Name: Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a medir a estabilidade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica para bioquímica. Este método avalia diretamente a atividade catalítica sob diferentes condições, reduzindo tempo de análise em relação aos ensaios tradicionais.

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1. preparação de amostras
<ol><li>
1.000 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 4,6
	<ol>
<li>Medir a 800 mL de água destilada num copo graduado de 1.000 mL.</li>
		<li>Pesa 8,2 g de acetato de sódio anidro e adicioná-lo para o copo.</li>
		<li>Coloque o copo sobre um prato de agitar, colocar uma haste de agitação no copo medidor, ligue a placa de agitação e mexa até dissolver completamente.</li>
		<li>Quando o acetato de sódio anidro é completamente dissolvido, medir o pH da solução com um medidor de pH calibrado.</li>
		<li>Adicione 1 M de HCl ou NaOH em conformidade para obter o pH desejado 4.6.</li>
		<li>Adicione água destilada até que o volume total é de 1.000 mL.</li>
		<li>Armazenar em temperatura ambiente até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de enzima
	<ol>
<li>Prepare-se 10 mL do cilindro de solução dentro da faixa de 10-30 mg/mL por primeira medição 8 mL do 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 em um 15 mL formou-se a enzima.</li>
		<li>Adicionar a solução-tampão em um tubo cônico de 15 mL com enzima e agitar vigorosamente até dissolver a enzima.</li>
		<li>Adicione mais solução-tampão, até que o volume total é de 10 mL.</li>
		<li>Armazene a solução de enzima a 4 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de substrato
	<ol>
<li>Para preparar uma solução de substrato dentro da faixa de 300-600 mM, calcule a quantidade de substrato necessário em gramas para fazer a concentração desejada.</li>
		<li>Pesar o substrato e colocar em um copo de vidro de 100 mL</li>
		<li>Medir 20 mL da solução-tampão usando um cilindro graduado de 25 mL e adicioná-lo para o copo de vidro.</li>
		<li>Coloque o copo sobre um prato de agitar e colocar uma haste de agitação magnética para o copo. Ligue o calor e ajustar a velocidade de agita em conformidade.</li>
		<li>Permitir que mexendo para continuar até que o substrato se dissolva.</li>
		<li>Despeje a solução de substrato em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 até o volume total é de 45 mL. Misturar por agitação.</li>
		<li>Armazene a solução de substrato à temperatura ambiente até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. realizando o experimento
<ol><li>Preparando o instrumento ITC<ol>
<li>Certifique-se de que a referência de célula é carregada com 350 µ l de água destilada. Antes de carregar a enzima na célula de amostra, verifique se que a célula de amostra ter sido limpo.</li>
		<li>Limpeza de protocolo-encha a seringa de carregamento com 500 µ l de solução de limpeza de 2% (Tabela de materiais), insira cuidadosamente a agulha para a célula de amostra, preencher a célula e retire lentamente o líquido usando a mesma seringa. Descarte o líquido para um copo. Repetir esta etapa duas vezes com 2% de solução de limpeza (Tabela de materiais), três vezes com etanol 70% e em seguida lavar dez vezes com água destilada.</li>
		<li>Encha a seringa de carregamento com 450 µ l de solução enzimática, cuidadosamente, introduza a agulha até a parte inferior da célula de amostra e pressione o êmbolo até a linha de 100 µ l lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.</li>
		<li>Lave a seringa de titulação de 50 µ l com água destilada três vezes, colocando a ponta da agulha em água e depois lentamente levando a água para a seringa, em seguida, dispensando a água em um recipiente de resíduos.</li>
		<li>Remova a água residual por uma lavagem com solução de substrato três vezes.</li>
		<li>Encha a seringa de titulação com solução de substrato, desenhando-se a solução até que a seringa está cheia sem quaisquer bolhas de ar.</li>
		<li>Com a seringa ainda na solução de substrato, retire o êmbolo e deixe aproximadamente 2 µ l de ar a entrar no top da seringa e insira novamente o êmbolo.</li>
		<li>Retire a alça buret do ITC, coloque a seringa dentro da alça buret rosca e até apertar.</li>
		<li>Limpe a ponta do agitador com um pano livre de fiapos, depois cuidadosamente coloque a alça buret dentro do instrumento ITC e bloqueá-la.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. criação de ITCrun
<ol><li>No computador, abra o ITCrun e clique em Configurar.</li>
	<li>Clique em taxa de agitação e conjunto para 350 RPM. Verifique o tamanho da seringa (µ l) e se é em 50 µ l.</li>
	<li>Definir a temperatura e clique em Update. Recomenda-se que esta etapa seja realizada pelo menos 1 h antes de preparar o ITC. Isso permite tempo suficiente para o instrumento aquecer ou refrigerar para baixo, conforme necessário.</li>
	<li>Para a instalação do experimento, selecione titulação incremental.</li>
	<li>Clique em Inserir para configurar as injeções. Ajustar o intervalo de injeção para 5.400 s, volume de injeção (µ l) 4 e o número de injeções para 4. Pressione Okey para confirmar as configurações.</li>
	<li>Na caixa de equilibração, selecione Autoequilibrar e grande esperado aquece. (Se o esperado aquece-se pequeno, um pode selecionar pequenos sob aquece esperado; no entanto, isto irá aumentar o tempo da equilibração).</li>
	<li>Definir a linha de base inicial para 300 s.</li>
	<li>Para iniciar a execução, clique a começar símbolo ao lado de taxa de agitação e, em seguida, clique Iniciar que está localizado ao lado do símbolo de chave.</li>
	<li>Salve o arquivo e permitir que o instrumento executar.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Abra o arquivo em NanoAnalyze. Clique em dados e selecionar as colunas de dados.</li>
	<li>Selecionar todos os dados, copiar e colar os dados para o Microsoft Excel.</li>
	<li>Ajustar o zero da linha de base, adicionando o valor exigido em 300 s para torná-lo zero. Aplica esta correção de toda a coluna de valores de taxa de calor.</li>
	<li>Encontrar o valor mínimo ou máximo da taxa de calor para cada injeção usando a equação: =MIN(cell:cell) ou MAX(cell:cell). Cada ponto de dados representa a atividade enzimática de pico da enzima em cada injeção.</li>
	<li>Plotar gráficos dos valores MIN ou MAX contra o tempo em que o valor ocorreu durante a titulação.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, demonstrámos...

