Name: Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a dissecar retinas pupais de Drosophila melanogaster para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA. Este método eficiente preserva a integridade tecidual para múltiplas aplicações.

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Agradecemos a Zack tambor e nossos revisores para comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela R15GM114729.

1. tecido preparação
<ol><li>Configurar Drosophila cruza (conforme descrito anteriormente20) ou cultura específicas cepas de drosófila para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas emerge coincidentemente, estabelecer essas culturas voar em duplicado na mídia de alimentos ricos em nutrientes ou padrão alimentar mídia generosamente suplementadas com levedura-colar.</li>
	<li>Manter as culturas de Drosophila , a 25 ° C. Para cruzamentos utilizando o sistema de UAS-GAL4, GMR-GAL4 é um condutor ideal expressado nas células do disco olho larval posteriores ao sulco morfogenético e durante todo o desenvolvimento pupal21,22,23, 24. o Cruz UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve como um controle ideal Cruz como conduz a expressão da proteína β-galactosidase não endógena e inerte.</li>
	<li>Uso a ponta de uma tala de bambu 6" que tenha sido molhada com água destilada para gentilmente levante brancos pré-pupas (figura 1B) do lado dos frascos de cultura saudável (figura 1A) e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (Figura 1).</li>
	<li>Coloque os tubos em uma caixa de ponta da pipeta plástico juntamente com um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada para manter a câmara em humidade suficiente para proteger as pupas de dessecação (Figura 1). Incube as pupas a 25 ° C até a dissecação.</li>
	<li>Use uma tala de bambu seco 6" para empurre suavemente as pupas para fora do tubo de microcentrifugadora e para um negro dissecando o prato. Coloque um pedaço de fita dupla-face fresco sobre o prato de dissecação longe as pupas.</li>
	<li>Usando um par de pinças, coloque cuidadosamente o lado dorsal pupas para cima (ou seja, operculums voltada para cima, figura 1B) para a fita (Figura 2A). Certifique-se de que as pupas aderirem bem a fita. Nota: Umidade no caso pupal irá inibir a adesão seguro à fita, caso em que, permitir que as pupas secar antes de colocar na fita dupla-face.</li>
</ol>2. dissecação de complexos de olho-cérebro
<ol><li>Use a pinça para remover o opérculo da cada pupa (Figura 2).</li>
	<li>Use microdissection tesoura para cortar ou abrir o caso pupal da cada pupa. Aba abrir o caso pupal revelar-te a cabeça, tórax e segmento abdominal anterior, fixando as bordas do pupal caso a fita dupla-face (Figura 2). Nota: Não é necessário revelar inteiramente as pupas.</li>
	<li>Perfurar o abdome da pupa cada com Pinças afiadas, para agarrar o animal e removê-lo do seu caso pupal (Figura 2).</li>
	<li>Coloque o prato de dissecação preto, longe da fita, as pupas e cubra com cerca de 400 µ l de gelado-tampão-fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Segure cada pupa por abdômen com fórceps e com uma tesoura microdissection, fazer um corte limpo transversal pelo tórax inteiro, cortando a pupa na metade (Figura 2D).</li>
	<li>Retire o posterior remanescente de cada carcaça da PBS e ponha de lado o prato dissecação (não descarte, veja Passo 3.2.1).</li>
	<li>Usando dois pares de pinças bem, abra o tórax e a cabeça da cada pupa para revelar o olho-cérebro complexo (figura 2E). Para fazer isso, segure as bordas de corte do epitélio do tórax e gradualmente rasgar para abrir o tórax e depois ir a cápsula, expondo o tecido gordo olho-cérebro complexo e envolvente.</li>
	<li>Sem agarrar o tecido, use fórceps para guiar o olho-cérebro complexo longe os restos da cápsula da cabeça ou colher o olho-cérebro complexo da cápsula cabeça rasgada-aberto. Nota: O complexo de olho-cérebro é em forma de haltere, off-White e mais translúcido do que a gordura de cor creme circundante (Figura 2B, E).</li>
