Name: Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a gerar organoides de pele 3D a partir de células-tronco pluripotentes induzidas de sangue de cordão umbilical. Este protocolo diferencia queratinócitos e fibroblastos para pesquisa dermatológica e medicina regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por um subsídio da Coreia saúde tecnologia R & D projeto, Ministério da saúde, bem-estar e assuntos de família, República da Coreia (H16C2177, H18C1178).

Todos os procedimentos que envolvam animais foram realizados de acordo com a lei de bem-estar de animais de laboratório, o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, e as diretrizes e políticas para a experimentação de roedor fornecido pelo cuidado Animal institucional e Use o Comité (IACUC) da escola de medicina da Universidade Católica da Coreia. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Católica da Coreia (CUMC-2018-0191-01). O IACUC e o departamento de laboratório animais (DOLA) da Universidade Católica da Coreia, Songeui Campus credenciados as instalações de laboratório Animal de excelência de Coreia da Coreia Food and Drug Administration em 2017 e adquirida Associação para avaliação e Acreditação de acreditação total Internacional de laboratório Animal conta internacional (AAALAC) em 2018.
1. pele diferenciação celular de células-tronco pluripotentes induzidas
<ol><li>Preparação média Nota: Guarde todos os média a 4 ° C em um ambiente escuro por até 3 meses. Filtro médio todos usando um sistema de filtro de polietersulfona 0,22 μm antes do uso para a esterilização. Todos médio estava disponível em um volume total de 500 mL.<ol>
<li>Preparar o KDM1 (meio de diferenciação queratinócito 1). Médio (DMEM modificado águia do mix Dulbecco) / F12 médio (3:1), com 2% de soro fetal bovino (FBS), 0,3 mmol/L ácido L-ascórbico, 5 μg/mL insulina e 24 adenina µ g/mL.</li>
		<li>Preparar o KDM2 (meio de diferenciação queratinócito 2). Mix definido queratinócito soro livre médio (veja a Tabela de materiais) com 0,3 mmol/l ácido L-ascórbico, 5 μg/mL insulina e adenina de 10 μg/mL. Nota: Queratinócito definidos soro livre médio é otimizado para suportar o crescimento e a expansão dos queratinócitos.</li>
		<li>Preparar o KDM3 (meio de diferenciação de queratinócitos 3). Mix definidos queratinócito soro livre médio e meio livre de soro do queratinócito (1:1) consulte a Tabela de materiais para obter detalhes. Nota: Queratinócito soro livre médio é otimizado para o crescimento e a manutenção de queratinócitos.</li>
		<li>Preparar o FDM1 (meio de diferenciação de fibroblastos 1). Meio de mistura DMEM/F12 (3:1) com 5% FBS, 5 μg/mL insulina, adenina de 0,18 mM e 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF).</li>
		<li>Preparar o FDM2 (meio de diferenciação de fibroblastos 2). Meio de mistura DMEM/F12 (1:1) com 5% FBS e 1% não essenciais aminoácidos.</li>
		<li>Preparar o EP1 (epitelial médio 1). DMEM/F12 Mix (3:1) com 4 mM L-glutamina, 40 adenina μM, 10 transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL e 0,1% FBS.</li>
		<li>Preparar o EP2 (epitelial médio 2). Misture o EP1 e 1,8 mM de cloreto de cálcio.</li>
		<li>Preparar o EP3 (epitelial médio 3, cornificação médio). Meio de mistura F12 com 4 mM L-glutamina, 40 adenina μM, 10 transferrina μg/mL, insulina de 10 μg/mL, 2% FBS e 1,8 mM de cloreto de cálcio.</li>
	</ol></li>
	<li>Geração de corpo embrionário
	<ol>
<li>Gere CBMC-iPSCs usando o protocolo mostrado no estudo anterior12.</li>
		<li>Pratos de cultura de casaco, usando a vitronectina. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm.<ol>
<li>Descongelar e ressuspender 50 μL de vitronectina 0,5 mg/mL (concentração final: 5 µ g/mL) com 5 mL de salina tampão fosfato (PBS). Adicionar a solução para os pratos e incubar a temperatura ambiente (RT) por 1 h. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Manter as iPSCs CBMC-derivado para a vitronectina revestido 100 mm da placa e mudar o meio de iPSC (E8) diariamente a 37 ° C, com 10% de CO2.</li>
		<li>Gere corpos embrionários (EBs) usando o protocolo demonstrado em um estudo anterior15 (descrito resumidamente como segue). Expanda iPSCs, alterando o meio até que as células têm alcançado confluência de 80%. Na confluência de 80%, remover o meio e lave com PBS.</li>
		<li>Trate as células com 1 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min e colher as células usando 3 mL do meio de E8. Centrifugar as células a 250 x g por 2 min.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e aplicar 5 mL de meio de E8 de células. Contar as células usando um hemocytometer e transferir 1 x 106 células para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 250 x g por 2 min.</li>
