Name: Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a isolar gotas lipídicas de fígado de camundongo usando um kit comercial modificado. Este método permite purificação simultânea de múltiplas organelas, facilitando estudos em biologia de gotas lipídicas e doenças hepáticas.

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Agradecemos a família Abramson Cancer Research Institute. Este trabalho é apoiado por subsídios seguintes: NIH/tinham R01 AA026302-01, NIH/tinham K08-AA021424, Fundação Robert Wood Johnson, Harold Amos Medical faculdade desenvolvimento Award, 7158, IDOM RDC piloto prêmio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/TINHAM F32-AA024347 (JC). Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH P30-DK050306 e programa de concessão de suas instalações de núcleo (Patologia Molecular e Imaging Core, núcleo de expressão de Gene/Biologia Molecular e celular núcleo de cultura) e o seu piloto. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Todos os experimentos foram realizados em uma bancada de laboratório com equipamento de proteção pessoal apropriado para o nível de biossegurança 1, incluindo um jaleco, luvas e óculos de segurança. Experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Foram envidados todos os esforços para minimizar o desconforto do animal, e os animais foram tratados com crueldade.
1. isolamento de LD usando um kit de isolamento de ER
<ol><li>
Preparação Nota: Os valores listados são adequados para um fígado de rato único 1G.<ol>
<li>Prepare-se 10 mL de 1 x isotónica solução tampão (buffer de IE, do kit de isolamento de ER) diluindo-se 2 mL de tampão de IE x 5 com 8 mL de água ultrapura. Legal o buffer, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Prepare 100 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Prepare-se 10 mL de 5% polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Legal todos os tubos, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.</li>
		<li>Legal todas as centrífugas de 4 ° c: microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade para 15 mL de tubos, uma centrífuga de alta velocidade para tubos de 50 mL e um se.</li>
		<li>Esterilize a tesoura pinça e dissecação em autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do tecido
	<ol>
<li>Eutanásia o mouse, colocando-o em uma câmara cheia de 100% de CO2 por 10 min. Confirm eutanásia realizando deslocamento cervical.</li>
		<li>Usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação, cortar as camadas de pele e músculo do abdome no eixo posterior/anterior para expor o fígado.</li>
		<li>Corte os ligamentos conectando o fígado ao diafragma e intestino. Use pinça para puxar o intestino longe do fígado, em direção posterior, para expor os ligamentos.</li>
		<li>Corte entre o fígado e a caixa torácica dorsal, movendo-se do anterior posterior até o fígado é libertado.</li>
		<li>Transferi o fígado a um frio 5 cm placa de Petri com 10 mL de PBS 1x frio.</li>
		<li>Lave o fígado 2 x em uma plataforma de balanço em 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm. Despeje 1X PBS após a lavagem final.</li>
		<li>Use uma lâmina cirúrgica estéril de tamanho-10 (consulte a Tabela de materiais) para cortar o fígado em pedaços de 3 a 5 mm na 5cm de Petri (figura 1A).</li>
		<li>Lave o fígado picado 2 x com 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm. Nota: Para o isolamento do lisossoma, transferir 0,5 g de fígado de um homogeneizador de 45ml limpo e siga as instruções fornecidas pela extração lisossoma kit (veja a Tabela de materiais).</li>
		<li>Decantar 1X PBS e transfira os pedaços de fígado picados para o frio 45 mL homogenizacao homogenizador. Certifique-se de todas as peças vão ao fundo do homogenizador.</li>
		<li>Adicionar 7 mL de tampão de IE frio 1x (do kit de isolamento de ER) e homogeneizar no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Certifique-se de que o pilão vai ao fundo do homogenizador durante cada braçada.</li>
		<li>Transferi o homogeneizado (figura 1B) para um tubo de centrífuga 15ml frio.</li>
		<li>Enxágue o homogenizador com 1 mL de frio 1x buffer de IE (do kit de isolamento de ER) e adicione isto ao resto do homogeneizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de LD
	<ol>
<li>Remova núcleos por centrifugação o homogeneizado em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C (Figura 1).</li>
		<li>Transferi o sobrenadante pós-nucleares (PNS) para um tubo de centrífuga de 50ml novo, frio. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior do tubo 15ml é resuspended antes de transferir o PNS.</li>
		<li>Levar um 100 µ l alíquota do PNS para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.</li>
		<li>Para remover as mitocôndrias, centrifugar a amostra PNS, não a alíquota, numa centrifugadora refrigerada de alta velocidade a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.<ol>
<li>Opcional: para isolados de LD (CLD) bruto (com contaminação do citosol e membrana celular), recolher a camada lipídica superior utilizando uma pipeta de vidro e transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL. Continue a secção 1.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferi o sobrenadante postmitochondrial (PMS) para um tubo de se. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior é resuspended antes de transferir o PMS.</li>
		<li>Levar um 100 µ l alíquota das POM para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.</li>
		<li>Encha um tubo se até a borda com frio 1x buffer de IE para evitar que o tubo em colapso durante a ultracentrifugação.</li>
		<li>Equilibrar as amostras e centrifugue-los em um se a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (Figura 1).</li>
