Name: Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda fototerapia com luz vermelha a 635 nm para regular biofilmes de Candida albicans. Este protocolo avalia como a fototerapia interfere no crescimento do biofilme durante 48 horas, oferecendo uma abordagem promissora para tratamentos clínicos.

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Agradecemos o Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal e Dr. Iriana Zanin para o desenvolvimento deste estudo. Reconhecemos também o Dr. Alexander m. Johnson (UCSF) para doar a estirpe analisada neste estudo.

1. preparação de meios de cultura
<ol><li>Prepare ágar de sabouraud dextrose (ASD). Suspenda 65g de SDA suplementado com cloranfenicol (50 mg/L) em 1.000 mL de água destilada. Ferva até para dissolver o meio completamente. Esterilizar em autoclave a 15 PSI (121° C) por 30 min. esfriar a 45-50 ° C. Misture bem e despeje a 20 mL de SDA em placas de Petri estéril (tamanho: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Prepare o fermento nitrogênio base (YNB) suplementado com glicose de 100 mM, misturando 6,7 g de YNB e 18 g de dextrose a 1.000 mL de água ultrapura. Misture utilizando um agitador e esterilizar o meio usando um sistema de vácuo filtro de 0,22 µm.</li>
	<li>Prepare RPMI misturando 10,4 g de RPMI 1640 e 34,32 g de 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS) a 1.000 mL de água ultrapura. Misture em um agitador sem calor e ajustar o pH a 7, adicionando 1 N NaOH (adicionar 2 g de NaOH a 50 mL de água ultrapura). Esterilize o meio usando um sistema de vácuo filtro de 0,22 µm.</li>
</ol>2. pré-inóculo e inóculo
<ol><li>Retire o microorganismo SN425 de c. albicans do −80 ° C freezer e deixe descongelar à temperatura ambiente. Semear 10 µ l da cultura estoque em placas de Petri contendo SDA suplementado com cloranfenicol (50 mg/L). Incube as placas de Petri por via aeróbia a 37 ° C, por 48 h.</li>
	<li>Após 48 h de incubação, adicione 10 colônias de c. albicans a 10 mL de nitrogênio levedura base (YNB) meio suplementado com glicose de 100 mM e incubar por via aeróbia, a 37 ° C, durante 16 h para o pre inóculo.</li>
	<li>Após a incubação para 16 h, preparar o inoculo diluindo os fermentos em fresco YNB suplementado com glicose de 100 milímetros em um 01:10 proporção (1 mL da cultura starter diluída em 9 mL de YNB). Medir a densidade óptica inicial (OD) a 540 nm.</li>
	<li>Incubar o inoculo aeróbia em 37 ° C, durante 8 h até as estirpes de alcançar a fase de crescimento log de mid e medem o OD final a 540 nm. Subtrai o OD final partir do OD inicial para verificar se o OD do inoculo estão em fase de crescimento do log de mid (8h, baseado sobre as curvas de crescimento na Figura 1).</li>
	<li>Para alcançar um inóculo com 107 células mL-1, centrifugar o inóculo por 5 min a 5.500 x g, desprezar o sobrenadante e concentrar o inóculo para metade do volume dos tubos.</li>
</ol>3. fototerapia e formação de biofilmes
<ol><li>Adicione 1 mL do inóculo para os poços de uma placa de poliestireno 24-bem. Incube por via aeróbia a 37 ° C por 90 min permitir a aderência de célula para o fundo dos poços.</li>
	<li>Use um vermelho não coerente de luz (ver Tabela de materiais) como a fonte de luz com comprimento de onda de 635 nm ± 10 e uma potência de saída fixa de 1.460 mW cm− 2.</li>
	<li>Use um medidor de potência para medir a densidade de potência da luz. A exposição radiante aplicada é 87,6 J cm-2, equivalente a cerca de 1 minuto de exposição. Use a fórmula de densidade de energia (J/cm2) = densidade de potência (W/cm2) x tempo de irradiação (s). Aplica a uma distância de 5 mm entre a fonte luminosa e o biofilme para evitar o aquecimento da amostra.</li>
	<li>Tratar os biofilmes de controle positivo com clorexidina 0,12% por 1 min e biofilmes de controlo negativo com 0,89% NaCl por 1 min.</li>
	<li>Depois dos tratamentos, lave todos os biofilmes duas vezes com solução de NaCl de 0,89%.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de RPMI 1640 tamponado com 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS) com pH de 7 para os biofilmes e incubar as placas a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Pela manhã, aplicar os mesmos tratamentos como etapas 3.2 a 3.6, lavar os biofilmes duas vezes com 0,89% NaCl, adicionar novo RPMI tamponado com MOPS (1 mL, pH 7) aos poços e incubar por via aeróbia, a 37 ° C.</li>
	<li>No mesmo dia, depois de 6 h, expor os biofilmes de luz vermelha. Tratar os biofilmes de controle positivo com clorexidina 0,12% por 1 min e biofilmes de controlo negativo com 0,89% NaCl por 1 min. Depois dos tratamentos, lave os biofilmes duas vezes com solução de NaCl de 0,89%.</li>
	<li>Repita as etapas de 3.2-3.8 até alcançar 48 h de desenvolvimento de biofilme. Nota: Basicamente, um tratamento acontecerá pela manhã e o outro vai acontecer à tarde, no mesmo dia (6h separado).</li>
</ol>4. processamento
<ol><li>Adicionar 1 mL de estéril 0,89% NaCl ao poço para remover o biofilme riscando-a partir do bem usando uma ponta da pipeta. Adicione o biofilme removido a um tubo estéril.</li>
	<li>Adicionar outro 1 mL de estéril 0,89% NaCl para o poço. Riscá-lo novamente e adicione a suspensão para o mesmo tubo para um volume total de 2 mL.</li>
	<li>Unidades formadoras de Colônia (UFC)<ol>
<li>Vigorosamente o vórtice a suspensão de biofilme por 1 min. Da suspensão do biofilme, use uma alíquota de 0,1 mL para a diluição de série.</li>
