Usando a mancha da imunofluorescência da cara do en para observar diretamente pilhas endothelial vasculares

Este protocolo ajuda as pessoas a analisar a morfologia celular endotelial, e a expressão de moléculas em regiões, sob diferentes estresses de tesoura de fluidos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma avaliação direta das células endoteliais vasculares sob diferentes estresses de tesoura de fluidos. Ao realizar este procedimento, os principais passos são usar paraformaldeído recém-preparado e realizar uma boa perfusão.

Inicie este procedimento com a anestesia de um mouse C57BL/6 de 12 semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Confirme a anestesia adequada apertando suavemente a cauda. Tape as patas do mouse em uma pilha de toalhas de papel, com fita adesiva.

Segure a pele do rato com fórceps, e corte a pele com uma tesoura do abdômen até o topo do tórax. Abra a cavidade abdominal, abaixo da caixa torácica, com uma tesoura afiada. Levante o esterno com fórceps e corte o diafragma.

Em seguida, corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica. Corte a veia cava logo acima do fígado com uma tesoura. Pressão perprendo a árvore arterial por cinco minutos, com soro fisiológico normal pré-refrigerado contendo 40 unidades por heparina mililitro, através do ventrículo esquerdo, até que os pulmões e fígado fiquem pálidos.

Em seguida, perfuse com pré-refrigerado 4% paraformaldeído em PBS por quatro minutos. Remova todos os músculos, órgãos e gordura, até que a aorta seja exposta. Coloque o mouse sob um microscópio de dissecação.

Use fórceps delicados e um par de tesouras delicadas para expor a aorta claramente sob um microscópio dissecando, e remover o tecido conjuntivo ao longo da aorta, o mais limpo possível. Disseque a aorta torácica do coração até o tronco celíaco com um par de tesouras delicadas. Coloque a aorta em um prato de cultura celular de seis centímetros, com PBS.

Corte a aorta longitudinalmente, primeiro ao longo da curva menor, e depois use os microscissores para cortar os três ramos do arco aórtico, incluindo o innominado, deixado carótida comum, e a artéria subclávia esquerda ao longo da curva maior até que o segmento reto seja atendido. Permeabilize a aorta com 1%de polioximetil de fenil éter, em PBS por 10 minutos. Em seguida, bloqueie a aorta com soro de cabra 10% normal em soro fisiológico tris-tamponado contendo 2,5% de polisorbato 20 por uma hora à temperatura ambiente, em uma placa de cultura de 12 poços.

Em seguida, incubar a aorta no tampão de bloqueio contendo cinco gramas por mililitro de coelho anti-VCAM1, e cinco gramas por mililitro de rato anti-VE-Cadherin, durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de enxaguar a amostra três vezes com solução de lavagem, aplique os anticorpos secundários conjugados de fluorescência durante uma hora em temperatura ambiente, mantendo-se em um lugar escuro. Enxágüe mais três vezes na solução de lavagem.

Contra-mantenha a aorta com DAPI por 10 minutos, mantendo-se em um lugar escuro. Em seguida, enxágue a aorta manchada três vezes na solução de lavagem. Coloque a aorta em um deslizamento de cobertura com a superfície lumenal para baixo, e mova-a lentamente para a solução de montagem antifade que foi anteriormente descartada no deslizamento da tampa.

Estique suavemente a aorta para manter o espécime plano. Inverta o deslizamento da tampa e coloque-o no escorregador de vidro. Tome cuidado para evitar bolhas de ar entre o espécime e o vidro.

Examine a aorta com um microscópio confocal de varredura a laser. Analise as intensidades de cores de diferentes canais da região desejada nas imagens presenciais, com o software Image-Pro Plus. Imagens de coloração de imunofluorescência en de células endoteliais vasculares da aorta do rato são mostradas.

A imunofluorescência facial da proteína de adesão celular vascular uma, e a expressão com VE-Cadherin como um marcador endotelial, são mostradas sob padrões de fluxo variados de diferentes regiões da aorta do rato. O DAPI também foi contra-identificado para mostrar aos núcleos celulares uma melhor visualização. Ao olhar através das pilhas Z sob o microscópio, as células musculares endoteliais e lisas podem ser facilmente distinguidas por sua morfologia de núcleos celulares.

Os núcleos de células endoteliais têm forma oval, e maiores que os núcleos de células musculares suaves em forma de fuso. A expressão do VCAM-1 foi mais abundante em regiões sob fluxo perturbado, em menor curvatura do arco da aorta, em comparação com regiões sob fluxo constante, em maior curvatura do arco da aorta, e na aorta torácica. Aqui áreas de menor curvatura de uma aorta de rato são indicadas como áreas de fluxo D, e a maior curvatura e torácica.

Com a modificação correta, essa técnica também pode ser aplicada à análise da permeabilidade vascular, e a posição das macromoléculas na intima celular endotelial.