		<li>Para remover a camada de LD, incline o tubo em um ângulo de 45° e usar uma pipeta de vidro para aspirar. Transferi o sedimento para um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Nota: A pelota contém ER isolada. Use esta fração a jusante para isolamento de ER.</li>
		<li>Colete 100 µ l do sobrenadante post-ER (PER) sob a camada lipídica para análise de pureza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavagem de LD
	<ol>
<li>Adicione a fração LD coletada em um tubo de microcentrifugadora 1.7, para um volume total de 1,3 mL 1X PBS.</li>
		<li>A amostra de vórtice.</li>
		<li>Centrifugue em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C para quaisquer detritos de célula de Pelotas. Aquecer o tubo delicadamente com as mãos para ajudar Ressuspender a camada de LD. Transferi o sobrenadante, incluindo a camada lipídica, para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL.</li>
		<li>Repita as etapas 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, até que o sedimento não é mais visível.</li>
		<li>Adicione o LD da pelota-livre sobrenadante para um volume final de 1,5 mL 1X PBS. Lavagem da fração lipídica por centrifugação em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Retire 1 mL de 1X PBS (por baixo da camada lipídica) com uma pipeta de vidro sem perturbar a camada lipídica.</li>
		<li>Repita as etapas 1.4.5 e 1.4.6 4 x x-5, até o PBS 1x é visualmente transparente com nenhuma turbidez.</li>
		<li>Remover todos os 1X PBS abaixo da camada de lipídios, usando uma pipeta de vidro (Figura 1E).</li>
		<li>Use o resultado, uma fração LD puro, para análise a jusante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificação de proteína LD por ensaio de ácido bicinchoninic Nota: Não utilize um ensaio de ácido bicinchoninic (BCA) se LD morfologia é para ser avaliado.<ol>
<li>Resuspenda o LD em 500 μL de PGPE 5%.</li>
		<li>Ferva por 5 min a 95 ° C, as amostras de vórtice-los e incubar as amostras à temperatura ambiente por 5 min esfriar.</li>
		<li>Repita a etapa 1.5.2 um adicional x 2.</li>
		<li>Proceda à sonicação das amostras por 5 min com um 30 s ligar/desligar o ciclo, a intensidade média.</li>
		<li>Normalize as amostras por medir a concentração de proteína em todas as amostras de análise de pureza e na fração LD por ensaio BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento de LD usando gradiente de densidade de sacarose
<ol><li>
Preparação
	<ol>
<li>Fazer 200 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Fazer 100 mL de solução de sacarose de 60% (p/v) em tampão TE dissolvendo-se 60 g de sacarose em tampão TE, trazendo o volume final de 100 mL. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Fazer 6 mL de solução de sacarose de 40% (p/v) adicionando-se 4 mL de 60% de sacarose para 2 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Fazer 6 mL de solução de sacarose de 25% (p/v) adicionando 2,5 mL de 60% de sacarose para 3,5 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Fazer 4 mL de solução de sacarose 10% (p/v) adicionando 0,7 mL de 60% de sacarose para 3,3 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Fazer 10 mL da solução de inibidor de protease e fosfatase adicionando um comprimido de inibidores de protease e fosfatase para 10 mL de tampão TE.</li>
		<li>Prepare o buffer de homogeneizado de tecido, acrescentando 4 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase a 50 mL de solução de sacarose a 60%. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Prepare o buffer de sobreposição, acrescentando 2 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase para 50 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Prepare 100 mL de 1X PBS diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Prepare-se 10 mL de 5% PGPE por diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Legal os seguintes tubos de centrífuga, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.</li>
		<li>Legal os centrifugadores exigidos para 4 ° c: um microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade (para tubos de 15 mL), uma centrífuga de alta velocidade (para tubos de 50 mL) e uma se.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do tecido
	<ol>
<li>Use 1.2.1–1.2.9 de passos para preparar o tecido para homogeneização.</li>
		<li>Adicionar 7 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e homogeneizá-lo no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Durante os primeiros cinco traços, certifique-se do que pilão vai para o fundo do homogenizador.</li>
		<li>Transferi o homogeneizado para um tubo de centrífuga 15ml frio.</li>
		<li>Enxágue o homogenizador com 1 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e transferir para tubo de centrífuga 15ml utilizado anteriormente.</li>
		<li>Trazer o volume do homogeneizado até 10 mL com tampão de homogeneizado de tecido.</li>
		<li>Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Transferência 8 mL do sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Transferi 100 µ l do sobrenadante restante como amostra PNS para análise de pureza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gradiente de sacarose
	<ol>
<li>Incline o tubo de centrifugação de 50 mL contendo o 8mL de PNS em um ângulo de 45°. Cuidadosamente, adicione 6 mL de solução de 40% de sacarose, garantindo que as duas fases fiquem separadas.</li>
		<li>De forma semelhante, lentamente adicione 6 mL de solução de sacarose de 25%; em seguida, adicione 4 mL de solução de sacarose 10%; Finalmente, adicione 8 mL de tampão de sobreposição.</li>
		<li>Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta velocidade a 30.000 x g a 4 ° C por 30 min.</li>
		<li>Transferi a camada superior que contém o LDs para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL.</li>
		<li>Para lavagem de LD, siga os passos na secção 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