		<li>Dilua a suspensão de biofilme de 10-1 a 10-4 em solução de NaCl de 0,89%.</li>
		<li>Sementes de 50 μL de cada diluição para placas SDA e incubar as placas a 37 ° C por 48 h.</li>
		<li>Contar as colônias e aplicar a fórmula UFC/mL = número de colônias x 10n / q (n = diluição; q = volume semeado).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peso seco<ol>
<li>Tubos de microcentrifuga de pesar e rótulo.</li>
		<li>Da suspensão do biofilme, use 0,1 mL para determinação do peso seco (biomassa).</li>
		<li>Adicionar 1 mL de etanol absoluto a uma alíquota de 0,1 mL dos biofilmes e armazená-lo a-20 ° C durante 18 h. Após 18 h, centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante, coloque os tubos no exsicador até secar as amostras durante uma semana e pese os tubos microcentrifuga novamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polissacarídeos solúveis em água (WSPs) e polissacarídeos álcali-solúvel (ASPs)
	<ol>
<li>Da suspensão do biofilme, vigorosamente vórtice o restante do volume (1,8 mL) para 1 min e centrifugar 5.500 × g por 10 min a 4 ° C. Armazenar o sobrenadante em um novo tubo e lavar o precipitado duas vezes com as células, que contêm os componentes insolúveis da matriz extracelular com água ultrapura esterilizada (5.500 × g, 10 min a 4 ° C).</li>
		<li>Ressuspender o teor de insolúvel em 1,8 mL de água ultrapura esterilizada.</li>
		<li>Polissacarídeos solúveis em água (WSPs) Nota: Realize este experimento em uma coifa.<ol>
<li>Partir do sobrenadante armazenado, reserve 1 mL para a quantificação de polissacarídeos solúveis em água (WSPs).</li>
			<li>Homogeneizar o sobrenadante armazenado por 1 min. Em seguida, transferir para tubos estéreis e adicione 2,5 volumes de etanol a 95%. Armazene os tubos para 18 h a-20 ° C para WSPs precipitação.</li>
			<li>Após 18 h, centrifugar os tubos a 9.500 x g por 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes.</li>
			<li>Lavar as amostras três vezes com 75% de etanol e secar as pelotas. Ressuspender o sedimento com 1 mL de água ultrapura esterilizada e quantificar o WSP usando o método de ácido sulfúrico de fenol.</li>
			<li>Use 0,1% de glicose (0,01 g de glicose a 10 mL de água ultrapura) para a curva padrão (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 e 25 µ l de glicose por tubo).</li>
			<li>Adicionar 200 µ l de fenol a 5% (2,7 mL de fenol 90% a 47,3 mL de água ultrapura) para um tubo de vidro que compreende 200 µ l da amostra ou curva padrão ponto (em triplicado, por exemplo) e misture com cautela.</li>
			<li>Adicione 1 mL de ácido sulfúrico ao tubo e misture. Espere 20 min para a reação e medir as amostras usando um espectrofotômetro (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Álcali-solúvel polissacarídeos (ASPs) Nota: Realize este experimento em uma coifa.<ol>
<li>Pela quantidade de re-suspensão insolúvel, separe 1 mL para a determinação de víbora. Centrifugar as alíquotas de cada suspensão de biofilme (13.000 x g, durante 10 minutos a 4 ° C).</li>
			<li>Cautelosamente, remova o sobrenadante de cada tubo. Em seguida, coloque as amostras em um vácuo concentrador para secar as bolinhas.</li>
			<li>Pesar as bolinhas e adicionar 300 µ l de 1 N NaOH (2 g de NaOH a 50 mL de água ultrapura) por 1 mg de peso seco. Incube-os durante 2 h a 37 ° C e em seguida centrifugar a 13.000 × g por 10 min.</li>
			<li>Cautelosamente, colete os sobrenadantes com uma pipeta e transferência para tubos microcentrifuga, mantendo a pelota.</li>
			<li>Mais uma vez, adicionar um volume igual de 1 N de NaOH para os tubos que compreende as pelotas e repita as mesmas etapas acima para a extração do ASP.</li>
			<li>Após a incubação por 2 h, Centrifugar as amostras (13.000 x g durante 10 minutos), cuidadosamente coletar os sobrenadantes e adicionar os sobrenadantes coletados anteriormente.</li>
			<li>Para a extração de terceira, repita as mesmas etapas acima, mas desta vez, não incubar as amostras para 2 h antes da centrifugação.</li>
			<li>Depois, adicione três volumes de etanol a 95% para cada amostra. Então, o estoque das amostras −20 ° C por 18 h para a precipitação do ASP.</li>
			<li>Centrifugar os tubos (9.500 × g por 20 min a 4 ° C) e descartar os sobrenadantes.</li>
			<li>Cada pellet três vezes com 75% de etanol de lavar e secar ao ar (mesmos procedimentos fizeram por WSP). Ressuspender as pelotas no volume total igual da primeira extração com 1 N de NaOH.</li>
			<li>Leia as amostras para quantificação do ASP usando o fenol-ácido sulfúrico (mesmo quanto a análise WSP).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li>
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<li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth%2C+adhesion+and+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias++Do++Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li>
<li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression%3A+a+genome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos mais críticos para um cultivo bem sucedido de biofilmes de c. albicans são: 1) para fazer o pre- inóculo de e o inóculo em meio YNB complementado com glicose de 100 mM; 2) para esperar 90 min para a fase de adesão e cuidadosamente lavar duas vezes os poços com 0,89% NaCl para remover as células não-aderido; e 3) para adicionar meio RPMI às células aderidas para iniciar a formação de biofilmes, desde RPMI estimulará o crescimento de hifas. Aneuploidies pode ocorrer quando o cultivo de c. albicans</e...