	<li>Com a pinça, cuidadosamente remova a gordura mais associada os complexos de olho-cérebro sem tocar o tecido do olho.</li>
</ol>3. processamento de tecido para imunofluorescência
<ol><li>Disse as pupas de pelo menos 6-10 como descritos (passos 2.1-2,9). Nota: Três ou quatro repetições independentes de cada dissecação tendem a produzir dados suficientes para testar uma hipótese.</li>
	<li>
Lavagem e fixação
	<ol>
<li>Corte a ponta de um P20 ou ponta da pipeta P100 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura ao ~ 1 mm de raio e lubrificar pipetando uma mistura de PBS e gordura acima e para baixo. Esta gordura pode ser obtida os restos de carcaça removidos na etapa 2.6.</li>
		<li>Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBS em um prato de vidro 9-bem, no gelo. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 para transferir. Nota: Complexos de olho-cérebro serão aderem às pontas sem lubrificação durante a pipetagem e danificados ou perdidos.</li>
		<li>Remova a gordura restante associada com o tecido do olho, pipetando a PBS para cima e para baixo agite suavemente os complexos de olho-cérebro. Nesta e em todas as etapas de lavagem subsequente, não diretamente Pipete complexos de olho-cérebro acima e para baixo como isso irá danificar o tecido do olho frágil.</li>
		<li>Os complexos de olho-cérebro em um volume mínimo de transferência (< 20 µ l) de PBS pelo menos 250 µ l de fixador. Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 35 min, no gelo. Nota: A mesma dica lubrificada, preparada na etapa 3.1.1 pode ser usada para esta transferência.</li>
		<li>Com a mesma ponta da pipeta, transferi os complexos de olho-cérebro em um bem contendo µ l ~ 400 de PBS. Misture pipetando a solução acima e para baixo e incube durante 5-10 min no gelo, de lavar. Repita a etapa de lavagem, pelo menos duas vezes. Nota: Complexos de olho-cérebro podem ser mantidos por várias horas na última lavagem PBS, no gelo, ou a 4 ° C, antes de prosseguir para a etapa 3.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mancha do anticorpo
	<ol>
<li>Para bloquear o tecido antes da exposição às soluções de anticorpo, transferi os complexos de olho-cérebro de ~ 400 µ l de PBT. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta P20 ou P100 de deslocamento do ar para a transferência. Incube durante 10 a 60 min, no gelo.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpo primário diluindo anticorpos apropriados em PBT. Desde que os complexos de olho-cérebro são incubados em 10 alíquotas µ l da solução de anticorpo, o volume preparado será idêntico de 10.</li>
		<li>Alíquota 10 µ l de solução de anticorpo em um poço limpo de uma bandeja de 72 poços de microplacas (ver discussão).</li>
		<li>Corte a ponta de uma ponta da pipeta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura de ~0.5 mm de raio e lubrificar por pipetagem PBT acima e para baixo.</li>
		<li>Transferência de não mais que 5 complexos de olho-cérebro, num volume de < 3 µ l de PBS, em cada 10 µ l bem de solução anticorpo usando uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 e ponta lubrificada.</li>
		<li>Homogeneizar a solução anticorpo pipetando a solução acima e para baixo. Não pipete os complexos de olho-cérebro acima e para baixo como isso irá danificar o tecido.</li>
		<li>Para minimizar a evaporação da solução de anticorpo, coloque um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada na bandeja de microplacas e selar a bandeja (por exemplo, com a tampa fornecida). Incubar durante uma noite a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi os complexos de olho-cérebro da bandeja de microplacas para ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-jorrava, para lavar. Use uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 e ponta PBT-lubrificado (preparar conforme descrito na etapa 3.3.4). Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 5-10 min no gelo.</li>