		<li>Ressuspender as células transferidas com 2,5 mL de meio de formação EB com inibidor de quinase Rho-associado (ROCK) 10 μM. 1 x 104 células (25 µ l/gota) na tampa do prato cultura noncoated usando uma pipeta de canais múltiplos de 10 – 100 μL de cair. Formulário 100 EBs de 1 x 106 células (1 x 104 células/1 EB). Vire o prato e segure a tampa da gota. Nota: Inibidor ROCK é necessária durante a etapa de penhora no processo de diferenciação e manutenção. Adicione o inibidor ROCK apenas na fase de agregação de EB.</li>
		<li>Incube a 37 ° C com 5% CO2 gotas para 1 dia.</li>
		<li>No dia seguinte, colher a 100 EBs e usá-los para diferenciação. Lavar a tampa da placa com meio de iPSC (meio de E8) ou PBS e colher o seu conteúdo para um tubo cónico de 50 mL. Manter o EBs em RT para 1 min para acalmá-los. Aspire o sobrenadante e ressuspender o EBs com E8 médio mantê-los em um prato de Petri de 90 milímetros até a diferenciação.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação de CBMC-iPSCs em queratinócitos Nota: Para um esquema da diferenciação queratinócito da CBMC-iPSCs, consulte a Figura 1A.<ol>
<li>EBs de colheita a 100 para um tubo cônico de 50 mL, com média de iPSC ou PBS. Manter em RT para 1 min assentar o EBs. Certifique-se que eles resolvem na parte inferior do tubo cónico. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o EBs com E8 médio com 1 ng/mL Proteína morfogenética óssea 4 (BMP4). Transferir o EBs para uma placa de Petri de 90 mm e mantê-los a 37 ° C com 5% de CO2 por 1 dia.</li>
		<li>Casaco de pratos de cultura, usando o colágeno tipo IV. Prepare-se 5 mL de colágeno de tipo IV para revestir um prato de 100 mm.<ol>
<li>Descongelar e ressuspender o tipo solução de colágeno IV (concentração final: 50 µ g/mL) com 0,05 N HCl. Adicione a solução para os pratos e incubar a RT por 1 h. aspirar o material de revestimento antes do uso (para não secar). Nota: Antes de utilizar as placas, lavar os pratos 3 x com PBS para remover qualquer ácido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colher o EBs (etapa 1.3.1) para um tubo cónico de 50 mL e mantê-las em RT para 1 min para acalmá-los. Certifique-se que resolver na parte inferior do tubo cónico, aspirar o sobrenadante e ressuspender o EBs em 6 mL de KDM1 com inibidor ROCK 10 µM. Transferi o EBs para o prato de 100mm revestido de colágeno tipo IV. Nota: Adicione o inibidor ROCK apenas na fase de fixação de EB.</li>
		<li>Entre os dias 8 – 0, altere o meio de todos os outros dias para KDM1 com ácido retinoico de 3 µM (RA) e 25 ng/mL cada de BMP4 e EGF. Manter o EBs a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
		<li>Entre os dias 9 a 12, altere o meio todos os dias para KDM2 com 3 µM RA, 25 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.</li>
		<li>Entre os dias 13 a 30, altere o meio de todos os outros dias para KDM3 com 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação de CBMC-iPSC em fibroblastos Nota: Para um esquema de diferenciação de fibroblastos de CBMC-iPSCs, ver Figura 2.<ol>
<li>Pratos de cultura de casaco, usando a matriz de membrana basal. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm.<ol>
<li>Descongelar a matriz da membrana basal (concentração final: 600 ng/mL) e diluir com meio DMEM/F12. Adicionar a solução para os pratos e incubar a 37 ° C por 30 min. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar).</li>
		</ol>
</li>
		<li>EBs de colheita a 100 para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta com iPSC médio ou PBS. Manter em RT para 1 min assentar o EBs. Certifique-se de que casos são fechados na parte inferior do tubo cónico. Remova o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o EBs utilizando uma pipeta de 1.000 µ l em 6 mL de FDM1 com inibidor ROCK 10 µM. Transferir o EBs (com médio) para um prato de 100mm matriz-revestido de membrana basal e incubar a 37 ° C com 5% de CO2. Atualize o FDM1 todos os dias por 3 dias. Nota: Apenas adicione o inibidor ROCK na fase de fixação de EB.</li>
		<li>Adicione 0,5 nM Proteína morfogenética óssea (BMP-4) de 4 para o FDM1 entre os dias 4 e 6.</li>
		<li>No dia 7, altere o meio para FDM2 todos os dias durante 1 semana.</li>
		<li>No dia 14, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM2 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1.</li>
		<li>Contar as células usando um hemocytometer, Ressuspender 2 x 106 células com FDM1 médio e transferir as células para o prato noncoated. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias.</li>
		<li>Pratos de cultura de casaco, usando colágeno tipo I. Prepare-se 5 mL para revestir um prato de 100 mm. Diluir a solução de colágeno do tipo I (concentração final: 50 µ g/mL) em 0,02 N de ácido acético. Adicionar a solução para os pratos e incubar a RT por 1 h. aspirado o material de revestimento antes do uso (para não secar). Nota: Antes de utilizar as placas, lavar os pratos 3 x com PBS para remover o ácido.</li>
