12 vezes por hora, em média18. Portanto, as situações de teste para medir o contágio do bocejo i...

O método descrito aqui tem como objetivo obter curvas de contágio de bocejo em pares de ratos machos familiares ou desconhecidos. As gaiolas com furos separados por divisórias desobstruídas ou opacas com (ou sem) furos são usadas para detectar se Visual, olfactory, ou ambos os tipos de sugestões sensoriais podem estimular o contágio do bocejo.

Um Método Laboratorial para Medir o Bocejo Contagioso em Ratos

Communication is an essential aspect of animal social life. Animals may influence one another and come together in schools, flocks, and herds. ...

Nosso protocolo é significativo porque fornece uma maneira fácil de investigar quais sentidos podem estar envolvidos em bocejo contagioso em ratos. O uso de um procedimento não invasivo e a disponibilidade do software de aplicação, que agilize o cálculo para medir bocejo contagioso, são as principais vantagens dessa técnica. Indivíduos que nunca realizaram essa técnica não devem enfrentar grandes dificuldades na implementação, desde que metodicamente sigam cada passo e busquem aconselhamento profissional na construção do caso de observação.A demonstração visual deste método auxilia na compreensão do arranjo espacial das gaiolas de observação durante o experimento. Ajudando a evitar erros na designação dos tratamentos. Demonstrando que o procedimento será Evelyn Beristain-Castillo, uma pós-doutora do meu laboratório.Para configurar uma sessão de teste, transfira quatro ratos para a sala de observação em gaiolas individuais. Enquanto os animais estão aclimatando, coloque uma mesa invertida em forma de T em uma mesa retangular maior sob uma lâmpada de teto que ilumina suficientemente a sala. Coloque o papel do filtro na parte inferior de cada gaiola de observação e coloque as gaiolas em pares em cada lado da mesa invertida em forma de T.Posicione um divisor entre cada par de gaiolas, e coloque estrategicamente duas filmadoras digitais, de modo que cada um registra o comportamento bocejando de cada par de ratos. Depois de confirmar que as filmadoras estão fixas com segurança nos tripés e corretamente orientadas para as gaiolas de observação, conecte as filmadoras a um computador de mesa para monitorar simultaneamente o comportamento dos ratos. Quando os animais tiverem se aclimatado por 15 minutos, coloque-os nas gaiolas de observação de acordo com a alocação previamente determinada, e defina o foco automático para desligar em cada filmadora.Inicie a gravação de vídeo e um cronômetro ao mesmo tempo, interrompendo a gravação de vídeo no final do período de observação de 60 minutos. Quando a observação acabar, devolva os ratos para suas gaiolas de origem na instalação animal com acesso a comida e água. Em seguida, limpe completamente as gaiolas de observação com um detergente não tóxico antes de preparar a configuração experimental para realizar as sessões de teste subsequentes para o dia.Após a última sessão, reproduza cada vídeo em uma tela de computador usando qualquer sistema de reprodução padrão para um observador. Faça com que o observador veja primeiro cada vídeo para observar e registrar o comportamento de bocejo em folhas de dados uma vez em velocidade normal, seguido de visualização adicional em velocidades mais lentas para facilitar a observação e medir o bocejo. Para marcar o bocejo, use linhas verticais para representar a ocorrência de um bocejo com o minuto escrito como um sobrescrito.Quando todos os bocejos tiverem sido marcados, transcreva a sequência temporal de bocejos em cada rato para uma planilha. Se o bocejo foi registrado no minuto mais próximo, digite o número de bocejos em cada minuto relevante e use zero para preencher as células quando não ocorreu bocejo em um determinado minuto. Em seguida, salve a planilha como um arquivo de texto.Se o bocejo foi gravado no decimal mais próximo de um minuto, digite a sequência de cima para baixo. Use NA para preencher os espaços vazios das colunas de ratos em que o número de bocejos nas fileiras é menor do que o da coluna. Com o número máximo de fileiras de bocejos registrados para um rato.Em seguida, salve a planilha como um arquivo de texto. Quando todos os dados tiverem sido inseridos, importe o arquivo de texto em R.Salve os códigos do programa com o código de extensão R e baixe o código específico do programa, dependendo se os bocejos foram registrados como inteiros ou números fracionados. Em seguida, execute o programa para cada par de ratos e o número desejado de períodos de tempo.No final da execução, execute o programa novamente usando uma distribuição aleatória do número de bocejos de cada rato. Para criar curvas de contágio bocejando, use os dados previamente salvos na planilha para subtrair as taxas de não contágio das taxas de contágio para cada par de ratos, a janela de tempo e a situação do teste, separando as análises dos dados observados e dados artificiais. Neste experimento representativo, o contágio bocejando entre ratos machos desconhecidos foi medido ao longo de uma série de janelas de tempo que variavam de um a 10 minutos.Estas curvas de contágio bocejando indicam que apenas a comunicação olfativa entre ratos em gaiolas com um divisor opaco perfurado exibiu contágio bocejando. O que é evidente a partir da janela de tempo quatro e em diante, uma vez que o intervalo de confiança das médias não se sobrepõe ao intervalo de confiança do número de bocejos alocados aleatoriamente durante o período de 60 minutos. A banda indicou, como esperado, que uma alocação aleatória do número de bocejos em cada rato no período de observação, produziu taxas de bocejo que oscilavam a aproximadamente zero sem demonstrar qualquer padrão aparente.Neste experimento representativo com ratos machos familiares, nenhuma das quatro situações de teste estimulou o contágio bocejando porque seus intervalos de confiança se sobrepunham à faixa de intervalo de confiança gerada aleatoriamente. Além disso, não houve diferenças entre as quatro situações de teste, embora o aumento geral do contágio bocejando ao longo das 10 janelas de tempo diferente de uma inclinação zero. Lembre-se de acompanhar as identidades familiares e desconhecidas dos ratos para uma interpretação correta dos resultados, e limpar as gaiolas de observação entre experimentos.Um procedimento farmacológico pode ser usado para bloquear a comunicação auditiva, e para separar completamente os efeitos auditivos sobre bocejo contagioso dos efeitos dos outros sentidos. Esta técnica abriu caminho para comparar bocejos contagiosos em toda a espécie, tanto em termos dos sentidos envolvidos, quanto na força da resposta, comparando as curvas contagiosas de bocejo. Lembre-se de manusear cuidadosamente as gaiolas de observação porque elas podem acidentalmente quebrar e causar ferimentos.

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JoVE Journal

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