Name: Investigação das interações planta comum redes micorrízicas usando núcleos girados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a investigar interações entre plantas através de redes micorrízicas comuns usando núcleos girados. Este método permite examinar as consequências ecológicas dessas redes simbióticas em ecologia vegetal.

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Gostaríamos de agradecer os dois revisores anônimos para suas sugestões. Agradecemos também os inúmeros alunos de graduação que ajudava na construção de potes, microcosmos e entalhou recipientes e quem tem assistido com manutenção e colheita de experimentos. Agradecemos também North Central College para inicialização fundos (JW) e instalações atuais, bem como Ashley Wojciechowski para a obtenção de uma subvenção de Richter, do Norte, de Central College apoiando um experimento usando estes métodos. Parte deste trabalho foi financiado por um nacional Science Foundation doutorado dissertação melhoria Grant (DEB-1401677).

1. construção e montagem de núcleos rotativos
<ol><li>Modificar a recipientes de mudas tubular comercial (posteriormente chamado de 'embalagens'; Tabela de materiais) ter 19 mm de largura x aberturas de comprimento de 48 cm.<ol>
<li>Usando uma furadeira com um buraco de 19mm viu sem uma central, piloto broca de torção, faça dois buracos, um acima do outro, em um dos lados de um recipiente (2,5 cm de diâmetro x 12,1 cm de comprimento) para que os furos são cerca de 1 cm distante. Mantenha o recipiente contra uma vedação na imprensa de broca e tem uma parada com uma cavilha curta que vai caber dentro do recipiente para ajudar a segurá-lo no lugar durante a perfuração. Use um recipiente com plástico flexível para evitar rachaduras.</li>
		<li>Corte o pedaço fino de plástico entre os furos com uma tesoura, um cortador de fio ou tesoura (para plástico rígido use uma serra de sabre) fazer um alongado abrindo cerca de 2 cm de largura e 5 cm de comprimento.</li>
		<li>Repita os passos de 1.1.1 – 1.1.2 no lado oposto do recipiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cobrir as ranhuras com malha de nylon e/ou membrana hidrofóbica (figura 1A).<ol>
<li>Corte a malha de nylon com 40 μm de poros em 9,5 x 8,5 cm. Corte em pedaços como muitos como existem recipientes.</li>
		<li>Cola o engranzamento de nylon externamente para os recipientes para cobrir ambas as aberturas com alguma sobreposição ligeira no tecido usando cola quente de alta resistência, industrial.</li>
		<li>Se a prevenção do movimento da água é necessário, tal como quando usando nutrientes solúveis em água ou isótopos estáveis, cubra a camada de malha de nylon com uma membrana hidrofóbica31,32 (Tabela de materiais) que permite que sou hifas do fungo para Passe, mas apenas o movimento do vapor de água e água não líquida.</li>
		<li>Coloque a cola quente ao redor das aberturas do recipiente e ao longo das bordas longas da malha de nylon. Role o recipiente para o tecido para evitar queimar os dedos. Adicione uma camada de cola ao longo da borda do tecido onde a malha bordas de sobreposição. Pressione a borda sobre um papelão para selá-lo com firmeza. Sempre rolo consistentemente em uma direção que vai ser o mesmo sentido de rotação dos recipientes terminados dentro de potes ou microcosmos, para que a borda de malha sobreposta não será empurrada para potencialmente cavar o substrato.</li>
		<li>Uma vez que a cola tiver arrefecido, tape as extremidades superior e inferior da tela para o recipiente para evitar que as bordas soltas e rasgando usando uma fita flexível, tais como a fita do eletricista.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a mesma fita como na etapa 1.2.5, cobrir os buracos pequenos nos lados da extremidade cônica (não o orifício na ponta da parte inferior) de cada recipiente para evitar o crescimento da raiz para fora do recipiente para o resto do pote/microcosmo.</li>
	<li>Para evitar a perda de solo, proporcionando drenagem, coloque uma bola de gude de vidro na parte inferior de cada recipiente.</li>
	<li>Para um tratamento de controle que não envolve qualquer potencial para uma CMN para formar entre as plantas, use recipientes sólidos, sem modificações (figura 1A).</li>
</ol>2. conjunto de panelas ou de microcosmos para caber as pontas cônicas dos recipientes