O aumento da incidência de diabetes, aplicações de terapia imunossupressora, infecção pelo HIV, a epidemia de AIDS, procedimentos clínicos invasivos e consumo antibiótico de largo espectro nos últimos anos tem aumentado a incidência de Candida albicans relacionados com doenças1,2. Infecções de c. albicans são comumente relacionadas ao desenvolvimento de biofilme e podem causar manifestações clínicas, tais como candidíase, ou manifestações sistêmicas, tais como candidemia1,2. Dentre os fatores de virulência, mais notáveis do crescimento do biofilme é o estabelecimento de matriz de polissacarídeo extracelular. Formação de biofilmes coopera para aumentar a resistência a drogas antifúngicas existentes, estresse ambiental e de mecanismos imunes do hospedeiro3.
O crescimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão inicial de células planctônicas a um substrato, seguido pela propagação de células de levedura através da superfície do substrato e o crescimento das hifas. A última fase do crescimento do biofilme é a fase de maturação, no qual desenvolvimento de leveduras, como é suprimido, o desenvolvimento das hifas expande e a matriz extracelular inclui o biofilme4. C. albicans exopolissacarídeo (EPS) na matriz interage para formar o complexo5,de Medeiros-glucan6. A interação de exopolissacarídeo é fundamental para a defesa dos biofilmes contra drogas7. Daí, a redução dos EPS da matriz extracelular de c. albicans pode apoiar o desenvolvimento de novos protocolos de antibiofilm para controle da candidíase oral.
Luz regula o crescimento, desenvolvimento e comportamento de vários organismos8 e foi aplicado como um antimicrobiano da quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (Pacto). Pacto aplica-se uma luz visível de um comprimento de onda específico e uma absorção de luz fotossensibilizador9. No entanto, os fotossensibilizadores têm dificuldades em penetrar o biofilme, causando menor eficácia10. O fracasso de agentes terapêuticos para infiltrar totalmente biofilmes é uma razão que biofilmes ocasionalmente resistem tradicional terapia antimicrobiana3,5. Para desactivar as células microbianas fechadas, antimicrobianos precisam permear através da matriz extracelular; Não obstante, o EPS caracteriza um obstáculo de difusão para tais moléculas alertando o seu nível de transporte para o biofilme ou influenciando a resposta do antimicrobiano com a própria matrix11.
Tendo em conta as desvantagens do Pacto, o uso da luz por si só emerge como uma melhoria valiosa. Dados preliminares revelaram que o tratamento com luz azul duas vezes por dia inibiu significativamente a produção de EPS-insolúvel em biofilmes de Streptococcus mutans . Pela diminuição de EPS-insolúvel, luz azul diminuiu o crescimento do biofilme. No entanto, os resultados da fototerapia usando luz vermelha em biofilmes de c. albicans são escassos. Portanto, o objetivo desta investigação foi avaliar em que fototerapia de maneira usando luz vermelha influencia o crescimento e o arranjo de biofilmes de c. albicans . Para o tratamento duas vezes por dia, adaptamos anterior protocolos9,12 para fornecer um modelo de biofilme fácil e reprodutíveis que fornece respostas sobre viabilidade, do nosso laboratório peso seco e extracelulares polissacarídeos quantidades após o tratamento de luz vermelha. O mesmo protocolo pode ser usado para testar outras terapias.