Dr. Carr recebe apoio de pesquisa Pharmaceuticals interceptar.

Hepática biologia LD está cada vez mais sendo reconhecida como um regulador crítico da fisiologia hepatocelular na saúde e na doença. Como organelas de boa-fé, LDs são dinâmico, interagem com outras estruturas celulares e conter dentro os componentes bioativos envolvidos na homeostase lipídica e a glicose. O gradiente de sacarose é usado rotineiramente para isolamento de LD e permite que os investigadores estudar a estrutura da LD, mas os obriga a fazer vários buffers. Nós demonstramos que o uso de um kit de isolamento E...

LDs são bioativas organelas encontradas no citosol de células eucarióticas mais e algumas células procarióticas1,2,3. O núcleo de LD é composto de lipídios neutros como triglicérides (TG) e ésteres de colesterol. Eles também contêm ceramidas, lipídios bioativos envolvidos em vias sinalização celular4,5. LDs estão rodeados por uma monocamada de fosfolípidos e revestidos com proteínas, incluindo a perilipin de proteínas perilipin 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Também presentes estão as enzimas lipogénicos, lipases e proteínas de membrana de tráfico que têm sido associadas a várias doenças steatotic hepáticas, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica e hepatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs é pensado para formar a membrana exterior do PS e conter recentemente sintetizada TG proveniente de ácidos graxos livres de ER-derivado11. No entanto, continua a ser desconhecido se os lipídios em pool Brote, permanecem conectados, ou são extirpado da ER6,11, fazendo o isolamento do LDs livre de ER tecnicamente desafiador. Ácidos graxos livres podem ser liberto de LDs pela ação de lipases superfície para fornecer para a produção de energia ou síntese de membrana. Além disso, LDs pode ser degradado através de lipophagy como um mecanismo regulatório e para a produção de ácidos graxos livres12.
Além do ER e lisossomos, existem outras organelas — tais como endossomos, mitocôndrias, peroxissomos e a membrana plasmática — que são encontrados dentro de estreita associação de LDs11. Esta poligamia apertada dificulta a realizar uma extração LD pura. No entanto, densidade de baixo inata dos lípidos neutros pode ser aproveitada através de de centrifugação5.
Tradicionalmente, LDs têm sido isolado usando um sacarose densidade gradiente1,5,13. No entanto, estes métodos não foram concebidos para isolar outras organelas. Além disso, eles exigem a demorada preparação dos reagentes. Este protocolo se adapta a um isolamento de ER comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) para permitir o isolamento de LD. Nós usamos o buffer de extração fornecido pelo kit, adicionando uma etapa de isolamento de LD. Além disso, o protocolo também pode ser usado para ER e isolamento dos lisossomos, usando as mesmas amostras, permitindo uma imagem mais abrangente do ciclo de vida do LDs. Para validar este novo método, nós do ensaio rendimento LD, morfologia, tamanho e pureza. Comparamos os resultados aqui apresentados aos obtidos com um protocolo amplamente usado, utilizando um gradiente de sacarose para isolamento de LD.
Usamos um 10 de 12-semanas, 20 g feminino C57BL/6 rato jejuou por 16 h (remoção de comida às 17:00 por um tempo de isolamento do LD de 09:00), com livre acesso à água. O rendimento típico de TG é de 0,6 mg/g fígado, e por proteínas de LD, é 0,25 mg/g fígado. Isto fornece material suficiente para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. O protocolo abaixo detalha os reagentes usados e um protocolo apropriado para um fígado único 1G. O protocolo de isolamento gradiente de sacarose é adaptado do Sato14 e Wu15.