		<li>Repita a etapa de lavagem, pelo menos duas vezes. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir os complexos de olho-cérebro entre soluções de lavagem.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo apropriados fluoróforo-etiquetado anticorpos secundários em PBT conforme necessário. 100 µ l de solução anticorpo secundário é suficiente por lote de pupas de 6-10. Alíquota da solução de anticorpo secundário em um prato de dissecação de vidro 9-jorrava.</li>
		<li>Transferi os complexos de olho-cérebro para solução de anticorpo secundário. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para a transferência.</li>
		<li>Incubar os complexos de olho-cérebro em solução de anticorpo secundário para 1-2 h à temperatura ambiente, ou 3-5 h a 4 ° C. Para evitar o branqueamento de fluorophores pela luz, cobrir a preparação com papel alumínio. Nota: Duração ideal de incubação em solução de anticorpo secundário pode ser diferentes de acordo com os anticorpos primários e secundários usados.</li>
		<li>Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-bem, para lavar. Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 5-10 min no gelo. Esta etapa de lavagem deve ser repetida pelo menos duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixação secundária
	<ol>
<li>Para uma fixação secundária, transferir os complexos de olho-cérebro para pelo menos 200 µ l de fixador e incubar durante 20 min em temperatura ambiente ou 35 min a 4 ° C. Nota: Fixação secundária endurece o tecido do olho, que auxilia a montagem (passo 3.5).</li>
		<li>Use uma dica de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir complexos de olho-cérebro em ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-bem, no gelo, lavar por 5 min.</li>
		<li>Repita a etapa de lavagem, pelo menos uma vez.</li>
		<li>Uso um P20 ou micropipeta de deslocamento de ar P100 e ponta PBT-lubrificado para transferir os complexos de olho-cérebro em ~ 400 µ l de PBS em um prato de vidro 9-bem, no gelo, para enxaguar para 1-2 min. mantém o tecido em movimento por pipetagem PBS, mas não o tecido , cima e para baixo para evitar complexos de olho-cérebro de sedimentação e aderindo ao prato de vidro durante o enxaguamento PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem
	<ol>
<li>Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 200 µ l de mídia de montagem. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir os complexos de olho-cérebro. Permitir que o tecido equilibrar na mídia para 1-2 h de montagem.</li>
		<li>Coloque uma gota de µ l de 5-8 de mídia fresco montagem numa lâmina de microscópio limpa.</li>
		<li>Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura de ~0.5 mm de raio e usar isto e uma micropipeta de deslocamento de ar P10 para transferir os complexos de olho-cérebro em 5-8 µ l de montagem mídia à gota de montagem de mídia no slide.</li>
		<li>Use duas agulhas de tungstênio para separar os olhos dos lóbulos de óptica. Pino de um olho-cérebro complexo para o slide com uma agulha de tungstênio resistente e corte cada olho longe de seu lobo óptico associado com uma agulha fina de tungstênio (Figura 2F).</li>
		<li>Use a agulha fina de tungstênio para manobrar cada olho para a superfície da lâmina de microscópio com a superfície basal de cada olho adjacente ao slide. Delicadamente, abaixe uma lamínula limpa sobre o tecido e fixe com esmalte. Nota: Organizar os olhos do slide para que eles estão perto um do outro ou em uma linha facilitará microscopia subsequente.</li>
		<li>Imagem da retina usando microscopia confocal ou fluorescente. Nota: Slides devem ser armazenados a 4 ° C se não fotografaram imediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparação do tecido do olho para a mancha ocidental:
<ol><li>Dissecar as pupas de 10-16 (passos 2.1-2.9) com as seguintes modificações: a) se reúnem e dissecar as pupas em dois lotes, 10-15 min separado e b) dissecar em PBS suplementado com inibidores de protease e fosfatase (PBS + pi).</li>
	<li>Transferir os complexos de olho-cérebro usando um P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar e lubrificado ponta (preparada como passo 3.2.1) em ~ 400 µ l de PBS + pi em um prato de vidro 9-bem, no gelo, de lavar brevemente. Nota: Esta dica lubrificada pode ser usada para as etapas subsequentes, 4.3 e 4.4.</li>