<table><tbody><tr><td>Clorexidina 20%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose) Anidro</td><td>Fisher Químico</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp;</td><td>LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, EUA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Biorreagentes Fisher&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol 5%</td><td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 tamponado com ágar dextrose 3-(N-morfolino)</td><td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud suplementado com cloranfenicol</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico&nbsp;</td><td>Base</td> de nitrogênio de levedura <td>Fisher Chemical SA200-1</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino)ácido propanossulfônico MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de poliestireno de 24 poços&nbsp;</td><td>Falcão</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de candida albicans

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os resultados das diárias de luz vermelha tratamento sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Para aumentar o crescimento planctônico de SN425 de c. albicans , o inoculo cresceu na mídia de levedura Base de nitrogênio. Para a formação de biofilme, mídia RPMI 1640, que têm altas concentrações de aminoácidos, foram aplicadas para ajudar o crescimento do biofilme. Biofilmes de 48 h foram tratadas duas vezes por dia por um período de 1 min com um dispositivo de luz não-coerente (luz vermelha; comprimento de onda = 635 nm; densidade de energia = 87,6 J·cm-2). Como um controle positivo (PC), clorexidina 0,12% (CHX) foi aplicado e como um controle negativo (NC), 0,89% NaCl foi aplicado para os biofilmes. Formadoras de colónias (UFC), unidades de peso seco, solúveis e insolúveis exopolissacarídeo foram quantificados depois dos tratamentos. Resumidamente, o protocolo aqui apresentado é simples, Reproduzível e fornece respostas sobre viabilidade, montantes de polissacarídeo extracelular e de peso seco após o tratamento de luz vermelha.