		<li>No dia 21, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM1 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1. Contar as células usando um hemocytometer e a transferência de 2 x 106 células para o tipo eu prato de colágeno-revestido 100 mm com média de FDM1. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias.</li>
		<li>No dia 28, adicionar 1 mL de 1 mM de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células com 3 mL de FDM1 e centrifugar a 250 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de FDM1. Contar as células usando um hemocytometer e transferir 2 x 106 células para um prato de noncoated com FDM1 médio. Manter a célula a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias. Nota: iPSC-derivado de fibroblastos proliferam como uma linhagem de células de fibroblastos primários e passagem até 10 passagens. Neste estudo, usamos fibroblastos iPSC-derivado de dois a cinco passagens para posterior análise.</li>
	</ol></li>
</ol>2. a aplicação do hiPSC-derivado de células diferenciadas
<ol><li>
Geração de organoides pele 3D
	<ol>
<li>Preparar neutralizado tipo eu colágeno no gelo, seguindo as recomendações do fabricante. Como a concentração final, use 3 mg/mL de colágeno tipo I (concentração das ações de tipo I colágeno é 3,47 mg/mL) e certifique-se que o volume final da mistura é de 5 mL. Calcular o volume de 10 x PBS (volume final/10 = 0,5 mL). Calcular o volume de colágeno a ser usado tipo I (volume final x concentração de colágeno final / estoque de concentração de colágeno = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calcular o volume de 1 N de NaOH (volume de colágeno deve ser usado x 0,023 mL = 0,1 mL). Calcular o volume de dH2O (volume do volume final - volume de colágeno - de 10 x PBS - volume de 1 NaOH N = 5 mL - 4,32 mL-0,5 mL 0,1 mL = 0,08 mL). Misturar o conteúdo do tubo e mantê-lo no gelo até estar pronto para usar.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de EDTA para os fibroblastos iPSC-derivado da etapa 1.4.10 e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células desanexadas, contar as células usando um hemocytometer e 2 x 105 células de transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 2 min e retirar o sobrenadante. Ressuspender as células de fibroblastos derivados de iPSC em 1,5 mL de FDM1 e neutralizou o tipo eu solução de colágeno (1:1). Nota: Misture a solução com cuidado para evitar bolhas.</li>
		<li>Coloque a inserção da membrana em uma 6-poços microplacas, transfira a mistura para a inserção e incubar a RT por 30 min. Nota: Não mova as placas.</li>
		<li>Depois de confirmar a gelificação, adicione 2 mL do meio para o topo da inserção e 3 mL para o fundo do poço. Incube a matriz de fibroblastos e colágeno a 37 ° C com 5% CO2 por 5-7 dias, até a gelificação é completa e não mais contratos.</li>
		<li>Após a gelificação completa, desanexar os queratinócitos iPSC-derivado (da etapa 1.3.6) usando EDTA. Adicione 1 mL de EDTA e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 min. colher as células desanexadas, contá-los usando um hemocytometer e 1 x 106 células de transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 2 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender 1 x 106 células em 50-100 µ l de meio epitelial de baixo cálcio 1 (EP1).</li>
		<li>Aspire todos médio na matriz (veja a etapa 2.1.5) e 1 x 106 células de queratinócitos em cada camada de fibroblastos iPSC-derivado de sementes. Incube a placa a 37 ° C com 5% de CO2 por 30 min. Nota: Não mova a placa e não adicionar qualquer meio de penhora de queratinócitos.</li>
		<li>Adicione 2 mL de EP1 para o topo da inserção e 3 mL de EP1 para o fundo do poço.</li>
		<li>Depois de 2 dias, aspirar todos meio em placa de inserção de membrana e mudar o meio de cálcio normal EP2 para 2 dias.</li>
		<li>Depois de 2 dias, aspirar todos médio e adicionar 3 mL do meio de cornificação somente a parte inferior para gerar uma interface ar-líquido.</li>
		<li>Manter a pele 3D organoides por até 14 dias a 37 ° C com 5% de CO2 e mudar o meio de todos os outros dias. Colha a pele 3D organoides cortando a borda de inserção e usá-lo para um estudo adicional de coloração e enxerto de pele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enxerto de pele
	<ol>
<li>Realizar a anestesia por inalação em camundongos NOD/scid (masculinos, 6 semanas de idade), usando um método padrão, aprovado institucionalmente. Para enxerto de pele, raspe o pelo da pele dorsal de cada rato.</li>
		<li>Remova uma seção 1 x 2 cm da pele do rato, usando tesouras curvas com fórceps.</li>