	<li>Repita a etapa de enxágue duas vezes.</li>
	<li>Transferi todos os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBS frio gelo + pi decantado em um prato limpo preto de dissecação.</li>
	<li>Remova cada olho os lóbulos de óptica usando uma agulha de tungstênio resistente (para firmar o complexo de olho-cérebro) e uma fina lâmina de barbear ou microdissection tesouras de corte limpa cada olho do lobo óptico. Nota: Os olhos são 'pegajosos' nesta fase e podem aderir levemente para o prato de dissecação. Isto é vantajoso, como ele pode ajudar a facilitar a remoção dos olhos de lóbulos óptico (ver discussão).</li>
	<li>'Varra' todos os olhos em uma 'pilha' na PBS + pi sobre o prato de dissecação, usando uma lâmina de um belo par de pinças.</li>
	<li>Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para alargar a abertura-dica para ~0.5 mm de raio e lubrifique o ponta-interior por pipetagem Western tecido Lysis Buffer (WTLB) acima e para baixo.</li>
	<li>Transferi os complexos de olho-cérebro em 5 µ l de PBS + pi em um tubo de microcentrifugadora 500 µ l. Use esta dica lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 para completar a transferência.</li>
	<li>Coloque o tubo de microcentrifugadora no gelo. Adicione 1 volume (5 µ l) de WTLB para a amostra e 10 µ l de buffer de amostra 2 x proteína concentrada (ou 2,5 µ l de buffer de amostra 5 x proteína concentrada). Misture batendo.</li>
	<li>Vórtice a microcentrifuga tubo brevemente e spin para baixo amostra utilizando uma centrífuga mini desktop.</li>
	<li>Armazene a amostra a-20 º C até análise. Analise usando protocolos padrão.</li>
</ol>5. preparação do tecido do olho para extração do RNA:
<ol><li>Usando luvas, bancada limpa, microscópio, instrumentos de dissecação e preto dissecando o prato primeiro com etanol a 70% e, em seguida, reagente de descontaminação de RNase. Deixe-a secar.</li>
	<li>Dissecar as pupas de 30-40 como descritos (passos 2.1-2.9), com as seguintes modificações: um) se reúnem e dissecar as pupas de 6 a 8 em lotes, 15-20 min distante; b) dissecar em livre de nuclease PBS e c) isolar cada lote de olhos separadamente mas acumular todo o tecido da retina no mesmo tubo microcentrifuga (passo 5.5). Nota: Ter duas pessoas a dissecar simultaneamente irá acelerar o isolamento eficiente de tecido do olho bom.</li>
	<li>Para cada lote, isole a complexos de olho-cérebro (passos 2.1-2.9) e a transferência em ~ 400 µ l de PBS nuclease-livre em um prato de vidro 9-poço de lavar brevemente, no gelo, utilizando uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e ponta lubrificada (preparado conforme descrito na etapa 3.1.2). Nota: Esta dica lubrificada pode ser usada para as etapas subsequentes, 5.4, 5.5 e 5,8.</li>
	<li>Repita a etapa de enxágue duas vezes.</li>
	<li>Transferi os complexos de olho-cérebro em uma gota fresca µ 400 l de PBS gelado nuclease-livre em um preto limpo, dissecando o prato.</li>
	<li>Remova cada olho os lóbulos de óptica usando uma agulha de tungstênio resistente (para firmar o olho cérebro complexo) e uma fina lâmina de barbear ou microdissection tesouras de corte limpa cada olho do lobo óptico. Nota: Os olhos são 'pegajosos' nesta fase e podem aderir levemente para o prato de dissecação. Isto é vantajoso, como ele pode ajudar a facilitar a remoção dos olhos de lóbulos óptico (ver discussão).</li>
	<li>'Varra' todos os olhos em uma 'pilha' na PBS nuclease livre sobre o prato de dissecação, usando uma lâmina de um belo par de pinças.</li>
	<li>Transferir os olhos para um tubo estéril de microcentrifuga livre de RNase e congelam em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Repita a dissecação (etapas 5,3-5,8) de cada lote de pupas. Transferência de cada lote de olhos no mesmo tubo microcentrifuga que tem sido mantido em nitrogênio líquido (passo 5.5) para acumular todos os olhos em um tubo.</li>
	<li>Armazene as amostras a-80 ° C até a extração do RNA.</li>
</ol>