As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases1. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho2, queijo3, cerveja4, leite sem lactose5e outros produtos alimentares importantes. Enquanto este artigo centra-se na utilização de enzimas na indústria de alimentos, existem muitos outros usos para enzimas, incluindo na síntese química e droga verde.
O utilitário de enzimas é limitado pela estabilidade da atividade enzimática, que depende de manter a estrutura tridimensional da enzima. A estrutura da enzima pode ser estabilizada por modificações como PEGylation6, imobilização em um suporte sólido7, as modificações genéticas8e formulações. Atualmente, a estabilidade da enzima é normalmente medida por Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e9ensaios de atividade enzimática de ponto de extremidade. DSC mede a temperatura na qual uma enzima se desenrola; Quanto maior a temperatura, mais estável a estrutura. No entanto, a perda de atividade ocorre frequentemente em uma temperatura mais baixa do que o necessário para desdobrar a enzima ou domínios dentro do enzima10. Portanto, DSC não é suficiente para determinar se uma modificação da enzima aumenta a estabilidade da atividade enzimática. Ensaios enzimáticos de ponto de extremidade são geralmente tempo intensivo, requerem amostras múltiplas e muitas vezes envolvem uma reação colorimétrica acoplada que não é aplicável para soluções altamente coloridas ou opacas ou suspensões.
Este trabalho demonstra um método para a medição direta da estabilidade da atividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC mede a taxa de calor liberado ou absorvido durante o curso de uma reação. Desde que quase todas as reações produzem ou absorvem calor, ITC pode ser usado para a maioria das reações catalisada por enzimas, incluindo reações que não têm uma reação de acoplamento ou ocorrem em meios opacos, como leite. ITC tem sido usado por muitas décadas para medir parâmetros de cinéticos químicos para muitos tipos de reações, mas o protocolo apresentado aqui se concentra no uso ITC para medir a taxa de pico de calor de reações catalisadas por enzimas e demonstra que a atividade da enzima é linearmente correlacionada com a taxa de pico de calor. ITC medições de taxas de pico de calor na maior parte são autônomas e exigem muito pouco tempo pessoal para configurar e analisar.