		<li>Coloque os organoides CBMC-iPSC-derivado de pele 3D para o local do defeito e sutura usando um método de gravata-sobre curativo com suturas de seda.</li>
		<li>Observar os ratos por 2 semanas e sacrificá-los para análise histológica. O protocolo de coloração foi verificado em anteriores estudos16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetics%3A+its+practice+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomimetics: its practice and theory.</a> Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).</li>
<li>Madison, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+function+of+the+skin%3A+%22la+raison+d%27etre%22+of+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).</li>
<li>Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skin+tissue+engineering+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skin tissue engineering and wound healing.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).</li>
<li>Dixit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+challenges+associated+with+artificial+skin+grafts%3A+available+solutions+and+stem+cells+in+future+design+of+synthetic+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin.</a> Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and nuclear reprogramming.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).</li>
<li>Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+immunogenicity+of+autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).</li>
<li>Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-based+banking+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation%3A+potential+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations.</a> Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">A brief history of HLA.</a> Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Rim, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+of+national+banking+project+on+homozygous+HLA-typed+induced+pluripotent+stem+cells+in+South+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).</li>
<li>Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-haplotype+banking+and+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">HLA-haplotype banking and iPS cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).</li>
<li>Pappas, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings%3A+human+leukocyte+antigen+haplo-homozygous+induced+pluripotent+stem+cell+haplobank+modeled+after+the+california+population%3A+evaluating+matching+in+a+multiethnic+and+admixed+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stembook.org/node/6632">https://www.stembook.org/node/6632</a> (2008).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+complex+skin+structure+via+layered+co-culture+of+keratinocytes+and+fibroblasts+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).</li>
<li>Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+technological+updates+and+clinical+applications+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells.</a> The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+heart+extract+facilitates+the+differentiation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+into+heart+muscle+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).</li>
<li>Stecklum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+mediated+by+co-culture+of+human+umbilical+cord+blood+stem+cells+with+murine+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).</li>
<li>Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Pellet+Formation+from+Cord+Blood-derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).</li>
<li>Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Cord+Blood+and+Cord+Blood-derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cartilage+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration.</a> Cell Transplantation. , (2018).</li>
<li>Shevde, N. K., Mael, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+embryoid+body+formation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+fibroblasts+demonstrate+augmented+production+and+assembly+of+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).</li>
<li>Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of keratinocyte differentiation.</a> Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cultivation+of+keratinocytes+with+an+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface.</a> Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).</li>
<li>Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+pathways+of+filaggrin+and+loricrin--two+major+proteins+expressed+by+terminally+differentiated+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes.</a> Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).</li>
