Name: Biossíntese de um flavonol de um Flavanone estabelecendo uma cascata Bienzimática de um pote (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a biossíntese de flavonóis a partir de flavanonas em um sistema enzimático de uma etapa. Este método eficiente e econômico oferece alto potencial industrial para aplicações em saúde e indústria alimentícia.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade Yangzhou especialmente nomeado professor start-up fundos, Jiangsu especialmente nomeado professor start-up fundos, seis Talent Peaks projeto na província de Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e um projeto financiado por o desenvolvimento do programa acadêmico prioritário das instituições de ensino superior de Jiangsu (medicina veterinária). Agradecemos ao centro de testes da Universidade Yangzhou para análises de HPLC e MS de flavonoides.

<ol><li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoids%3A+biosynthesis%2C+biological+functions%2C+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).</li>
<li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+%28L.%29+sweet+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents%3A+Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+in+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+%28Aesculus+turbinata+BLUME%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li>
<li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li>
<li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li>
<li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+determination+of+flavonoids%2C+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+%28L.%29+by+HPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li>
<li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition%2C+Antioxidant%2C+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li>
<li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li>
<li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthetic+Methods+of+Flavones%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li>
<li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Yao+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li>
<li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li>
<li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li>
<li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li>
<li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li>
<li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li>
<li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).</li>
<li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics%2C+biochemistry%2C+cell+biology%2C+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).</li>
<li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li>
<li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1%3A+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cloning+into+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2%2B+Absorption+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li>
<li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um grande número de estudos são focados na derivação de flavonóis devido à sua potencial aplicação na saúde e na indústria alimentar. No entanto, a extração tradicional de plantas utilizando solventes orgânicos e síntese química possui desvantagens intrínsecas, que restringem seu uso na produção de flavonóis. Aqui, nós relatamos um método detalhado para produzir um flavonol de um flavanone em um potenciômetro estabelecendo uma cascata bienzimática in vitro. As etapas críticas neste protocolo são: 1) obtenção de enzimas r...

Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides vegetais e estão envolvidos no desenvolvimento de plantas e na pigmentação1,2,3. Mais importante, estes compostos possuem uma ampla gama de atividades benéficas para a saúde, tais como anti-câncer4,5, anti-oxidativo6, anti-inflamatória7, antiobesidade8, anti-hipertensivo9 e as propriedades de recuperação de memória10, levando a um grande número de estudos sobre esses metabólitos secundários derivados da planta. Tradicionalmente, esses compostos são derivados principalmente da extração vegetal usando solventes orgânicos. No entanto, devido ao seu conteúdo muito baixo nas plantas11,12,13, o custo de produção para a maioria dos flavonóis permanece elevado, o que impõe grandes restrições à sua aplicação nos cuidados de saúde e os alimentos Indústria.
Durante as últimas décadas, os cientistas desenvolveram um grande número de métodos para derivar flavonoides14,15. Entretanto, a síntese química destas moléculas complicadas possui uma variedade de desvantagens intrínsecas16. Exige não somente reagentes tóxicos e condições extremas da reação, mas igualmente muitas etapas para produzir um composto do flavonóide do alvo14,17. Além disso, outro importante desafio nessa estratégia é a síntese quiral de moléculas ativas de flavonoides. Portanto, não é uma estratégia ideal para produzir flavonoides em escala comercial através da síntese química16,17.
Recentemente, os cientistas desenvolveram uma estratégia alternativa prometedora para produzir estes compostos naturais complicados por micróbios da engenharia com um caminho para a biossíntese flavonóide18,19,20, 21 anos de , 22, que foi decifrado com sucesso nas plantas23. Por exemplo, Duan et al. introduziram uma via biossintética na levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae para produzir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produziram astragalin, um flavonol glicosilado, introduzindoflavanona 3-hidroxilase (f3h), flavonol sintase (FLS1) e UDP-glicose: Flavonoide 3-O-glucosiltransferase UGT78K1 genes em Escherichia coliBL21 (de3)17. Mesmo que existam alguns paradigmas, nem todos os micróbios geneticamente modificados produzem os produtos de interesse devido à complexidade de uma plataforma celular, à incompatibilidade entre elementos genéticos e hospedeiros artificialmente sintetizados, o inibidor efeito de produtos-alvo contra células hospedeiras, e a instabilidade de um sistema celular projetado em si16.
Outra estratégia alternativa promissora para a produção de flavonoides é estabelecer uma cascata multienzimática in vitro. Cheng et al. relataram que as poliketides enterocina podem ser sintetizadas com sucesso através da montagem de uma via enzimática completa em um pote25. Esta estratégia sintética livre de células contorna as restrições de uma fábrica de produção microbiana e, portanto, é viável para a produção de alguns flavonoides em grande quantidade16.
Recentemente, nós desenvolvemos com sucesso um sistema sintético do bienzyme para converter naringenina (NRN) em KMF em um potenciômetro16. Aqui, descrevemos este sistema em grandes detalhes e os métodos envolvidos na análise dos produtos. Também apresentamos dois exemplos que utilizam este sistema para produzir KMF de NRN e quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Além disso, discutimos etapas cruciais deste método e futuras direções de pesquisa na biossíntese de flavonoides.

