Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Este protocolo reprodutível e fácil de executar usa uma estratégia de imagem de linfonodo ex-vivo para rastrear a drenagem de anticorpos fluorescentes administrados in vivo para órgãos linfoides secundários locais. Demonstrar essa técnica permite uma visualização específica do procedimento, o que pode facilitar uma execução bem sucedida do protocolo. Esta é uma técnica muito simples e simples que pode ser realizada por qualquer pessoa.

O único aspecto desafiador é o manuseio do mouse, que requer algum treinamento. Esta técnica tem o benefício de uma melhor preservação do esforço do tecido de velocidade e viabilidade celular em comparação com os métodos convencionais de coloração fluorescente. O treinamento do procedimento seria Bruna Tatematsu, técnica do laboratório.

Diluir os anticorpos de interesse, conjugados aos fluoroforos apropriados, em 100 microliters de PBS para imagem de linfonodo inguinal, ou 50 microliters de PBS para imagem de linfonodo popliteal. Para imagens de linfonodos inguinais, carregue 100 microlitadores do coquetel de anticorpos em uma seringa de insulina de um mililitro, equipada com uma agulha de 30 bitola por meia polegada, e injete subcutâneamente os anticorpos na parte interna do rato experimental. Para imagens de linfonodos popliteal, injete 50 microliters do coquetel de anticorpos subcutânea em uma pata do animal experimental.

Então devolva o animal para sua caixa de casa. Para a colheita do linfonodo de drenagem inguinal, depois de esperar pelo menos três horas da injeção, imobilize o rato no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral na pele abdominal. Use tesouras de microcirurgia padrão e fórceps curvos de microcirurgia para fazer uma incisão de pele média no abdômen do púbis para o processo xifoide, e dissociar a musculatura abdominal da pele.

Faça incisões horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical, para criar retalhos de pele na lateral da injeção, e retrair a pele para visualizar o linfonodo. Fixar a aba da pele na placa acrílica e usar os fórceps para remover o linfonodo inguinal translúcido, geralmente bilobular e esguio. Para a colheita do linfonodo de drenagem popliteal, pelo menos 12 horas após a injeção, imobilize o rato na posição propensa em um estágio acrílico.

Aplique óleo mineral na panturrilha e joelho no lado injetado do animal. Em seguida, faça uma incisão na panturrilha do calcanhar até o joelho, e dissocia a musculatura da panturrilha da pele. Exponha a fossa popliteal.

O linfonodo popliteal aparecerá como uma esfera translúcida dentro da fossa. Em seguida, remova o linfonodo com as fórceps curvas da microcirurgia. Para preparar o linfonodo para imagem, coloque os órgãos inteiros em um prato de cultura de 35 por 10 milímetros com um fundo de vidro, e use fórceps para remover qualquer gordura ao redor do tecido.

Centralizar o órgão no meio do prato, e cobrir o tecido com um pedaço de limpador de tarefas delicadas encharcados de soro fisiológico. Para imagens ex vivo, posicione o prato no slot de microscópio confocal invertido e use a luz convencional do microscópio confocal e o objetivo 4-10X para obter o foco correto. Mude da função de luz para o modo laser e use uma amostra manchada de isótopo, não manchada ou não fluorescente para ajustar a potência do laser, compensar e ganhar para remover a fluorescência automática e qualquer coloração não especificada.

Adquira imagens sob os objetivos 4, 10 e 20X com foco na estrutura do linfonodo e distribuição celular e usando uma definição de 1024 por 1024 pixels. Em seguida, use um programa de análise de imagem apropriado para separar os canais, adicionar a escala e cores de interesse e reconstruir a exibição 3D. A poderosa combinação de imunolabeling de células linfáticas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD19 e análise de imagem confocal permite a localização de células T e B dentro dos linfonodos inguinais.

Nos linfonodos popliteis, como no tecido inguinal, os folículos de células B são cercados por populações de células T, uma marca registrada da estrutura do linfonodo. Como observado nessas imagens, os fagocitos não internalizam os anticorpos injetados, indicando que a coloração das células B e T é específica. Além disso, a reconstrução da rotulagem indica que as manchas de células T e B não se sobrepõem, confirmando ainda mais a especificidade da coloração.

Células monocelulares são observadas em todo o linfonodo inguinal, incluindo o seio subcapsular. Com a maioria das células mononucleares expressando CX3XR1, seguidas pelas células CCR2 e CXCR31CCR2 dupla positiva. O mesmo padrão de distribuição celular e fenótipos celulares é observado no linfonodo popliteal.

Ambos os linfonodos também apresentam regiões escuras sem expressão de receptor de célula mononuclear que são ocupadas por linfócitos. Além disso, as células mononucleares são escassas dentro da área interna dos linfonodos, permanecendo concentradas nas áreas externas do tecido, indicando que essas células ocupam principalmente o sinusular do linfonodo. A mistura de anticorpos precisa ser injetada precisamente no tecido subcutâneo para o sistema linfático drenar adequadamente os anticorpos para o linfonodo.

Este método pode ser aplicado à biodistribução de drogas rotuladas fluorescentes, e a estudos de segmentação celular de nanopartículas rotuladas fluorescentes.