<li>Hohl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+loricrin.+Structure+and+function+of+a+new+class+of+epidermal+cell+envelope+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).</li>
<li>Bern, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Original+and+modified+technique+of+tie-over+dressing%3A+Method+and+application+in+burn+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients.</a> Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).</li>
<li>Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Running+Barbed+Tie-over+Dressing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery+-+Global+Open%22%5BJournal%5D)">The Running Barbed Tie-over Dressing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).</li>
<li>Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cell+sorting+of+fibroblasts+and+keratinocytes+creates+an+organotypic+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent.</a> Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+folliculogenic+human+epithelial+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 5, 3071(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

IPSCs humanas têm sido sugeridos como uma nova alternativa para a medicina regenerativa personalizada17. IPSCs personalizados derivado de paciente refletem características de paciente que podem ser usadas para modelagem de doença, triagem de drogas e transplante autólogo18,19. O uso de derivados de paciente iPSCs também pode superar problemas relativos as células primárias, a falta de números de celular adequada e reações imunes<sup class=...

Pele cobre a superfície mais externa do corpo e protege os órgãos internos. A pele tem várias funções, incluindo proteção contra patógenos, absorver e armazenar água, regular a temperatura do corpo e excretando corpo perca2. Enxertos de pele podem ser classificados dependendo da fonte de pele; enxertos de pele de outro doador são denominados aloenxertos, e enxertos usando a pele do próprio paciente são autoenxertos. Embora um autograft é o tratamento preferido devido ao seu risco de rejeição baixa, biópsias de pele são difíceis de serem realizadas em pacientes com lesões graves ou um número insuficiente de células da pele. Em pacientes com queimaduras graves, três vezes o número de células da pele é necessário para cobrir grandes áreas. A disponibilidade limitada de células da pele do corpo do paciente resulta em situações em que o transplante de allogenous é necessário. Um aloenxerto é usado temporariamente até transplante autólogo pode ser realizado desde que geralmente é rejeitada pelo sistema imunológico do hospedeiro após aproximadamente 1 semana3. Para superar a rejeição pelo sistema imunológico do paciente, enxertos devem ser provenientes de uma fonte com a mesma identidade imunológica do paciente4.
IPSCs humanas são uma fonte emergente das células para terapia de células-tronco5. IPSCs humanas são gerados a partir de células somáticas, usando reprogramação fatores como OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Usar iPSCs humana supera as questões éticas e imunológicas das células-tronco embrionárias (CES)7,8. IPSCs humanas ter pluripotência e pode diferenciar-se em três camadas germinativas9. A presença de HLA, um fator crítico na medicina regenerativa, determina a resposta imune e a possibilidade de rejeição10. O uso de derivados de paciente iPSCs resolve os problemas de rejeição de limitação e sistema imunológico de células-fonte. CBMCs também têm surgido como uma fonte alternativa de célula para medicina regenerativa11. HLA obrigatório digitar, que ocorre durante a operação bancária CBMC, facilmente pode ser usado para pesquisa e transplante de órgãos. Além disso, homozigotos HLA-tipo iPSCs pode aplicar amplamente vários pacientes12. Um banco CBMC-iPSC é uma estratégia eficiente para terapia celular e medicina regenerativa alogênico12,13,14e romance. Neste estudo, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciadas em queratinócitos e fibroblastos e gerar camadas estratificadas pele 3D. Os resultados deste estudo sugerem que um organoides CBMC-iPSC-derivado de pele 3D é uma nova ferramenta de pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos</td></tr><tr><td>AggreWell Medium (meio de formação EB)</td> <td>STEMCELL</td><td>05893</td><td>EB formação</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fibronectina</td><td>abcam</td><td>ab23750</td><td>Marcador de fibroblastos</td></tr><tr><td>Anti-KRT14 anticorpo</td><td>abcam</td><td>ab7800</td><td>Marcador de queratinócitos</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Loricrina</td><td>abcam</td><td>ab85679</td><td>Marcador de estrato córneo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p63</td><td>abcam</td><td>ab124762</td><td>Marcador