<table><tbody><tr><td>Misturador de vórtice BioExpress</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Centrífuga misturadora de vórtice</td></tr><tr><td>54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Microcentrífuga de balcão refrigerado Rotor: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade Rotor: Centrífuga F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Centrífuga Refrigerada de Alta Capacidade Rotor: 75006445 Balde: 75006441</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Completo Coquetel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Comprimidos Inibidores de Protease</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Sistema de Sonicação</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td></tr><tr><td>Moedor de Tecidos Dounce (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Uso Pilão</td></tr> <tr><td>soltoKit de</td> Isolamento de Retículo Endoplasmático <td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td>Tampão Tampão com Fosfato da Dulbecco</tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>Para kit de ER Extração: Contém: Tampão de Extração Isotônica 5X 100 mL Tampão de Extração Hipotônica 10 mL Cloreto de cálcio, solução 2,5 M 5 mL OptiPrep Gradiente de Densidade Meio 100 mL Agulha de Ponta Cega 1 ea.</td></tr><tr><td>Fonte de luz externa para excitação fluorescente</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Ácido clorídrico</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de modulação invertida</td><td>Leica Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimento de lisossomo para tecidos e células cultivadas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>Para Microscópio de Isolamento de Lisossomo</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Comprimidos Inibidores de Fosfatase</td></tr><tr><td>Estéril Lâmina Cirúrgica #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Cristalino/Certificado ACS</td></tr><tr><td>Triglicerídeo Liquicolor Kit</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Base colorimétrica Tris</td></tr><tr><td>Base</td><td>Tris Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Para tampão TE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Polietilenoglicol p- (1,1,3,3-tetrametilbutil) -éter fenílico, Reagente de Lise</td></tr><tr><td>de Proteína UltraPure EDTA (0,5M, pH 8,0)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Para tampão TE</td></tr></tbody></table>

protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um kit de isolamento organela bem estabelecidas

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Gotículas lipídicas (LDs) são bioativas organelas encontradas no citosol do mais eucarióticas e algumas células procarióticas. LDs é composto de lipídios neutros, envolvidos por uma monocamada de fosfolipídios e proteínas. Lipídios de LD hepáticos, tais como as ceramidas e as proteínas estão implicados em várias doenças que causam esteatose hepática. Embora métodos anteriores tenham sido estabelecidos para isolamento de LD, exigem uma preparação demorada dos reagentes e não são projetados para o isolamento de vários compartimentos subcellular. Procuramos estabelecer um novo protocolo para permitir o isolamento de LDs, retículo endoplasmático (ER) e lisossomos de um fígado de rato único.
Além disso, todos os reagentes utilizados no protocolo aqui apresentado estão disponíveis comercialmente e exigem preparação do reagente mínima sem sacrificar a pureza de LD. Aqui nós apresentamos dados comparando este novo protocolo para um protocolo de gradiente de sacarose padrão, demonstrando rendimento, morfologia e pureza comparável. Além disso, podemos isolar ER e lisossomos usando a mesma amostra, fornecendo uma visão detalhada para a formação e o fluxo intracelular de lipídios e suas proteínas associadas.

