Name: Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a técnica de imagem ex-vivo de linfonodos usando anticorpos fluorescentes em modelo murino. Este método preserva a estrutura tecidual e viabilidade celular, permitindo visualização específica de células T e B por microscopia confocal.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01 AI43458 para H.L.W.).

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230.
1. camundongos utilizados para o experimento
<ol><li>Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo.</li>
	<li>Use camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem administrar a mistura do anticorpo assim como para investigar a presença de pilhas mononucleares, incluindo o antígeno que apresenta células e fagócitos, e sua distribuição no LN. Nota: os camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter têm proteína fluorescente verde (GFP) e proteína vermelha fluorescente (RFP) inseridas o controle dos promotores CX3CR1 e CCR2, respectivamente. Os ratos do repórter podem ser usados com ou sem a injeção da mistura do anticorpo. Veja por favor a referência4 para a injeção da mistura do anticorpo em um rato do repórter. Prossiga para a cirurgia se nenhum anticorpo será injetado.</li>
</ol>2. preparação e injeção da mistura do anticorpo
Nota: efectue estes passos em ratos descritos no passo 1,1.
<ol><li>Diluir 1:10 de violeta brilhante (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brilhante (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0,2 mg/ml) e 1:20 de ficoeritrina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) em PBS com o volume final apropriado para injetar na coxa interna (para imagem inguinal) ou na pata Pad (para imagem popliteal) linfática. Nota: use como isotypes: BV421 mouse IgG2b, k controle isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se alterar o anticorpo de coloração, use o isotipo correto.</li>
	<li>Para a imagem ln inguinal, injete 100 μl da mistura de anticorpos por via subcutânea na coxa interna (Figura 1a). Alternativamente, injete 50 μL por via subcutânea da mistura do anticorpo no coxim da pata à imagem poplítea LN (Figura 2a). Use delicadas 1 mL de seringas de insulina, (insulina U-100) com a agulha de tamanho 0,30 mm × 13 mm (30 Gauge × 1/2 polegada). Nota: Assegure-se de que a injeção para coloração inguinal do LN seja subcutânea e não intramuscular (IM), pois a mistura de anticorpos não será drenada corretamente se a administração por via intramuscular for realizada.</li>
	<li>Não anestesiar animais antes da injecção de mistura de anticorpos.</li>
	<li>Aguarde um mínimo de 3 h (dLN inguinal) e 12 h (dLN popliteal) pós-injecção para remover os órgãos.</li>
	<li>Se a rotulagem de células LN não for completamente observada usando grandes corantes fluorescentes de polímero, como violeta brilhante ou azul brilhante, use fluoróforos menores, incluindo isotiocianato de fluoresceina (FITC), PE e alfiscocianina (APC) como alternativa.</li>
</ol>3. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem inguinal
<ol><li>Eutanizar camundongos usando CO2 asfixia seguido de luxação cervical.</li>
	<li>Imobilize os camundongos na fase acrílica com fita adesiva e aplique óleo mineral com um cotonete na pele abdominal para evitar a deposição de peles ao redor da incisão (Figura 1b). A remoção da pele não é necessária.</li>
	<li>Realize uma incisão na linha média usando Microcirurgia de tesoura curvada (11,5 cm) e fórceps curvo microcirúrgico (12,5 cm) no abdômen do púis ao processo xifóide (Figura 1C).</li>
	<li>Dissociar a musculatura abdominal da pele (Figura 1D).</li>
	<li>Faça incisões cutâneas horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical para criar retalhos de pele no lado do interesse (de acordo com o lado da injeção de mistura de anticorpos) e bata a pele para visualizar o linfonodo (Figura 1e).</li>