de queratinócitos</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina</td><td>Santa cruz</td><td>sc-7558</td><td>Marcador de fibroblastos</td></tr><tr><td>TECIDO FLEXÍVEL BAND AID</td><td>Johnson & </td><td></td><td>Johnson-Bandage</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (Matrigel)</td> <td>BD</td><td>354277</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos</td></tr><tr><td>Sutura BLACK SILK</td><td>AILEEE</td><td>SK617</td><td>Enxerto de pele</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Componente do meio epitelial para organoide de pele 3D</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>organoide</td></tr> <tr><td>de pele 3DColágeno tipo IV</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-29010</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>Meio livre definido de queratinócitos</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>DMEM / F12 Médio</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>Componente de meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Essential 8 medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>FBS, Qualified</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos e queratinócitos</td></tr><tr><td>Glutamax Supplement&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invtrogen</td><td>12585-014</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos e queratinócitos</td></tr><tr><td>Tesoura curva padrão de íris Profissional</td><td></td><td>PC-02.10</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Soro de queratinócitos Meio livre</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfata sesquimagnésio sal hidrato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>MEM Aminoácido não essencial</td><td>Gibco</td><td>1140050</td><td>Componente do meio de diferenciação para fibroblastos</td></tr><tr><td>Meriam Pinça Polegar 16 cm</td><td>HIROSE</td><td>HC 2265-1</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc SCID/J</td><td>O Laboratório Jackson 001303</td><td></td><td>Ratos cepa para enxerto de pele</td></tr><tr><td>Placa de Petri 90 mm</td><td>Hyundai Micro</td><td>H10090</td><td>Utensílios de plástico</td></tr><tr><td>Recombinante Humano BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>Proteína EGF humana recombinante</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Componente do meio de diferenciação para queratinócitos</td></tr><tr><td>T/C Petridish 100 mm, 240/bx</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Plástico</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T3705</td><td>Componente do meio epitelial para organoide de pele 3D</td></tr><tr><td>Transwell-COL inserções de membrana revestidas de colágeno & nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3492</td><td>Plástico para organoide de pele 3D&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life technologies</td><td>A14700</td><td>cultura iPSC</td></tr><tr><td>Y-27632 Dicloridrato</td><td>peprotech</td><td>1293823</td><td>cultura iPSC</td></tr></tbody></table>

geração de organoides pele 3d do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

A pele é o maior órgão do corpo e tem muitas funções. A pele atua como uma barreira física e protetor do corpo e regula as funções corporais. A biomimética é a imitação dos modelos, sistemas e elementos da natureza com a finalidade de resolver problemas humanos complexos1. Pele a biomimética é uma ferramenta útil para investigação de doença in vitro e in vivo medicina regenerativa. Células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) têm a característica de proliferação ilimitada e a capacidade de diferenciação de três camadas germinativas. IPSCs humanas são gerados a partir de várias células primárias, tais como as células do sangue, queratinócitos, fibroblastos e muito mais. Entre eles, células mononucleares de sangue de cordão (CBMCs) surgiram como uma fonte alternativa de célula na perspectiva da medicina regenerativa alogênico. CBMCs são úteis na medicina regenerativa, porque leucocitário humano (HLA) de antígeno digitando é essencial para a célula, sistema bancário. Nós fornecemos um método para a diferenciação de CBMC-iPSCs em queratinócitos e fibroblastos e para a geração de uma pele 3D organoides. Fibroblastos e queratinócitos CBMC-iPSC derivados têm características semelhantes a uma linha celular primária. Os organoids 3D da pele são gerados pela sobreposição de uma camada epidérmica em uma camada dérmica. Transplantando essa pele 3D organoides, é gerado um modelo de ratos humanizados. Este estudo mostra que um organoides 3D pele humana iPSC-derivado podem ser uma ferramenta de novela, alternativa para pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.