<table><tbody><tr><td>a-Lactose</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>desconhecido (muito velho)</td><td>500g</td></tr><tr><td>de Acetato de Sódio, Anidro 99% min</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>Lactase&nbsp;</td><td>Solução de</td> Ácido Hidrocolrico MP <td>Bio 100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>, 1N&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Medidor de Bancada SA48-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td></td></tr><tr><td>Micro-90 Micro-90</td><td>de 1 galão Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L (solução de limpeza)</td></tr></tbody></table>

medição de estabilidade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.

Os resultados representativos na Figura 1 e Figura 5 mostram dados de duas enzimas, lactase e a invertase. Lactase e a invertase catalisam a hidrólise de um dissacarídeo em dois monossacarídeos, endothermically e exotermicamente, respectivamente. Ambas as reações enzimáticas foram executadas em concentrações que impediam a saturação da enzima.
Os dados de lactase demonstram como ITC dados podem ser usados para estimar a estabilidade d...

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

O uso de enzimas como catalisadores nas reações pode reduzir a quantidade de energia necessária para a reação, e reduzir subprodutos tóxicos. No entanto, o uso de enzimas na indústria é limitado, pois as enzimas não são estáveis e podem ser caras. Este protocolo poderia reduzir o tempo necessário para determinar se as condições são deletérios para a atividade enzimante, ou se as modificações na enzima aumentaram sua estabilidade.A principal vantagem desta técnica é que ela requer menos horas de homem do que os ensaios tradicionais de estabilidade das enzimas. Além disso, este protocolo pode ser usado com uma ampla gama de enzimas porque pode ser usado com qualquer reação que libere ou absorva calor. Para começar, prepare 0,1 tampão de acetato de sódio molar.Meça 800 mililitros de água destilada em um béquer graduado de 1.000 mililitros. Em seguida, pese 8,2 gramas de acetato de sódio anidro, e adicione-o ao béquer. Coloque o béquer em um prato de agitação.Coloque uma haste de mexida no béquer e ligue a placa de mexida para mexê-la até dissolver completamente. Quando o acetato de sódio anidro estiver completamente dissolvido, use um medidor de pH calibrado para medir o pH da solução. Use uma pipeta para adicionar 1 ácido clorídrico molar ou hidróxido de sódio em conformidade para obter o pH desejado em 4,6.Adicione água destilada no béquer até que o volume total atinja 1.000 mililitros. Para preparar a solução enzimática, em um cilindro graduado de 15 mililitros, meça 8 mililitros do tampão de acetato de sódio molar 0,1. Em seguida, adicione a solução tampão em um tubo cônico de 15 mililitros com enzima, e agite vigorosamente até que a enzima se dissolva.Adicione mais solução tampão até que o volume total atinja 10 mililitros. Armazene a solução enzimápica a 4 graus Celsius até o uso. Para preparar a solução do substrato, pese o substrato e coloque-o em um copo de vidro de 100 mililitros.Use um cilindro graduado para medir 20 mililitros da solução tampão e, em seguida, adicione-o ao béquer de vidro. Coloque o béquer em uma placa de mexida e coloque uma haste de agitação magnética no béquer. Ligue o fogo e ajuste a velocidade de agitação em conformidade.Deixe a agitação continuar até que o substrato tenha dissolvido. Despeje a solução de substrato em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione o tampão de acetato de sódio previamente preparado, até que o volume total seja de 45 mililitros. Agite o tubo para misturar.Armazene a solução do substrato à temperatura ambiente até usar. No computador, abra ITC Run e clique na configuração. Clique na taxa de agitação e defina para 350 rpm.Verifique se o tamanho da seringa está em 50 microliters. Defina a temperatura para 55 graus Celsius e pressione a atualização. Aguarde pelo menos uma hora antes de prosseguir, para dar tempo suficiente para o instrumento ITC aquecer ou esfriar conforme necessário.Antes de carregar a enzima, certifique-se de que a célula de referência esteja carregada com 350 microliters de água destilada. Para limpar a célula amostral, encha a seringa de carregamento com 500 microliters de 2% de solução de limpeza. Insira cuidadosamente a agulha na célula da amostra, encha a célula e remova lentamente o líquido usando a mesma seringa.Descarte o líquido em um béquer. Repita esta etapa duas vezes com 2% de solução de limpeza, três vezes com 70% de etanol, e depois lave dez vezes com água destilada. Depois