	<li>Tape a aba da pele na placa acrílica (Figura 1F).</li>
	<li>Remover o linfonodo de drenagem inguinal usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1F). O linfonodo aparecerá como uma esfera translúcida, geralmente bilobular, a pele.</li>
</ol>4. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem poplítea
<ol><li>Eutanizar camundongos usando CO2 asfixia seguido de luxação cervical.</li>
	<li>Imobilize os camundongos em posição propensa no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral com cotonete na panturrilha e joelho (Figura 2a-D).</li>
	<li>Realize uma incisão na linha média na panturrilha do calcanhar até o joelho (Figura 2E, F).</li>
	<li>Dissociar a musculatura da panturrilha da pele (Figura 2F, G).</li>
	<li>Expor a fossa poplítea (Figura 2G). O linfonodo poplíteo aparecerá como uma esfera translúcida na fossa poplítea.</li>
	<li>Remover o linfonodo poplíteo usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 2G).</li>
	<li>Alternativamente, gire o rato sobre na posição supina, e aproxime a fossa poplítea entre o bíceps femoral e o semitendíneo para a remoção poplítea do ln realizando uma incisão do midline na vitela do salto ao joelho seguida pela dissociação da vitela musculatura da pele. Nota: a fossa poplítea é uma depressão rasa localizada na parte de trás da articulação do joelho. Abra com cuidado para ver o linfonodo poplíteo.</li>
</ol>5. preparação do linfonodo
<ol><li>Coloque todo o órgão em um prato de cultura com fundo de vidro (35 mm x 10 mm) e retire a gordura que rodeia o órgão usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1G-I e Figura 2h).</li>
	<li>Centralize o órgão no meio do prato (Figura 1J e Figura 2h).</li>
	<li>Cubra o órgão com um fragmento de limpadores de tarefas delicadas e mantenha-o embebido com a temperatura ambiente salina 0,9% ou solução tampão fosfato (Figura 1K-M e Figura 2h). Nota: não é necessário lavar os gânglios linfáticos após a remoção ou para realizar a extração do linfonodo no capô.</li>
</ol>6. microscopia confocal ex-vivo (Imaging)
<ol><li>Posicione o prato de Petri na ranhura do microscópio confocal invertido (Figura 1N e Figura 2h).</li>
	<li>Imagem LNs um microscópio confocal (Figura 1o e Figura 2h).</li>
	<li>Primeiramente, obtenha o foco correto usando a luz convencional do microscópio confocal com o objetivo 4x ou 10x. Em seguida, mude da função de luz para o modo de laser. Nota: se o microscópio confocal não contiver um objetivo de 4x, o foco pode perfeitamente ser obtido usando o objetivo 10x.</li>
	<li>Ajuste o poder do laser, o offset e o ganho usando uma amostra isotipo-manchada, não-manchada ou não-fluorescente (tabela 1) para remover o autofluorescence e a mancha inespecífica dos anticorpos fluorescente-etiquetados tais como esses usados nas imagens mostradas neste manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).</li>
	<li>Ajuste as posições Z e XY , utilizando a micrométrica e a carruagem, respectivamente, na área de interesse no linfonodo.</li>
	<li>Adquira imagens com objetivos de 4x, 10x e 20x com foco na estrutura do LN e na distribuição celular. Use a definição 1024 x 1024-pixel. Nota: Adquira um mínimo de cinco imagens em diferentes campos por objetivo por animal.</li>
	<li>Analise imagens usando um software de imagem para separar canais, adicionar escala e cores de interesse, e para reconstruir a vista 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica3 , <sup cl...

Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas1. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas2. Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no sistema linfático terá implicações importantes para o desenvolvimento da vacina e a imunoterapia do câncer.