Pele é composta, na maior parte, a epiderme e a derme. Os queratinócitos são o tipo principal de células da epiderme, e fibroblastos são o tipo de célula principal da derme. O esquema de diferenciação queratinócito é mostrado na Figura 1A. CBMC-iPCSc foram mantidos em um prato vitronectina-revestido (Figura 1B). Neste estudo, nós diferenciados CBMC-iPSCs em queratinócitos e fibroblastos usando formação EB. Geramos EBs usando o e...

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

As células mononucleares do sangue do cordão umbilical, ou CBMC, emergiram como uma fonte celular potencial para a medicina regenerativa, porque a digitação de antígeno leucócito humano é essencial para o sistema bancário celular. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo CBMC, ou CMBC-iPSCs, podem ser diferenciadas em queratinócitos e fibroblastos. Para gerar organoide de pele 3D, estamos usando pesquisa dermatológica.Comece por culminar cbmc-iPSC em placas de 100 mililitros revestidas de vitronectina a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80% de confluência, lave as culturas com PBS e trate-as com um mililitro de EDTA de um mililitro por placa por dois minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células se separarem, pare a reação com três mililitros de E8 médio por placa, e colete as células por centrifugação.Suspenda as pelotas em cinco mililitros de meio E8 para contagem, e transfira uma das células de 10 para o sexto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda as células transferidas com 2,5 mililitros de meio de formação corporal embrionária, suplementadas com quinase associada a 10 micromolar, ou inibidor de ROCHA. Use uma pipeta para transferir gotículas de 125 microliter de células para uma tampa de placa de cultura não revestida.Quando todas as gotículas tiverem sido colocadas, vire o prato para permitir que as gotículas fiquem penduradas na tampa por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave a tampa com meio E8 fresco e transfira a solução do corpo embrionário para um tubo cônico de 50 mililitros. Permita que os corpos embrionários se contentem por um minuto à temperatura ambiente, antes de aspirar o supernascente e suspender os corpos embrionários com meio E8 fresco para sua cultura em uma placa de Petri de 90 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até sua diferenciação.Para diferenciação de queratinócito cbmc-iPSC, substitua o meio E8 da cultura corporal embrionária por um meio E8 fresco, complementado com um nanograma por mililitro de proteína morfogenética óssea 4 para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, colde os corpos embrionários em um tubo cônico de 50 mililitros, como demonstrado, e permita que os corpos se contentem por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o supernatante por seis mililitros de meio de diferenciação de queratinócito 1, ou KDM1, complementado com 10 inibidores de ROCK de micromolar, e transfira os corpos embrionários para um prato de 100 milímetros revestido de colágeno tipo IV.Nos dias zero a oito da cultura, substitua o meio a cada dois dias por KDM1 fresco, complementado com ácido retinóico de três micromolares e 25 nanogramas por mililitro cada uma da proteína morfogenética 4 óssea e fator de crescimento epidérmico. Entre os dias nove e 12, substitua o meio a cada dois dias por KDM2, complementado com ácido retinóico de três micromolares, 25 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea 4, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico. Entre os dias 13 e 30, mude o meio a cada dois dias para KDM3, complementado com 10 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea 4, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico.Para diferenciação do fibroblasto CBMC-iPSC, suspenda a cultura do corpo embrionário em seis mililitros do meio de diferenciação do fibroblasto 1, suplementado com inibidor de ROCHA de 10 micromolares, e transfira a suspensão do corpo embrionário para um prato de 100 milímetros revestido de matriz de membrana de porão. Após três dias de incubação, trate a cultura com 0,5-nanomolar proteína morfogenética óssea 4 por quatro dias, antes de mudar o médio para o fibroblasto de diferenciação médio 2. No sétimo dia de cultura, mude o médio para FDM2 a cada dois dias por uma semana.No dia 14 da cultura, desprendem as células com EDTA de um mililitro como demonstrado, e coletem as células em três mililitros de diferenciação de fibroblasto