Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

O chá é uma das bebidas mais populares em todo o mundo. Pesticidas às vezes são usados para proteger plantas de chá de pragas. Alguns pesticidas sistêmicos podem ser feitos para isso por enzimas em árvore de chá.

E então integrado através de oxidação, hidrólise ou reações de redução. Culturas de suspensão de células vegetais podem ser usadas como um, facilmente para estudar o comportamento do metabolismo vegetal de pesticidas. Este método tem várias vantagens.

Em primeiro lugar, pode ser operado em condições de microrganismos livres, evitando assim a interferência da degradação dos pesticidas causada pelos micróbios. Em segundo lugar, pode fornecer material constante para nós a qualquer momento. Finalmente, também pode ser usado facilmente para comparar teorias do comportamento de pesticidas em um único experimento.

Neste estudo, estabelecemos culturas de suspensão de células de chá a partir de cores variáveis de folhas de chá. O status ideal das culturas das suspensões celulares foi então usado para comparar o comportamento de dissipação de seis pesticidas. Este experimento será conduzido por Jiao Weiting e Ge Guoqin.

Esta é a nossa planta estéril de chá que funciona como fonte de explante. Corte ao longo da asa média de uma folha estéril usando uma tesoura. E então, subdividir cada metade em pequenos pedaços de cerca de 0,3 vezes 0,3 centímetros em uma placa de Petri.

Coloque as explantas estéreis no meio visual ms contendo 2, 4D e KT. Seis explantas podem ser colocadas em um frasco de 300 mililitros. Cultura a folha explanta a uma temperatura constante de 25 graus Celsius no escuro. Após 28 dias, selecione a primeira geração de calo induzido e depois transfira para frasco fresco.

Adquira o calo solto e variável após três a quatro subculturas. Corte os grandes, calos variáveis e soltos do meio sólido em pequenos pedaços usando uma lâmina cirúrgica estéril em condições estéreis. Somos cerca de três gramas dos pequenos pedaços de um calo.

Coloque o calo em B5 contendo 2, 4-D e o KT. Cultume a suspensão da célula líquida a uma temperatura constante na incubadora de agitação no escuro. Depois de sete a dez dias de cultivo, remova o frasco de cultura, e deixe-os de pé por alguns minutos. Tome o supernante como sedimento aqui forçará a cultura a um meio fresco.

Remova os calos grandes precipitados. Obtenha a cultura final de suspensão celular bem cuidada após quatro a três ciclos de subcultura de 28 dias cada. Mantenha uma amostra de células vivas a cem graus celsius por dez minutos como a célula de controle antes da coloração de viabilidade.

Centrifugar toda a cultura de suspensão celular por oito minutos a 6.000 G.Remova o supernasce antes de suspender as células em 5 mililitros de tampão PBS e agite-o por um minuto à mão. Adicione 2,5 mililitros da solução TTC e aperte à mão novamente. Incubar a mistura por uma hora em uma incubadora em pé a 13 graus Celsius.

Adicione uma alíquota de 400 microliters em vista para esterilizar a solução de estoque de todos os neonicotinóides Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid e Imideproxase. Tudo para a primeira fase orgânica. Dimetonato e omethoato nas culturas de suspensão celular, respectivamente.

Amostras de cultura de suspensões celulares com inseticidas em temperatura constante, e aceleração da incubadora. Pegue as amostras em dias diferentes. Para testar a amostra contendo um neonicotinóide, remova uma alíquota de 1 mililitro da cultura celular homogênea.

Coloque-o em um tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro e centrifuá-lo a 4.000 G por dois minutos. Passe o supernante através de uma membrana de filtro de 0,22 micrômetros antes da análise por HPLC-UV e UPLC QTOF. Para testar a amostra, continue na primeira fase orgânica.

Remova uma alíquota de 500 microliter da cultura celular e coloque em um tubo de centrífuga de 35 mililitros ou tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro. Adicione 0,1 gramas de cloreto de sódio e cinco mililitros extraem solvente no tubo de centrífuga de 35 mililitros das 500 amostras de microliter. Vórtice a mistura por um minuto.

E então deixe-os descansar por 10 minutos. Pegue 2,5 mililitros de supernascentes em um tubo de vidro de 10 mililitros e evapore até a quase secura usando um evaporador de nitrogênio a 14 graus Celsius. Dissolva o resíduo com um mililitro de acetona.

Vórtice por um minuto, passe-o através de uma membrana de filtro de 0,22 micrômetros antes da análise por GC-FPD. Coloque cinco plantas em quatro potes de plástico de quatro litros por quinze dias. Adicione zero micrograma por mililitro ou 100 microgramas por mililitro de Thiamethoxam ou dimetoaxe em potes plásticos, respectivamente.

Prepare a amostra intacta da planta de acordo com o método anterior, exceto para pré-imersão e, em seguida, analise pela espectrometria de massa orbitrap. Use um HPLCUV para detectar o conteúdo e os produtos metabólicos do Tiatoxam e Acetimoprid em comprimentos de onda de 254 nanômetros, e de Imidacloprid e Imideproxase a 270 nanômetros. Detecte o conteúdo de dimetoato e omethoato por GC-FPD usando uma coluna tubular.

Detecte os metabólitos de inseticidas na cultura celular usando o UPRC QTOF com uma coluna Carbono-18. Detecte os metabólitos de inseticidas no extrato de planta de teste usando espectrometria de massa UPLC Orbitrap. O calo de uma planta estéril tem menor contaminação, mas maior indutividade que a do calo das folhas de chá colhidas.

O calo derivado de folhas estéreis sempre foi amarelado brilhante, enquanto o calo derivado de folhas colhidas era branco com manchas marrons. Quando a concentração de KT era de 0,1 miligrama por litro, o calo era amarelado de cor e solto em textura. A taxa de crescimento do calo foi a mais alta, até 61,5% quando a concentração de 2, 4-D foi de um miligrama por litro com a concentração de KT foi de 0,5 miligramas por litro.

Os dados de crescimento do calo foram os melhores e a taxa de crescimento do calo foi a mais alta chegou a 46,9% Portanto, a melhor combinação de planta homent foi de um miligrama por litro de 2, 4D e 0,1 miligrama por litro de KT para o crescimento do chá calo. O calo cobriu completamente as folhas pela quarta subcultura, e quando o ciclo de subcultura foi de 28 dias. O calo tinha crescido vigorosamente com cor amarelada e textura solta e sem browning.

Após comparar os dados brutos do calo e a cor da suspensão celular, o meio líquido B5 foi mais adequado para a cultura de suspensão celular. O valor de OD da cultura de suspensão celular foi usado para representar a quantidade de crescimento celular. Durante os 75 dias de cultivo, a razão de 15 gramas por 40 mililitros teve um valor de OD significativamente maior do que o das outras duas proporções.

A viabilidade celular dentro da cultura de suspensão da célula de chá foi testada pela coloração TTC. O composto TTC incolor pode ser convertido em formadin vermelho por desidrogenase em mitocôndrias de células vivas, mas a cor não pode ser alterada em células mortas. E este é todo o processo de estabelecer uma cultura de suspensão de células de chá.

Este é o primeiro estudo comparativo do metabolismo de diferentes pesticidas no chá usando uma técnica de cultura de suspensão celular. Vários metabólitos de pesticidas foram identificados, e alguns deles foram investigados em plantas de chá mantidas. Este novo método poderia servir como modelo para estudos metabólicos de pesticidas em chá ou outras plantas.