O advento de microscópios poderosos-incluindo novos microscópios confocais e de super resolução-permitiu um avanço extraordinário na compreensão de como diferentes populações de células imunes se comportam em seu ambiente nativo3. Agora é possível a imagem de vários subtipos de células simultâneas usando uma combinação de sondas com camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas fluorescentes controle de alvos específicos4,5. De fato, técnicas de alta dimensão, incluindo citometria de massas e análise de fluxo Multiparamétrico, têm sido cruciais para ampliar nosso conhecimento sobre diferentes compartimentos e funcionalidades da célula imune na saúde e na doença6, 7. no entanto, para preparar amostras para estas técnicas, os tecidos necessitam de digestão e as células são separadas do seu ambiente natural para serem analisadas em suspensões celulares. Para superar essas limitações e permitir uma melhor tradução em biologia, o objetivo do protocolo proposto aqui é aplicar uma metodologia direta para a imagem de linfonodos inteiros ex vivo usando microscópios confocais de estoque com o benefício de velocidade melhorada, tecido preservação da estrutura, e viabilidade da pilha comparada à mancha convencional da imunofluorescência. Usando esta aproximação, nós pudemos mostrar que os ratos deficientes para as pilhas de ltγδ T, um SubType do linfócito de T envolvidos na defesa adiantada do anfitrião de encontro aos micróbios patogénicos4, têm os folículos comprometidos e as zonas da pilha de t em comparação aos ratos selvagens do tipo. Estes resultados permitiram que nós prosseguisse um estudo em que nós demonstramos que as pilhas de ltγδ T jogam um papel crítico na homeostase de órgãos lymphoid e da resposta imune humoral4. Além disso, este protocolo fornece um caminho fisiológico para sondas e anticorpos para alcançar o linfonodo, como eles são administrados por via subcutânea e dissipar-se através da circulação linfática do tecido, com base em relatos prévios que utilizaram a rotulagem in situ com anticorpos para visualizar as estruturas linfáticas-associadas8,9, adinâmica do centro germinais10,11,12, e alvos prontamente acessíveis ao fluxo sanguíneo13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1,5; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rato IgG2a, &kappa; Controle de isotipo</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Mouse IgG2b, K Controle de isotipo</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview placa de cultura</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm com fundo de vidro</td></tr><tr><td>Seringas de insulina</td><td>BD Plastipak-Insulin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Marca Kimtech Science</td><td>7557</td><td>tamanho 21 x 20 cm / 100 folhas por caixa</td></tr><tr><td>Pinça curva de microcirurgia</td><td>Instrumentos cirúrgicos WEP</td><td>feitos sob medida</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Tesoura curva de microcirurgia</td><td>Instrumentos cirúrgicos WEP</td><td>feitos sob medida</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>Agulha</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>gauge &times; &frac12; polegadas</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R cabeça confocal</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>carregado com 4 linhas de laser principais (405, 488, 543 e 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rato IgG2a, &kappa; Controle de isotipo</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 microscópio confocal</td><td>Zeiss-carregado</td><td></td> <td>com 4 linhas principais de laser (405, 488, 543 e 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.

Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ).
A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de pilhas de B (CD...

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Este protocolo reprodutível e fácil de executar usa uma estratégia de imagem de linfonodo ex-vivo para rastrear a drenagem de anticorpos fluorescentes administrados in vivo para órgãos linfoides secundários locais. Demonstrar essa técnica permite uma visualização específica do procedimento, o que pode facilitar uma execução bem sucedida do protocolo. Esta é uma técnica muito simples e simples que pode ser realizada por qualquer pessoa.O único aspecto desafiador é o manuseio do mouse, que requer algum treinamento. Esta técnica tem o benefício de uma melhor preservação do esforço do tecido de velocidade e viabilidade celular em comparação com os métodos convencionais de coloração fluorescente. O treinamento do procedimento seria Bruna Tatematsu, técnica do laboratório.Diluir os