Nós temos realizado o isolamento LD com o kit de ER em aproximadamente 30 ratos e comparados os resultados com aqueles que seguem o protocolo de isolamento de sacarose em aproximadamente 40 ratos. Os resultados relatados são típicos para ambos os protocolos. Os ratos foram jejuou durante a noite com livre acesso à água, para aumentar o rendimento de LD. Isolamento de LD, usando um gradiente de sacarose foi executado em paralelo com o kit de ER protocolo de isolamento de LD. Amostras de PN...

Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Pesquisas sobre biologia de gotículas lipídicas têm sido dificultadas pela dificuldade de purificação. Além disso, estudar o fluxo lipíduo celular requer purificação simultânea de múltiplas organelas, e nenhum protocolo simples estava disponível atualmente. A principal vantagem dessa técnica é tornar a purificação de gotículas lipídicas mais acessível.Modificamos um kit comercialmente disponível para isolar simultaneamente gotículas lipídicas, ânticulo endoplasmático e lisesos de uma única amostra. O acúmulo de gotículas lipídicas predispõe pacientes obesos e alcoólatras à doença hepática progressiva. Isso mudou a visão das gotículas lipídicas de compartimentos de armazenamento inertes para organelas biologicamente importantes dinâmicas.Para começar, use fórceps estéreis e uma tesoura de dissecção para cortar a pele e as camadas musculares do abdômen do camundongo eutanizado no eixo posterior-anterior, expondo o fígado. Corte os ligamentos ligando o fígado ao intestino. Usando fórceps, puxe o intestino para longe do fígado, em direção ao posterior.Corte o ligamento ligando o fígado ao diafragma. Em seguida, corte entre o fígado e a caixa torácica dorsal, movendo-se de anterior para posterior, até que o fígado seja liberado. Transfira o fígado para uma placa de Petri fria de cinco centímetros com 10 mililitros de PBS frio 1x, e lave o fígado duas vezes em uma plataforma de balanço em 10 mililitros de 1x PBS frios por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a lavagem final, despeje o PBS 1x, e use uma lâmina cirúrgica estéril tamanho 10 para colocar o fígado em pedaços de três a cinco milímetros dentro do prato. Em seguida, lave o fígado picado duas vezes com 10 mililitros de 1x PBS frios por cinco minutos a quatro graus Celsius. Decante o 1x PBS, e transfira as peças de fígado picados para um homogêneo Dounce frio de 45 mililitros, garantindo que todas as peças estejam na parte inferior.Adicione sete mililitros de tampão 1x IE frio. Homogeneize-se no gelo movendo o pilão para cima e para baixo 20 vezes, certificando-se de que o pilão vá para o fundo do homogeneizador durante cada golpe. Transfira o homogeneado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros frios.Enxágüe o homogeneizador com um mililitro de tampão 1x IE frio e adicione-o ao resto do homogeneizado. Para remover núcleos, centrifugar o homogeneizar em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Certifique-se de que qualquer lipídio recolhido na parte superior do tubo de 15 mililitros seja resuspendido para evitar a perda de LD.Certificando-se de que a pelota nuclear na parte inferior do tubo não está perturbada, transfira o supernanato pós-nuclear contendo lipídios para um tubo de centrífuga frio fresco de 50 mililitros. Transfira uma alíquota de 100 microliter do supernanato pós-nuclear para um tubo frio de microcentrífuga de 1,7 mililitro no gelo para análise posterior da pureza. Para remover mitocôndrias, centrifugar a amostra de supernante pós-nuclear em uma centrífuga de alta velocidade refrigerada a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.Certifique-se de que qualquer lipídico recolhido na parte superior do tubo é resuspended para evitar a perda de LD, e, em seguida, transferir o supernatante pós-mitocondrial para um tubo ultracentrífado de 13 mililitros. Transfira uma alíquota de 100 microliteres do supernatante pós-mitocondrial para um tubo frio de microcentrífuga de 1,7 mililitro no gelo para análise posterior da pureza. Encha o tubo de ultracentrícula com supernaciante pós-mitocondrial até a borda com tampão 1x IE frio, para evitar que ele entre em colapso durante a ultracentrifugação.Equilibre as amostras e, em seguida, centrífuga em uma ultracentrifuagem a 100.000 vezes g por 60 minutos a quatro graus Celsius. Para remover a camada LD, incline o tubo em um ângulo de 45 graus e aspire