<table><tbody><tr><td>2 vezes; Pfu MasterMix</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0717A</td><td>amplificação de PCR de genes com alta fidelidade</td></tr><tr><td>Agilent 1200 Series RRLC system com um sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>um equipamento para análise de flavonóides por HPLC/MS</td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation (versão B.03.01)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>um software para coleta de dados do sistema Agilent 1200 Series RRLC com um sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td></tr><tr><td>dihidrokaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>91216</td><td>produto intermediário para a produção de kaempferol a partir de naringenina</td></tr><tr><td>diidroquercetina</td><td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td><td>PCS0371</td><td>produto intermediário para a produção de quercetina a partir de eriodictyol</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de DNA</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2301</td><td>purificação de DNA eriodictyol amplificado por PCR ou purificado em gel</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>Substrato B21160</td><td>para a produção de quercetina</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0809</td><td>cepa de bactérias para expressar genes-alvo</td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0808</td><td>cepa de bactérias para proliferação de plasmídeos</td></tr><tr><td>FreeZone 1 Litro Benchtop Freeze-Dry System</td><td>Labconco Corporation</td><td>7740020</td><td>um equipamento para liofilização de flavonóides dissolvidos em solvente orgânico Kit de extração de</td></tr><tr><td>gel</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2302</td><td>purificação de uma banda de DNA de um gel de agarose</td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel</td><td>Xangai Tanon Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.</td><td>Tanon- 2500</td><td>um equipamento para visualização da banda de DNA em um gel de agarose ou mancha de flavonóide em uma placa TLC de poliamida</td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>LLC PLN350-1KT</td><td>minipreparação de plasmídeos</td></tr><tr><td>kaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>60010</td><td>produto de reação final e substância padrão</td></tr><tr><td>MassHunter Quanlitative Analysis (versão B.01.04)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>um software para análise de dados HPLC/LC/MS</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>um equipamento para determinação da concentração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>naringenina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>N5893</td><td>substrato para a produção de kaempferol</td></tr><tr><td>Ni-IDA Resina de Agarose</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0010</td><td>purificação de proteínas de fusão marcadas com His</td></tr><tr><td>pET-32a (+)</td> <td>Novagen</td><td>69015-3</td><td>plasmídeo para clonagem e expressão de genes alvo</td></tr><tr><td>sequenciamento de plasmídeo</td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N / A</td><td>sequenciamento de plasmídeos recombinantes síntese de primers</td></tr><tr><td></td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N / A</td><td>síntese de primers PCR</td></tr><tr><td>quercetina</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>Q111273</td><td>produto de reação final e substância padrão</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA SuperRT</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0741</td><td>síntese da primeira fita de cDNA a partir de RNA total</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0016</td><td>ligação de uma inserção em um vetor linearizado DNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>isolamento de RNA total</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605099</td><td>um software para design de primer de PCR e análise de sequência de DNA</td></tr><tr><td>Xcalibur v2.0.7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>um software para análise de dados de HPLC</td></tr></tbody></table>

biossíntese de um flavonol de um flavanone estabelecendo uma cascata bienzimática de um pote

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides com uma variedade de atividades biológicas e farmacológicas. Aqui, nós fornecemos um método para a síntese enzimática in vitro de um flavonol. Neste método, Atf3h e Atfls1, dois genes chave na via biossintética dos flavonóis, são clonados e superexpressos em Escherichia coli. As enzimas recombinantes são purificadas através de uma coluna de afinidade e, em seguida, uma cascata bienzimática é estabelecida em um tampão sintético específico. Dois flavonóis são sintetizados neste sistema como exemplos e determinados pelas análises de TLC e HPLC/LC/MS. O método exibe vantagens óbvias na derivação de flavonóis sobre outras abordagens. É tempo e trabalho de poupança e altamente rentável. A reação é fácil de ser controlada com precisão e, assim, escalada para a produção em massa. O produto-alvo pode ser facilmente purificado devido aos componentes simples do sistema. No entanto, este sistema é geralmente restrito à produção de um flavonol de um flavanone.