médio 2 para centrifugação. Suspenda as células em cinco mililitros de diferenciação de fibroblasto 1 para contagem, e transfira duas células de 10 para o sexto para um prato não revestido. No dia 21 da cultura, transfira duas vezes 10 para o sexto das células da cultura para um prato de 100 milímetros revestido de colágeno tipo I em meio de diferenciação de fibroblasto fresco 1.No dia 28 da cultura, transfira duas vezes 10 para seis dos fibroblastos derivados do iPSC para um novo prato não revestido. Para a geração organoide da pele tridimensional, colde os fibroblastos derivados do iPSC da cultura, e transfira duas células de 10 para o quinto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda a pelota do fibroblasto em 1,5 mililitros de fibroblasto médio 1, e 1,5 mililitros de solução neutralizada de Colágeno Tipo I.Incubar as células em uma pastilha em uma microplacão de seis poços por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando a solução se solidificar, adicione dois mililitros de médio ao topo da pastilha, e três mililitros na parte inferior do poço. Em seguida, coloque a matriz do fibroblasto na incubadora por cinco a sete dias, até que a gelação esteja completa, e a matriz não se contrai mais.No final da incubação, colde os queratinócitos derivados do iPSC e transfira uma vez 10 para o sexto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda a pelota em 50 a 100 microlitadores de baixo nível epitelial de cálcio 1, e substitua o meio sobre a matriz do fibroblasto pela solução celular queratinócito. Após 15 minutos a 37 graus Celsius, substitua o médio na parte superior da inserção por dois mililitros de média epitelial 1, e o médio no poço inferior com três mililitros do mesmo, e devolva a placa à incubadora.Após dois dias, substitua o meio na pastilha e o poço por meio epitelial de cálcio normal 2 por dois dias adicionais de cultura. No quarto dia de cultura, remova todo o meio e adicione três mililitros de meio de cornificação apenas para o fundo, para gerar uma interface ar-líquido. Em seguida, devolva a placa à incubadora por até 14 dias antes de colher o organoide de pele 3D para análise a jusante.Os queratinócitos derivados do CBMC-iPSC têm morfologia semelhante aos queratinócitos primários, e a expressão de marcadores de queratinócitos é aumentada nessas células. Os fibroblastos derivados do CBMC-iPSC têm morfologia semelhante aos fibroblastos primários, e a expressão do marcador de células-tronco pluripotentes Oct-4 é regulada, enquanto os marcadores de fibroblasto são regulados. A espessura do organoide de pele 3D aumenta durante a cultura 3D, confirmando que o organoide de pele 3D é gerado a partir de queratinócitos e fibroblastos derivados do iPSC.Após duas semanas, um enxerto organoide de pele 3D transplantado incorpora eficientemente em uma pele de rato receptora, como confirmado pela análise do HNE. Além disso, os marcadores de maturação e diferenciação epidérmica são expressos nos organoides de pele 3D derivados do CBMC-iPSC, demonstrando uma diferenciação funcional, enxerto eficiente e cicatrização eficaz dos defeitos da pele do camundongo. Usamos no passado com o alto meio de cálcio que induz camadas estratificadas de organoide de pele 3D para imitar perto da pele.a análise mostra que a pele é estratificada. Os CBMC-iPSCs são uma fonte celular potencial para enxertos de pele, e organoides de pele 3D derivados do CBMC-iPSC podem ser usados em estudos relacionados à dermatologia, triagem cosmética e medicina regenerativa.

generation-3d-skin-organoid-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar reconstruções organotípicas da pele in vitro em 3D para estudar a progressão do melanoma. Este modelo de pele imita a arquitetura e a complexidade multicelular dos órgãos in vivo.

Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.

Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este protocolo descreve um método para produzir organoides da pele contendo folículos pilosos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido planar e fisiologicamente relevante para replicar a arquitetura e a função da pele.

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Aprenda a gerar organoides de pele 3D a partir de células-tronco pluripotentes induzidas de sangue de cordão umbilical. Este protocolo diferencia queratinócitos e fibroblastos para pesquisa dermatológica e medicina regenerativa.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Explorar mais vídeos