anticorpos de interesse, conjugados aos fluoroforos apropriados, em 100 microliters de PBS para imagem de linfonodo inguinal, ou 50 microliters de PBS para imagem de linfonodo popliteal. Para imagens de linfonodos inguinais, carregue 100 microlitadores do coquetel de anticorpos em uma seringa de insulina de um mililitro, equipada com uma agulha de 30 bitola por meia polegada, e injete subcutâneamente os anticorpos na parte interna do rato experimental. Para imagens de linfonodos popliteal, injete 50 microliters do coquetel de anticorpos subcutânea em uma pata do animal experimental.Então devolva o animal para sua caixa de casa. Para a colheita do linfonodo de drenagem inguinal, depois de esperar pelo menos três horas da injeção, imobilize o rato no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral na pele abdominal. Use tesouras de microcirurgia padrão e fórceps curvos de microcirurgia para fazer uma incisão de pele média no abdômen do púbis para o processo xifoide, e dissociar a musculatura abdominal da pele.Faça incisões horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical, para criar retalhos de pele na lateral da injeção, e retrair a pele para visualizar o linfonodo. Fixar a aba da pele na placa acrílica e usar os fórceps para remover o linfonodo inguinal translúcido, geralmente bilobular e esguio. Para a colheita do linfonodo de drenagem popliteal, pelo menos 12 horas após a injeção, imobilize o rato na posição propensa em um estágio acrílico.Aplique óleo mineral na panturrilha e joelho no lado injetado do animal. Em seguida, faça uma incisão na panturrilha do calcanhar até o joelho, e dissocia a musculatura da panturrilha da pele. Exponha a fossa popliteal.O linfonodo popliteal aparecerá como uma esfera translúcida dentro da fossa. Em seguida, remova o linfonodo com as fórceps curvas da microcirurgia. Para preparar o linfonodo para imagem, coloque os órgãos inteiros em um prato de cultura de 35 por 10 milímetros com um fundo de vidro, e use fórceps para remover qualquer gordura ao redor do tecido.Centralizar o órgão no meio do prato, e cobrir o tecido com um pedaço de limpador de tarefas delicadas encharcados de soro fisiológico. Para imagens ex vivo, posicione o prato no slot de microscópio confocal invertido e use a luz convencional do microscópio confocal e o objetivo 4-10X para obter o foco correto. Mude da função de luz para o modo laser e use uma amostra manchada de isótopo, não manchada ou não fluorescente para ajustar a potência do laser, compensar e ganhar para remover a fluorescência automática e qualquer coloração não especificada.Adquira imagens sob os objetivos 4, 10 e 20X com foco na estrutura do linfonodo e distribuição celular e usando uma definição de 1024 por 1024 pixels. Em seguida, use um programa de análise de imagem apropriado para separar os canais, adicionar a escala e cores de interesse e reconstruir a exibição 3D. A poderosa combinação de imunolabeling de células linfáticas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD19 e análise de imagem confocal permite a localização de células T e B dentro dos linfonodos inguinais.Nos linfonodos popliteis, como no tecido inguinal, os folículos de células B são cercados por populações de células T, uma marca registrada da estrutura do linfonodo. Como observado nessas imagens, os fagocitos não internalizam os anticorpos injetados, indicando que a coloração das células B e T é específica. Além disso, a reconstrução da rotulagem indica que as manchas de células T e B não se sobrepõem, confirmando ainda mais a especificidade da coloração.Células monocelulares são observadas em todo o linfonodo inguinal, incluindo o seio subcapsular. Com a maioria das células mononucleares expressando CX3XR1, seguidas pelas células CCR2 e CXCR31CCR2 dupla positiva. O mesmo padrão de distribuição celular e fenótipos celulares é observado no linfonodo popliteal.Ambos os linfonodos também apresentam regiões escuras sem expressão de receptor de célula mononuclear que são ocupadas por linfócitos. Além disso, as células mononucleares são escassas dentro da área interna dos linfonodos, permanecendo concentradas nas áreas externas do tecido, indicando que essas células ocupam principalmente o sinusular do linfonodo. A mistura de anticorpos precisa ser injetada precisamente no tecido subcutâneo para o sistema linfático drenar adequadamente os anticorpos para o linfonodo.Este método pode ser aplicado à biodistribução de drogas rotuladas fluorescentes, e a estudos de segmentação celular de nanopartículas rotuladas fluorescentes.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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