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<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método de dissecação de olho pupal drosófila descrito aqui permite o isolamento de 6 a 10 complexos de olho-cérebro dentro de 10 a 15 min. No entanto, paciência e prática são essenciais para dominar a técnica de dissecação e melhorar a qualidade e a velocidade de dissecações. Desta vez de dissecação curto garante que cada olho é aproximadamente mesmo fase de desenvolvimento, reduzindo a variabilidade na expressão do fenótipo ou gene de retina em um conjunto de dados. Enquanto protocolos alternativos podem exig...

A retina de Drosophila é composta de aproximadamente 750 omatídeos, rodeados por células de pigmento, dispostas em um favo de mel lattice1,2,3,4. Cada omatídeo contém oito neurônios fotoreceptor, quatro células cone secretoras de lente e duas células primárias de pigmento. Ao redor cada omatídeo são células produtoras de pigmento do retículo e grupos de cerdas sensoriais. Devido à sua natureza pós mitótica e estereotipado arranjo hexagonal, Drosophila pupal retina fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas incluindo célula adesão5,6, 7,8,9,10 e apoptose11,12,13,14,15.
Vários protocolos publicados utilizam pressão de ar para extrair complexos de olho-cérebro de Drosophila pupas16,17,18. O protocolo descrito aqui, em vez disso utiliza ferramentas microdissection para cuidadosamente e isolar precisamente complexos de olho-cérebro, com o objetivo de se obter o tecido da retina intacto. Isso é fundamental se as retinas são para ser utilizada para morfológica, proteína, ou expressão gênica analisa desde danos à retina podem resultar em estresse celular ou morte, que poderia modificar a expressão celular do fenótipo ou gene. Além disso, depois do treino, complexos de 6 a 10 olho-cérebro podem ser isolados em 10 a 15 min, facilitando o objetivo de minimizar a variabilidade na idade e grau de desenvolvimento do tecido do olho dissecado.
A fixação, imunocoloração e montagem em todo o protocolo descrito abaixo é adequado para a preparação dos olhos de drosófila para microscopia fluorescente. As retinas podem ser incubadas com anticorpos alvejando proteínas de interesse. Por exemplo, anticorpos para componentes de junção aderente podem ser utilizados para visualizar as circunferências apicais das células para que características, incluindo o tipo de célula, forma e arranjo podem ser avaliados19. Antes da fixação, olhos em vez disso podem ser clivados do cérebro com a finalidade de extração de proteínas para análise ocidental, ou RNA para uso em qRT-PCR ou a sequenciação do ARN.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Software de processamento de imagem</td><td>Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Talas de bambu, 6"&nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de beta-glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Prato</td><td></td><td></td> de dissecação preto <td>Prato de Petri de vidro preenchido até a borda com SYLG170 ou SYLG184 (colorido de preto com pó de carvão finamente moído). Deixe em temperatura ambiente por 24-48 h para polimerizar.</td></tr><tr><td>Porta-lâminas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>comprimidos de coquetel inibidores de protease completos e sem EDTA Microscópio</td> confocal <td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>(Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ou microscópio similar</td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila meio alimentar, rico em nutrientes&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7,5% de sacarose, 15% de glicose, 2,5% de ágar, 20% de levedura de cerveja, 5% de peptona, 0,125% de MgSO4,7H2O, 0,125% de CaCl2,2H20</td></tr><tr><td>Drosophila meios alimentares, receita padrão de</td><td></td><td></td><td>fubá do centro de estoque de Bloomington Drosophila.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> fixadora <td>4% formadeído em PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência (microscópio TCS SP5 DM)</td> <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>ou microscópio similar</td></tr><tr><td>Fórceps&nbsp;</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>91150-20</td><td>A pinça deve ser afiada com frequência.</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de vidro com 9 poços&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Também conhecido como pratos de 9 poços&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Software Image Studio versão 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software de processamento de imagens para quantificação de Western blots.