In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

Realizamos a primeira terapia, baseada em um inibidor de microRNA em um modelo de câncer de tireoide. Essas terapias em desenvolvimento mostram-se promissoras para o tratamento desta doença. Esse tipo de modelo ortotópico, utilizando uma rota sistêmica de entrega de tratamento, facilita a validação de um novo sistema de microRNA.

Embora usemos um modelo ortotópico para implantar células cancerígenas da tireoide humana em tireoides de camundongos, esses modelos podem ser todos sistêmicos para outros tipos de câncer. Demonstrando o procedimento com Julia Ramirez-Moya e Adrian Acuna será Raquel Arocha Riesco. Ela é técnica do nosso instituto.

Depois de estabelecer uma linha de células cancerígenas humanas CAL-62 incompletas, suspenda uma alíquota de 1 vezes 10 para a 6ª célula em 50 microliters de PBS a 4 graus celsius, e misture as células com um volume igual de matriz de membrana de porão. Carregue as células em uma seringa de 1 mililitro, equipada com uma agulha de meia polegada de 27 gage, e injete subcutâneamente 100 microliters da amostra no flanco esquerdo de um rato nu de válvula imunodeficente C de 6 semanas. Duas semanas após a injeção, adicione a solução de antagomiR ou tampão de tratamento controlado a 160 microliters de temperatura ambiente in vivo entregador em um tubo de 1 ponto 5 mililitro.

E imediatamente vórtice a solução por 10 segundos para garantir a complexidade da mistura. Incubar a solução de tratamento por 30 minutos a 50 graus celsius, seguida de uma breve centrifugação em uma micro centrífuga. Em seguida, diluir o complexo de tratamento sedimentado seis vezes com PBS fresco e mistura completa.

E injetar todo o volume de 200 microliteres do tratamento diretamente no tumor. Injete 50 microlitres de uma solução de substrato D-Luciferin de 40 miligramas por litro subcutânea 2 vezes por semana, em cada animal experimental. Certificando-se de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo após a anestesia isoflurane.

Coloque o animal na câmara de um sistema de imagem de bioluminescência in vivo, e imagem o sinal de bioluminescência com o software de imagem in vivo de acordo com os protocolos padrão. Então analise o crescimento do tumor. Comparando ambos os tratamentos e determinando as diferenças de significância e crescimento utilizando um teste T.

Para a inoculação de células tumorais ortotópicas da tireoide suspender uma alíquota de células CAL-62 em 5 microliters de PBS, e injetar subcutâneamente 100 microliters de analgésicos e 100 microliters de antibiótico em um rato nu válvula C de 7 semanas de idade. Após confirmar a falta de resposta ao dedo do dedo, coloque o animal sob um microscópio dissecando e desinfete o pescoço do animal com iodopovidona. Em seguida, faça uma incisão de aproximadamente 2 centímetros na pele, e desloque as glândulas salivares para expor o pescoço.

Use fórceps de dissecção, e/ou tesoura, para dissecar os músculos da correia para expor a glândula traqueia e tireoide, e use uma seringa de 10 microliteres, para injetar o volume de 5 microliteres de células tumorais no lobule da tireoide direita, localizado ao lado da cartilagem cricóida. Quando todas as células forem entregues, reposicione as glândulas salivares e use suturas trançadas, revestidas e não absorvíveis para fechar a incisão. Em seguida, aplique iodopovidone na área da ferida e coloque o rato em uma manta termica com monitoramento até a recuperação completa.

duas a três semanas após a injeção de células intratireóides, prepare a solução de tratamento como demonstrado, e entregue a solução por via intravenosa por injeção retro-orbital do seio venoso do animal portador de tumor da tireoide anesthetizado. Neste experimento representativo, o crescimento de tumores injetados intratumorally sem inibidor de microRNA 146B, foi significativamente suprimido em relação ao controle negativo. Níveis de expressão intratumoral de alguns marcadores de proliferação também foram observados em níveis baixos, em tumores tratados com antagomir, em comparação com tumores de controle.

Além disso, a recuperação dos alvos do micro-RNA pode ser estudada através da análise do RNA extraído do tumor, ou proteína. Revelando coletivamente que a inibição in vivo de micro RNAs individuais é eficaz e pode ser explorada terapeuticamente para tratamentos de câncer de tireoide. A análise histológica dos tumores da tireoide estabelecidos em camundongos, como demonstrado, permite a coloração para as células epiteliais ao redor do tumor, revelando a arquitetura folículo da tireoide do tecido tumoral.

Notavelmente, a injeção intravenosa do inibidor de microRNA 146B em camundongos, com um tumor estabelecido, resulta em uma diminuição significativa no volume do tumor em comparação com os animais tratados com controle. Além disso, a expressão do recém-descrito microRNA 146B alvo DICER1 no tumor primário, aumenta após o tratamento anti-micro-RNA 146B, ressaltando ainda mais o potencial da inibição da expressão indogenous micro-RNA e, portanto, a restauração de seus genes-alvo como uma terapia no câncer de tireoide. Essa técnica, e os resultados subsequentes da lipina, abrem a possibilidade de explorar novas terapias baseadas em RNAs não curantes para o tratamento do câncer de tireoide.