com uma pipeta de vidro. Depois de transferir a pelota para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros frio, colete 100 microlitres do supernatante pós-ER sob a camada lipídica para análise de pureza.Para pellet qualquer detrito celular, centrífuga em uma microcentrifuagem em alta velocidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aqueça o tubo suavemente com as mãos para ajudar a resuspensar a camada LD, e transfira o supernante, incluindo a camada lipídica, para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Repita estas etapas de lavagem, aquecendo o tubo duas a três vezes, até que a pelota não esteja mais visível.Em seguida, para lavar o supernanato LD sem pelotas, adicione 1x PBS a um volume final de 1,5 mililitros, e centrífuga em uma microcentrifuagem em velocidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius. Use uma pipeta de vidro para remover um mililitro de 1x PBS, que está sob a camada lipídica, sem perturbar a camada lipídica. Repita a lavagem de LD de quatro a cinco vezes, até que o 1x PBS seja visualmente transparente sem turbidez.Em seguida, use uma pipeta de vidro para remover todos os PBS 1x abaixo da camada lipídica e use a fração LD pura resultante para análise a jusante. Quando as imagens LD fluorescentes e brilhantes representativas de 20x foram tiradas tanto do isolamento LD do kit ER quanto dos métodos de isolamento de LD de sacarose, eles revelaram níveis semelhantes de material particulado, sugerindo purezas semelhantes usando dois protocolos diferentes. Após a purificação, os níveis de triglicerídeos e proteínas LD foram medidos utilizando-se assins de assimetria colorimétrica, e os dados foram normalizados para o peso do fígado, mostrando que quando o material inicial foi normalizado, o triglicerídeo LD e os rendimentos proteicos foram semelhantes utilizando o kit ER e o método de sacarose.Os diâmetros de LD foram quantificados por meio de um software de análise de imagem, mostrando que o isolamento LD do kit ER e o isolamento de LD de sacarose produziram LDs de tamanhos semelhantes. Para avaliar a pureza da LD, as amostras foram avaliadas por imunoblotting, mostrando que os LDs derivados do isolamento LD do kit ER e do protocolo de gradiente de sacarose ambos tinham pureza igual. PLIN2, um marcador LD, foi detectado em todas as amostras, exceto no isolamento LD do kit ER PER e na PNS da sacarose.A análise de pureza de uma fração de ER usando imunoblots mostra que eles estavam livres do marcador LD PLIN2, mas tinham níveis significativos da proteína ER SEC61A. Também foi avaliada a pureza de uma fração lisesomal após a purificação de lisesomos usando o kit de enriquecimento lysossomo. Discovery é atualmente a aplicação mais útil do nosso protocolo.Realizamos lipidomics em organelas purificadas, e mostramos que as lipotoxinas são aumentadas especificamente em gotículas lipídicas em doença hepática alcoólica.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a formação da sinapse imunológica em células natural killer (NK) em uma bicamada lipídica (SLB) suportada. O SLB é primeiro marcado com um ligante do receptor ativador de células NK marcado com fluoróforo, seguido de incubação com células NK. Posteriormente, as células são coradas para actina polimerizada e grânulos líticos positivos para perforina. Essa abordagem permite a visualização da formação de sinapses usando microscopia de depleção de...

Imagem de super-resolução da formação de sinapses imunológicas de células NK em uma bicamada lipídica suportada

Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

A lipofagia é uma forma seletiva de autofagia que envolve a degradação de gotículas lipídicas. Disfunções nesse processo estão associadas ao desenvolvimento do câncer. No entanto, os mecanismos precisos ainda não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve abordagens quantitativas de imagem para entender melhor a interação entre autofagia, metabolismo lipídico e progressão do câncer.

Explorando a regulação do catabolismo de gotículas lipídicas por meio da lipofagia

Aprenda a isolar gotas lipídicas de fígado de camundongo usando um kit comercial modificado. Este método permite purificação simultânea de múltiplas organelas, facilitando estudos em biologia de gotas lipídicas e doenças hepáticas.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

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