</td></tr><tr><td>Tampão de amostra Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X tampão de amostra de proteína concentrada, suplemento com beta mercaptoetanol de acordo com as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Marcador de pista reduzindo o buffer de amostra&nbsp;</td><td>Tampão de amostra de proteína concentrada</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td> 5X.</tr><tr><td>Tubos de microcentrigura&nbsp;</td>Tesoura de microdissecção <td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de Micropoços (72 x 10 &micro; Poços L)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Meios</td><td></td><td></td> de montagem <td>0,5% N-propilgalato e 80% glicerol em PBS</td></tr><tr><td>N-propilgalato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS livre de nuclease (PBS em 0,1% DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Adicione o volume apropriado de DEPC ao PBS, misture bem e incube durante a noite em temperatura ambiente com agitação constante. Autoclave por pelo menos 20 minutos. Armazene a 4&deg; C</td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato pH 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Prepare de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS mais inibidores de protease e fosfatase)</td><td></td><td></td><td>10mM NaF, 1mM beta-glicerol fosfato e 1mM Na3VO4 em PBS, pH 7,4.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15% TritonX e 0,5% de albumina de soro bovino em PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Suporte de pinos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário: cabra anti-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Para Western blotting. Usado a 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorpo primário: Dcp-1 de coelho anticlivado</td><td>Sinalização celular</td><td>9578S</td><td>Para imunofluorescência. Usado a 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo primário: anti-DEcad de rato</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>DCAD2</td><td>Para imunofluorescência. Usado a 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primário: rato anti-DEcad</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; Presente de Tadashi Uemura. Usado em 1:100.</td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&nbsp;</td><td>Reagente</td> de descontaminação Promega <td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>Quebre um pequeno pedaço de lâmina de escape e prenda no suporte da lâmina.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: IgG anti-rato de burro conjugado com 488 (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>Para imunofluorescência. Usado a 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra conjugada com cy3 (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Para imunofluorescência. Usado a 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: Tecnologia de sinalização celular anti-rato IgG (H+L) de cabra conjugada com HRP</td><td></td> <td>7077</td><td>Para Western blotting. Usado a 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: IgG anti-cabra de coelho conjugado com HRP (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Para Western blotting. Usado a 1:3000</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato de Sódio</td><td>Espectrofotômetro Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>(NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação estéreo (M60 ou M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>ou microscópio similar</td></tr><tr><td>Sylgard (preto)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (transparente)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Cor preta com pó de carvão finamente moído</td></tr><tr><td>Tecido: Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride pH7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de tungstênio, fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Insira no suporte do pino</td></tr><tr><td>Agulha de tungstênio, resistente</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Insira no suporte do pino</td></tr><tr><td>WTLB (tampão de lise de tecido ocidental)</td><td></td><td></td><td>NaCl 150mM, Triton X-100 a 1,5%, EDTA 1mM, glicerol a 20%, NaF 10mM, fosfato de betaglicerol 1mM e Na3VO4 1mM em Tris-HCl 50mM (pH 7,5). Suplemento com uma mesa de coquetel de protease completa por 10 mL de solução.</td></tr><tr><td>Pasta de levedura</td> <td>(supermercado local)</td><td></td><td>Aproximadamente 2 colheres de sopa de levedura ActiveDry de Fleischmann (ou similar) dissolvida em ~20 mL de H2O destilada</td></tr></tbody></table>