que a célula amostral for limpa, encha a seringa de carregamento com 450 microliters de solução enzimática.Insira cuidadosamente a agulha até a parte inferior da célula amostral, e pressione lentamente o êmbolo até a linha de 100 microliter para evitar a formação de bolhas de ar. Em seguida, lave a seringa de 50 microliter com água destilada três vezes colocando a ponta da agulha na água para lentamente levar a água para dentro da seringa, em seguida, distribuindo a água em um recipiente de lixo. Enxágüe com a solução do substrato três vezes para remover água residual.Depois disso, encha a seringa de titulação com solução de substrato, desenhando a solução até que a seringa esteja cheia sem bolhas de ar. Com a seringa ainda na solução do substrato, remova o êmbolo e permita que aproximadamente 2 microliters de ar entrem na parte superior da seringa e reinseram o êmbolo. Retire a alça do burete do ITC, coloque a seringa dentro da alça do burete e parafuso até ficar apertado.Limpe a ponta da seringa de titulação com um tecido sem fiapos e, em seguida, coloque cuidadosamente a alça do burete no instrumento ITC e bloqueie-a no lugar. Para a configuração do experimento, selecione a titulação incremental. Clique em inserir para configurar as injeções.Ajuste o intervalo de injeção para 5.400 segundos, o volume de injeção para 4 microliters e o número de injeções para quatro. Pressione OK para confirmar as configurações. Na caixa de equilíbrio, selecione o equilíbrio automático e os grandes calores esperados.Defina a linha de base inicial para 300 segundos. Para iniciar a execução, clique no símbolo iniciar ao lado da taxa de agitação e clique em iniciar, que está localizado ao lado do símbolo da chave. Salve o arquivo e permita que o instrumento seja executado.Para analisar os dados, abra o arquivo em Nano Analyze. Clique em dados e selecione colunas de dados. Selecione todos os dados, copie e cole os dados no Microsoft Excel.Ajuste 0 linha de base adicionando o valor necessário em 300 segundos para torná-lo 0. Aplique esta correção em toda a coluna de valores da taxa de calor. Em seguida, gráficos de gráficos do valor mínimo ou máximo em relação ao momento em que o valor ocorreu durante a titulação.Neste protocolo, os traços de dados itc de atividade lactase são mostrados com quatro injeções sequenciais de lactose em uma solução de lactase em pH 4.6 tampão a 55 graus Celsius, 45 graus Celsius, 35 graus Celsius e 25 graus Celsius. Um controle sem enzimas foi realizado a 55 graus Celsius para o calor da mistura. Para cada injeção de enzima, há um calor extermático inicial de mistura e, posteriormente, a hidrólise endotérmica catatada de lactase da lactose ocorre até que a reação seja concluída, e a taxa de calor retorne à linha de base.O pico endotérmico mínimo após cada injeção, é um pouco menor do que a injeção anterior devido à diminuição da atividade enzimática. Como esperado, a estabilidade da enzima para cada injeção diminui com o aumento da temperatura. O experimento de controle mostra que a atividade de lactase a 25 graus Celsius teve uma redução de 8% na atividade enzimática, devido à diluição após quatro injeções.Considerando que a quarta injeção mostra uma redução de 73% no ensaio, a perda real da atividade enzimápica foi, portanto, de 65%. Assim, a diluição da lactase resultante de cada injeção, teve um efeito relativamente pequeno de 11% na atividade enzimática. É importante que o buffer usado para fazer as soluções enzimáculas e substratos sejam correspondidos o mais de perto possível.Incompatibilidade de pH ou concentração pode resultar em um calor maior de mistura que pode mascarar o calor da reação. Você pode aplicar este protocolo para estudar enzimas e determinar sua estabilidade medindo a taxa de calor liberada ou absorvida durante o curso de uma reação.

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In planta, a medição dos fluxos de nutrientes e tóxicos é essencial para o estudo da nutrição e toxicidade das plantas. Aqui, abordamos protocolos de radiotraçadores para determinação de influxo e efluxo em raízes de plantas intactas, usando fluxos de potássio (K+) e amônia/amônio (NH3/NH4+) como exemplos. Vantagens e limitações de tais técnicas são discutidas.

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Aprenda a medir a estabilidade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica para bioquímica. Este método avalia diretamente a atividade catalítica sob diferentes condições, reduzindo tempo de análise em relação aos ensaios tradicionais.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

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