F3H e FLS1 são duas importantes enzimas chave na conversão de um flavanone em um flavonol em plantas como mostrado na Figura 1. Desenvolver um sistema biossintético in vitro para a produção de um flavonol a partir de um flavanone, Atf3h (GenBank adesão não. NM_ 114983.3) e Atfls1 (GenBank adesão não. NM_ 120951.3) os genes foram clonados a partir das mudas de 4 semanas de idade a. Arabidopsis thaliana em um vetor de expressão procar...

A derivação de um flavonol é crucial para sua aplicação na saúde e na indústria alimentícia. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a biossíntese de um flavonol de um flavanone e discutimos as etapas cruciais e suas vantagens sobre outras aproximações.

Biossíntese de um flavonol de um Flavanone estabelecendo uma cascata Bienzimática de um pote

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Usando este protocolo, podemos facilmente produzir um grande número de flavonols de flavanones em uma panela. Esta técnica é de economia de mão-de-obra e tempo, altamente econômica e fácil de controlar, por isso tem um enorme potencial de industrialização. Sim, este método pode fornecer insights sobre a produção econômica de outros metabólitos secundários, mas precisa de algumas modificações quando aplicado a ele.Ele geralmente não terá nada ou muito baixo rendimento. Meu conselho é lidar com enzimas recombinantes no gelo e adicionar 10% de glicerina à solução de estoque de enzimas. Isso porque somente através da demonstração visual uma nova mão pode entender os detalhes importantes e a verdade que afetam a execução bem sucedida do experimento.Primeiro prepare buffers. Faça duas vezes tampão sintético dissolvendo a quantidade apropriada de TRIS-base, ascorbate de sódio, ácido alfa cetoglutático em água desionizada e pipeta quantidade apropriada de glicerol para a solução. Use uma pipeta para adicionar ácido clorídrico para ajustar o pH para 7,2 e ajustar o volume adicionando água desionizada.Armazene o tampão sintético duas vezes a quatro graus Celsius para uso futuro. Em seguida, faça uma solução de estoque 100 vezes dissolvendo heptahydrate de sulfato ferroso em água desionizada. Faça uma solução de estoque de flavonoid de 25 milimolas dissolvendo flavonoid em metanol, e armazene a solução a menos 20 graus Celsius.O passo mais crítico é configurar um sistema sintético. Para configurar um sistema sintético para produzir um flavanol a partir de um flavanone, primeiro prepare o sistema sintético em um tubo de dois mililitros de acordo com os reagentes listados nesta tabela. Coloque o tubo aberto em um bloco de calor tremendo a 40 graus Celsius, a 600 rpm por quarenta minutos.Depois disso, termine a reação adicionando 10 microliters de ácido acético, e 100 microliters de acetato etílico. Duas horas depois, use uma pipeta para transferir a fase orgânica superior a um tubo de 1,5 mililitro, e coloque o tubo em um capô para secar o ar à temperatura ambiente. Para realizar a análise tlc, primeiro recupere os tubos do capô, e ressolar o pó flavanoid em 160 microliters de metanol em um tubo.Prepare amostras flavonoides autênticas com concentrações seriais, diluindo a solução de estoque flavonoide de 25 milimolas em metanol. Carregue um microliter da amostra de reação redissolved, e um microliter da autêntica amostra flavonoid, em uma placa de poliamida. Faça o mesmo para as outras concentrações de flavonoid autêntico na mesma placa.Em seguida, em um capô de fumaça, coloque a placa carregada da amostra em um cilindro de cromatografia preenchido com um sistema solvente. Coloque a placa na parte inferior do cilindro e execute a placa no sistema de solventes por 20 minutos. O ar secou as placas à temperatura ambiente.Com uma garrafa de pulverizador, pulverize as placas com solução 1% etanolica de cloreto de alumínio, seguido de secagem de ar novamente à temperatura ambiente por 30 minutos. Visualize as manchas nas placas sob uma luz UV a 254 nanômetros, e tire imagens, em seguida, no computador, abra o software ImageJ. Clique no arquivo, abra, para abrir a imagem a ser analisada.Clique na ferramenta de seleção mais retangular à esquerda na interface do usuário ImageJ. Delineie o ROI na imagem com o mouse e pressione um para rotular o primeiro ROI. Mova a seleção retangular com o mouse direto para o próximo ROI, e pressione dois para rotular o segundo ROI.Repita para rotular todos os outros ROIs