dissecação da retina pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de rna

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

A retina pupal Drosophila fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas durante o desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos um protocolo confiável para a dissecação da retina pupal Drosophila delicada. Nossa abordagem cirúrgica utiliza ferramentas prontamente disponíveis microdissection para abrir pupas e extrair precisamente complexos de olho-cérebro. Estas podem ser fixas, submetidas a imuno-histoquímica e retinas então montadas em corrediças do microscópio e fotografadas se o objetivo é detectar estruturas celulares ou subcelulares. Alternativamente, as retinas não fixadas podem ser isoladas do tecido cerebral, lysed em buffers apropriadas e utilizadas para proteína gel de electroforese ou mRNA extração (avaliar a expressão de proteínas ou gene, respectivamente). Paciência e prática significativa podem ser necessária para dominar o microdissection protocolo descrito, mas uma vez dominado, o protocolo permite isolamento relativamente rápido da retina principalmente sem danos.

O olho pupal é um tecido facilmente acessível que serve como um excelente modelo para investigar os processos de desenvolvimento que morfogênese da unidade. Aqui, podemos ter dissecado as retinas e usado a imunofluorescência para detectar as junções adherens apical (Figura 3A, C) ou a caspase Dcp-1 (Figura 3D) que é ativada durante a apoptose (Figura 3)25. Essas abordagens permitem observar c...

Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Este protocolo é significativo porque este é um método eficiente para o isolamento do tecido ocular pupal Drosophila para múltiplas aplicações a jusante. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a dissecação rápida de um grande número de olhos pupais sem danificar o tecido. A dissecação da retina pupal Drosophila será um desafio para os novatos.Praticar a técnica é a melhor maneira de melhorar a velocidade das dissecções e a qualidade dos resultados. Depois de colocar o pupae Drosophila em um prato de dissecação preto, coloque um pedaço fresco de fita dupla face no prato de dissecação, longe da pupae, e use um par de fórceps para colocar cuidadosamente o lado dorsal pupae sobre a fita. Coloque o prato sob um microscópio estéreo e use fórceps para remover o operculum de cada pupa.Use uma tesoura de microdisseção para cortar cada caixa pupal, permitindo que ela seja aberta para revelar a cabeça, o tórax e o segmento abdominal anterior, e fixar as bordas da caixa pupal à fita de dupla face. Fure o abdômen de cada pupa com fórceps afiados, e remova a pupa de sua caixa pupal. Coloque a pupa no prato de dissecção, longe da fita, e cubra a pupa com 400 microliters de PBS gelad

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o complexo olho-cérebro das pupas de Drosophila. O protocolo apresentado demonstra o procedimento produzindo tecido de alta qualidade, compatível com, por exemplo, imunocoloração, bem como outros experimentos de expressão gênica.

Dissecção do complexo olho-cérebro de pupas de moscas: um método para isolar o tecido retiniano

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

O objetivo desta técnica é permitir que os pesquisadores realizem dissecação, imunocoloração e montagem de discos oculares de Drosophila melanogaster de qualquer idade.

Dissecção e montagem de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupais Discos Eye

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Aqui, apresentamos um protocolo para estágio e dissecar a desenvolver o tecido olfativo de espécies de Drosophila . O tecido dissecado mais tarde pode ser usado para análises moleculares, como quantitativa de RT-PCR (Reverse transcrição-Polymerase Chain Reaction) ou RNA sequenciamento (RNAseq), bem como na vivo de análise como a imuno-histoquímica ou em situ hibridização.

Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

Aprenda a dissecar retinas pupais de Drosophila melanogaster para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA. Este método eficiente preserva a integridade tecidual para múltiplas aplicações.

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

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