Figura 2 exibe os resultados de Log10 UFC/mL de c. albicans após tratamentos diários com luz vermelha para luz vermelha de 1 min. reduziu significativamente o Log10 UFC/mL em comparação com o NC (p = 0,004). A Figura 3 apresenta os resultados da biomassa (mg) de biofilmes de c. albicans após tratamentos diários. Todos tratados grupos apresentaram redução da biomassa em comparação com o NC (...

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o resultado da aplicação de luz vermelha sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Um dispositivo não-coerente de luz vermelha com comprimento de onda de 635 nm e densidade de energia de 87,6 J·cm-2 foi aplicado durante todo o crescimento de biofilmes de Candida albicans por 48 h.

Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

A candida é a causa mais comum de infecção fúngica disseminada em hospedeiros imunocomprometidos. A falha dos agentes terapêuticos em se infiltrar plenamente no biofilme por causa da matriz é uma das razões pelas quais os biofilmes resistem às terapias tradicionais. Nosso protocolo avalia como a fototerapia, usando luz vermelha, interfere no crescimento e arranjo de biofilmes candida albicans.Os métodos aplicados estão bem estabelecidos, uma vez que a cepa utilizada neste estudo teve sua matriz extracelular caracterizada e o dispositivo leve foi aplicado com sucesso a outras suspensões e biofilmes de microrganismos plantônicos. A maior vantagem deste dispositivo é a redução do tempo de tratamento, o que o torna mais visível para aplicações clínicas. Ao culminar candida albicans esteja ciente de que anticorpos podem ser adquiridos.Por isso, é importante não usar colônias com mais de sete dias de idade, não iniciar placas a quatro graus Celsius, e não re-listrar células de placas existentes. Da mesma forma, uma cepa deve ser usada antes de 18 horas de crescimento noturno. Ao usar um espectrômetro pela primeira vez é importante primeiro obter a fazenda colônia em contagem de unidades, para se correlacionar com valores de densidade óptica.Portanto, os experimentos começarão a usar a fase de crescimento em fase inicial de concentração celular de 10 a sete células por mililitros. Esta concentração celular tem sido demonstrada para fornecer os biofilmes de matéria mais dependente e estável. Para começar, suspenda 65 gramas de SDA, suplementado com 50 miligramas por litro de Clororamfenicol, em 1.000 mililitros de água destilada em um béquer.Coloque o béquer em uma campainha para ferver, a fim de dissolver completamente o meio. Então transfira a mídia para uma garrafa de vidro. Coloque a tampa sobre a garrafa, mas não astrague completamente para garantir que a garrafa seja capaz de ventilar.Coloque a garrafa em uma autoclave para esterilizar a solução a 15 PSI e 121 graus Celsius por 30 minutos. Esfrie a solução para cerca de 45 graus Celsius. Use uma pipeta descartável e estéril, para misturar bem, e pipeta 20 mililitros de SDA em placas estéreis de Petri.Para preparar o meio YNB, suplementado com 100 milimonas de glicose, misture 6,7 gramas de YNB e 18 gramas de dextrose a 1.000 mililitros de água ultra pura em um béquer. Coloque uma barra de mexida no béquer e coloque o béquer em uma placa de mexida para misturar. Filtre o meio através de um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro para esterilizar.Prepare o meio RPMI misturando 10,4 gramas de RPMI-1640 e 34 gramas de MOPS, a 1.000 mililitros de água ultra pura. Misture em um agitador sem calor e ajuste o PH para sete adicionando um hidróxido de sódio normal. Esterilize o meio usando um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro.Primeiro, descongele o microrganismo Candida albicans SN 425 à temperatura ambiente. Semente 10 microliters da cultura stop em pratos petri previamente preparados contendo SDA, complementados com Clororamfenicol. Incubar as placas de Petri aerobicamente a 37 graus Celsius por 48 horas.Para o pré-inóculo use um lubrificante esterilizado para colher 10 colônias de albicanos candida dos pratos petri e colocá-los em um tubo de centrífuga contendo 10 mililitros de meio YNB, complementados com glicose. Incubar o tubo aerobicamente a 37 graus Celsius durante 16 horas. Em seguida, prepare o inóculo adicionando esta cultura inicial em meio YNB fresco, suplementado com glicose, em uma proporção de um a 10 para diluição.Use o espectótmetro para medir o OD inicial em 540 nanômetros. Incubar os inóculos aerobicamente a 37 graus Celsius por oito horas, e medir o OD final em 540 nanômetros. Subtraia o OD final do OD inicial para verificar se o OD dos inóculos está na fase de crescimento do registro médio.Para obter um inóculo com 10 a sete células por mililitro, centrífugo o inóculo por cinco minutos a 5.500 vezes G.Despeje o sobrenatante em um béquer contendo hipoclorito de sódio e adicione ynb fresco para concentrar o inóculo à metade do volume anterior. Adicione um mililitro do inóculo a cada poço de uma placa de poliestireno de 24 poços. Incubar