Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

A possibilidade de gerar diferentes subtipos de neurônios motores é particularmente relevante para a modelagem de doenças modernas do neurônio motor, como a esclerose lateral amiotrófica. Este método permite a aquisição de populações celulares altamente rígidas para neurônios motores com uma identidade espinhal ou craniana em um curto espaço de tempo e sem a etapa de purificação. A geração de neurônios motores humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSC sob condição de cultura simplificada pode facilitar o rastreamento de medicamentos para doenças de neurônios motores.

A expressão indutível do fator de transcrição de programação pode ser usada para gerar outros tipos de células, como neurônio, músculo esquelético e células gliais a partir de um repositório iPSC. Para a geração de linha NIL e NIP iPSC, enxágue a cultura humana iPSC com PBS livre de cálcio e magnésio antes de tratar as células com reagente de dissociação celular por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células começarem a se desprender do recipiente de cultura, use uma pipeta P1000 para dissociar manualmente as células três a quatro vezes.

Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e traga o volume final até 10 mililitros com PBS fresco sem cálcio e magnésio para contar. Colete uma vez 10 a sexta células por centrifugação e resuspenque a pelota em 100 microliters de tampão R do kit de eletroporação. Adicione 4,5 microgramas de DNA de plasma vetorial transposável e 0,5 microgramas do DNA de plasma transposase piggyBac para transfecção.

Transfeto com o sistema de eletroporação celular de acordo com as instruções do fabricante com os parâmetros indicados. Em seguida, semeou as células em meio iPSC humano suplementado com 10 micromolars inibidor rock Y-27632 em um prato revestido de matriz de seis milímetros. Dois dias após a transfecção, adicione 5 microgramas por mililitro de blasticidina ao meio cultural mantendo as células no antibiótico por pelo menos sete a dez dias para contrasselecionar as células que não integraram os transgenes.

Ao final da incubação, mantenha as células transfectadas como uma população mista composta de células com diferentes números de transgenes e diferentes locais de integração ou isole clones únicos. Prepare um prato adicional para permitir que a expressão efetiva dos transgênicos sobre um micrograma por mililitro de indução de doxiciclina seja avaliada por RT-PCR com primers específicos transgene para neurogenina-2 como descrito anteriormente. Nesta fase, os estoques das novas linhas NIL e NIP iPSC também devem ser congelados em meio de congelamento para iPSCs humanos.

Para diferenciação de neurônios motores, dissociar as culturas celulares transfectadas com reagente de dissociação como demonstrado para permitir que as células sejam coletadas em um tubo de 15 mililitros contendo cinco volumes de meio DMEM/F12. Após a centrifugação, resuspenque as células em meio iPSC humano suplementado com inibidor de ROCK micromolar para contagem. Semear as células em pratos revestidos de matriz a uma densidade quadrada de 6,25 vezes 10 as quatro células por centímetro.

Para os próximos dois dias, substitua os supernacantes por meio de diferenciação fresco complementado com doxiciclina. No segundo dia, mude o meio B27 médio para neurobásal suplementado com inibidor de gamma secretase, inibidor do receptor do fator de crescimento endotelial vascular e doxicyline. No quinto dia, dissociar as células como demonstrado e resuspensar as células isoladas em quatro mililitros do meio DMEM/F12 para contagem.

A pipetação é importante para uma dissociação completa das células. Congele uma alíquota dos progenitores do neurônio motor no meio de congelamento celular de acordo com as instruções do fabricante e colete o resto das células por centrifugação. Resuspend a pelota em meio neuronal suplementado com 10 inibidores de ROCK micromolar.

Sementes as células em microslídeo revestido de laminina poliornitina suportam com deslizamentos de tampa de polímero em uma vez 10 para as quintas células por cento de densidade quadrada. No sexto dia, substitua cuidadosamente o meio por meio neuronal fresco sem inibidor para cultura até a análise a jusante sem separar as células da superfície de suporte. Uma expressão uniforme do marcador de pluripotência fator de transcrição de ligação octamer quatro ou OTC4 pode ser observada na diferenciação de culturas celulares no dia zero na ausência de marcador pan neuronal de classe três beta-tubulin TUJ1 positividade.

No terceiro dia, é evidente uma forte diminuição no número de células OCT4 positivas. Isso é espelhado pela expressão de TUJ1 em um subconjunto de iPSCs diferenciadores. No quinto dia, não é observada expressão de OCT4 na população que mostra uma expressão consistente de TUJ1 e uma morfologia neuronal adquirida.

A análise de imunossuagem de sete dias após a replação das células progenitoras do neurônio motor revela uma expressão uniforme de TUJ1 e do marcador de neurônio motor maduro acetiltransferase. Os neurônios derivados do iPSC NIL exibem com sucesso correntes de sódio dependentes da tensão e correntes de potássio dependentes da tensão. 80% dos neurônios motores derivados do iPSC NIL fixados na modalidade de grampo atual são capazes de acionar trens de espeto quando injetados com um pulso atual de mais 60 picoamps ou mais.

A corrente mínima necessária para provocar disparos repetitivos em mais de 50% das células registradas é mais 40 picoamps com um limiar de pico de aproximadamente menos 38 milivolts e uma frequência média de disparo em mais 40 picoamps de cerca de oito hertz, sugerindo que os neurônios motores espinhais derivados do iPSC NIL exibem propriedades funcionais típicas de neurônios maduros. Neurônios motores espinhal e craniana podem ser derivados de iPSCs controlados ou iPSCs portadores de mutações patológicas e que essas células podem ser usadas como modelos de tese ou para triagem de medicamentos. Nosso método pode ser usado para ajudar a entender por que diferentes unidades de neurônios motores são afetadas diferencialmente pela ELA.