pressionando dois. Pressione três para gerar gráficos de perfil para todos os ROIs, em uma janela pop-up. Em seguida, use a ferramenta de seleção em linha reta para soltar linhas de base de modo a definir uma área fechada para cada pico de interesse.Ative a ferramenta varinha, clicando no ícone correspondente na interface de usuário ImageJ. Clique dentro do pico para exibir resultados para todos os picos em uma janela pop-up. Em seguida, no Excel, plote os valores cinzentos da janela pop-up contra as concentrações flavonoides correspondentes, para fazer uma curva padrão baseada em TLC do flavonoid autêntico.Em seguida, calcule o rendimento do flavonoide de interesse produzido neste protocolo, de acordo com a fórmula resultante. Use uma seringa para processar cada amostra sequencialmente através de um filtro de 0,45 micrômetro e 0,22 micrômetros. Carregue as amostras em um sistema HPLC-MS através do bocal de sucção e separe as amostras a 30 graus Celsius usando uma coluna C18.Elute a coluna a um mililitro por minuto por um gradiente de 10 a 85 volume por cento de nitrito de acetil na água, e monitore a absorvância do eluado de 200 a 800 nanômetros. Realize a análise LC-MS em um modo de íon negativo, com um fluxo de nitrogênio seco de 10 litros por minuto a 300 graus Celsius, em um fluxo de gás de bainha de sete litros por minuto a 250 graus Celsius, e colete dados usando um software incorporado. Para extrair cromatógrafos de comprimento de onda único, abra o programa de análise qualitativa e clique em arquivo, abra o arquivo de dados.Selecione o arquivo a ser analisado na janela de arquivo de dados aberto e clique em abrir para abrir o arquivo. Clique com o botão direito do mouse na janela de resultados do cromatograma e, em seguida, extraia cromatogramas em um menu pop-up. Na lista de tipos, clique em outros cromatogramas.Na caixa de combinação do detector, selecione DAD1 e clique bem para exibir os resultados do HPLC na janela de resultados do cromatograma. Clique no ícone de integração manual encaixado na parte superior da janela de resultados do cromatograma. Desenhe a linha de base para o pico necessário para análise de integração manual com o mouse.Clique em exibir, lista de picos de integração, para exibir os resultados. Copie os resultados das áreas de pico para Excel e trace uma curva padrão baseada em HPLC do flavonoide autêntico contra as concentrações flavonoides correspondentes, então calcule o rendimento do flavonoide de interesse produzido neste protocolo de acordo com a fórmula resultante. Em seguida, repita os mesmos procedimentos para extrair cromatogramas de comprimento de onda único para analisar os dados de MS para a massa exata de compostos flavonoides.Clique no ícone de seleção de intervalo na barra de ferramentas de resultados do cromatograma. Selecione o pico de interesse. Clique com o botão direito do mouse na faixa selecionada e clique no espectro MS do extrato no menu pop-up para exibir os resultados na janela de resultados do espectro MS.Para determinar se este sistema in vitro pode ser usado para a conversão de um flavanone em um flavonol, nRN foi adicionado ao sistema. Havia duas novas manchas emergindo em uma placa de poliamida TLC. Um ponto mostrou uma distância de migração semelhante à da DHK, e as outras semelhantes à do KMF.Análises adicionais do HPLC e da LC-MS demonstraram que o novo produto químico mostrou um tempo de retenção de 12 minutos e 20 minutos, respectivamente, em um pico de íon quase molecular M sobre Z em 287 e 285 idênticos aos de DHK e KMF. Para determinar se o sistema pode ser usado para a conversão de outros flavanones em seus flavonols correspondentes, o ERD foi adicionado ao sistema. Duas novas manchas em uma placa TLC de poliamida apresentaram uma distância de migração semelhante à de DHQ e QRC, respectivamente.As análises de HPLC e LC-MS demonstraram que esses novos produtos químicos revelaram um tempo de retenção de 10 minutos e 16 minutos, respectivamente, e um pico de íons quase moleculares M sobre Z em 303 e 301, que correspondiam exatamente aos de DHQ e QRC. Ao preparar o sistema sintético, você deve adicionar a enzima por último, e adicionar o sulfato ferroso de segundo para o último. Sim, fornece um guia para a produção econômica de outros metabólitos secundários.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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