aeróbicamente a 37 graus Celsius por 90 minutos para permitir a adesão celular ao fundo dos poços.Trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de 0,12% de clorexidina para os biofilmes de controle positivo. Para o controle negativo, trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de cloreto de sódio estéril e 0,89%. Posteriormente, lave os poços duas vezes, um minuto cada, com um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% para remover células não aderentes.Em seguida, ligue uma luz vermelha não coerente e use um medidor de energia para medir a densidade de energia da luz. Determine o tempo de exposição com base na exigência de densidade energética de 87,6 joules por centímetro quadrado. Coloque a placa sob a luz vermelha.Mantenha a distância entre a fonte de luz e o biofilme para cinco mililitros para evitar o aquecimento da amostra. Após a exposição por um minuto, adicione um mililitro do meio RPMI esterilizado a cada poço, e incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã, repita a mesma lavagem, tratamento leve, tratamentos de controle positivo e negativo e incubação por seis horas com meio RPMI.Novamente, lave os biofilmes duas vezes, exponha-os à luz vermelha e realize tratamentos de controle positivos e negativos. Aspire a solução nos poços e adicione meio RPMI. Repita a incubação, lavagem, tratamento leve e tratamentos de controle positivos e negativos, até alcançar 48 horas de desenvolvimento de biofilme.Para iniciar o processamento, descarte o meio e adicione um mililitro de cloreto de sódio estéril, 0,89% ao poço, e use uma ponta de pipeta para riscar o biofilme do poço. Transfira o biofilme removido para um tubo estéril. Adicione mais um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% ao poço.Arranhe-o novamente e adicione a suspensão ao mesmo tubo, para um volume total de 2 mililitros. Vigorosamente vórtice a suspensão do biofilme por um minuto. Para análise da UFC, transfira uma alíquota de 0,1 mililitros da suspensão do biofilme para um tubo de micro centrífugas contendo 900 microliters de solução de cloreto de sódio de 0,89% para cada diluição.Diluir a solução de biofilme de 10 para a negativa, para 10 para as quatro negativas, em solução salina. Semente 50 microliters de cada diluição em placas SDA, e incubar as placas a 37 graus Celsius por 48 horas. Conte as colônias e aplique a fórmula.Para análise de peso seco, primeiro pesar e rotular tubos micro centrífugas. Adicione 0,1 mililitros da suspensão do biofilme e um mililitro de etanol absoluto nos tubos, e armazene-os a 20 graus Celsius negativos por 18 horas. Então, centrifuá-lo 10.000 vezes G por 10 minutos.Descarte o supernatante e coloque os tubos em um desiccador para secar as amostras por uma semana. Pesar os tubos de micro centrífugas novamente, e fazer a subtração para obter o peso da biomassa. Neste experimento, após tratamentos por diem com luz vermelha por um minuto para os biofilmes candida albicans, a UFC foi reduzida, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.Os desfechos da biomassa dos biofilmes candida albicanos após os tratamentos diários, mostram que o grupo tratado de luz vermelha apresentou redução similar da biomassa à observada no grupo controle positivo, tratado com clorexidina. Os dois grupos também apresentaram semelhança estatística entre si. Embora ambos tenham apresentado redução da biomassa, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.Quantidades inferiores de Cândidas albicans solúveis e insolúveis EPS, observou-se em controle positivo, em comparação com o controle negativo. Embora não estatisticamente significante, a aplicação por diem de luz vermelha diminuiu numericamente as quantidades de EPS solúvel e EPS insolúvel. O controle negativo e o grupo tratado da luz vermelha apresentaram semelhança estatística.Medindo a densidade de energia da luz, usando um medidor de energia antes de iniciar o tratamento para determinar os períodos exatos de aplicação. As etapas garantem que a densidade de energia será sempre de 87,6 joules por centímetros quadrados. Use a fórmula citada anteriormente.A medição é feita utilizando o mesmo da luz para a garrafa das placas, cinco milímetros. Uma associação entre fototerapia e drogas antifúngicas pode ser estudada para verificar se o pré-tratamento com luz vermelha, seguido pela aplicação de drogas, melhora a penetração de drogas no biofilme. Para o tratamento duas vezes ao dia, adaptamos os protocolos do nosso laboratório, fornecendo um modelo de biofilme fácil e reprodutível, que fornece respostas sobre viabilidade, peso seco e quantidades de polissacarídeo extracelular após o tratamento da luz vermelha.O protocolo é genérico e pode ser usado para testar outras terapias, além da luz vermelha, incluindo drogas, outras luzes, ou a combinação de luz e drogas. Trabalhar com microrganismos requer equipamentos especiais, como óculos de segurança, jaleco de botão e luvas de nitro.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes...

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Fonte: Zhao, K., et al. Um modelo In Vitro para Estudar o Efeito da Terapia Fotodinâmica Mediada por Ácido 5-Aminolevulínico no Biofilme de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra um protocolo de terapia fotodinâmica para avaliar os efeitos antibacterianos em biofilmes bacterianos Gram-positivos. Os biofilmes são divididos em quatro grupos: dois recebem um precursor fotosensimizador e dois recebem um tampão. Todos são incubados no escuro, seguidos por exposição à luz...

Tratamento ativado pela luz de biofilmes bacterianos usando um precursor fotosensimizador

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.

Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans

Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Este protocolo descreve a aplicação da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) em um modelo murino de candidíase oral. A aPDT foi realizada usando uma mistura solúvel em água de curcuminóides e luz LED azul.

Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral

O significado de pequenas colônias em Candida spp. resistência a medicamentos não foi totalmente explorado. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) oferece uma estratégia promissora contra infecções fúngicas resistentes a medicamentos. Este estudo demonstra que a aPDT mediada por rosa bengala desativa efetivamente Candida glabrata e induz pequenas colônias, apresentando um procedimento único.

Indução de pequenas colônias em Candida glabrate via terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengal

Um dispositivo LED de luz azul de 405 nm demonstra eficácia antimicrobiana contra uma ampla gama de patógenos de feridas quando avaliado em um modelo de pele sintética à base de colágeno. Essa abordagem simplificada in vitro oferece uma alternativa reprodutível e eticamente viável para avaliação em fases iniciais de terapias antimicrobianas baseadas em luz.

Investigação de um dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de feridas usando um modelo de pele sintética à base de colágeno

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação...

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Aprenda fototerapia com luz vermelha a 635 nm para regular biofilmes de Candida albicans. Este protocolo avalia como a fototerapia interfere no crescimento do biofilme durante 48 horas, oferecendo uma abordagem promissora para tratamentos clínicos.

Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

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