<ol><li>Para garantir recipientes fica em pé em uma posição fixa e tem a drenagem apropriada, vire um pote para que o fundo é voltada para cima. Corte em torno do fundo da panela, deixando um pequeno lábio para suporte, usando uma serra de sabre.</li>
	<li>Preparação de espuma de poliestireno<ol>
<li>Corte a espuma de poliestireno, cerca de 36 mm de espessura, para o fundo da panela usando uma serra de fita com um gabarito de corte círculo com o diâmetro.</li>
		<li>Faça furos na espuma usando uma furadeira e 19mm buraco viram (sem uma broca de torção central) no padrão em que os recipientes serão posicionados.</li>
		<li>Para um experimento de planta alvo, faça um furo central com furos igualmente espaçados para os vizinhos indivíduos ao seu redor. Para um pote com um diâmetro de 15,5 cm, espaço seis furos 12mm separado em torno da circunferência de um círculo de 11 cm de diâmetro (figura 1B).</li>
		<li>Esquematize os buracos hexagonalmente ou em uma matriz quadrada (Figura 1, D) para um experimento de microcosmo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. enchimento dos recipientes e potes com misturas de solo e areia
<ol><li>Selecione uma mistura de solo desejado e adicionar sou fungo campo coletado ou inóculo pot-cultivadas ao solo misturando uniformemente picado pedaços de raiz (1 – 2 cm de comprimento) completamente com o solo. Misture o solo desejado com uma sílica inférteis grânulos de vidro ou areia para diminuir a concentração de minerais nutrientes disponíveis às plantas.</li>
	<li>Posicione os recipientes cheios no fundo perfurado espuma ou microcosmo e preencher o espaço intersticial com um substrato estéril.</li>
	<li>Preencha o espaço intersticial entre recipientes com mistura de areia de sílica de nutriente-pobres usando um funil para auxiliar no preenchimento de pequenos espaços. Para garantir a drenagem adequada e imitar a textura do solo, misture média areia tamanho de partícula, tais como grau de 6-20, com pequena tamanho de partícula areia, tais como grau de 30-65, em um misturador de cimento.</li>
</ol>4. estabelecimento de CMNs ao longo de panelas/microcosmos
<ol><li>Plantar plantas de pré-tratamento 'enfermeira' da espécie desejada para cada recipiente para sustentar os fungos de Micorrizas arbusculares para que eles possam se espalhou entre os recipientes e estabelecer CMNs.</li>
	<li>Quando todos os recipientes estabeleceram mudas, remova brotos por recorte para que apenas uma pessoa permanece em cada recipiente.</li>
	<li>Permitir que 2-3 meses para o crescimento de planta e estabelecimento do CMN.</li>
</ol>5. estabelecimento de plantas experimentais e tratamentos
<ol><li>Semear plantas experimentais por semeadura ou transplante em recipientes. Se semear, espere até que todos os recipientes têm uma plântulas germinadas antes de remover o pré-tratamento enfermeira plantas pelos seus brotos de recorte. Se transplantar, clip plantas tudo pré-tratamento antes de transplantar mudas experimentais para evitar efeitos indesejados do competidor.</li>
	<li>Estabelecer tratamentos CMN também deixando os recipientes não mudou-se para a duração do experimento (CMNs intactas) ou girados semanal para separar fisicamente as hifas estendendo-se entre os containers modificados (CMNs cortadas; Figura 1A). Quando cortando CMNs, gire cada recipiente através de uma rotação completa, para evitar que inadvertidamente alterar interações na superfície, particularmente para as plantas heliotropic.</li>
	<li>Água fortemente todos os potenciômetros ou microcosmos imediatamente após a rotação para restabelecer o contato entre o substrato intersticial e os lados dos recipientes.</li>
</ol>6. rastreamento de movimento de nutrientes mineral através de CMNs
<ol><li>Fertilizar as plantas vizinhas com 0,5% 15N enriquecido KNO3 e NH4Cl.</li>
	<li>Fertilize o indivíduo alvo com um fertilizante de 14N de igual concentração.</li>
</ol>7. acompanhamento e manutenção do experimento
<ol><li>Regularmente (no mínimo mensal) re-randomize as posições dos potenciômetros ou microcosmos ao longo do experimento.</li>
	<li>Semanalmente, medir o crescimento, tais como altura ou folha mais longo comprimento (para gramíneas) para monitorar quando crescimento começa a desacelerar, porque é importante para a colheita antes que as plantas se tornam raiz-limitam.</li>
</ol>8. colheita do experimento
<ol><li>Clip de todo o tecido na superfície e colocar plantas individuais nos envelopes rotulados que identificam o seu tratamento, pote ou microcosmo e posição.</li>
	<li>Tecidos na superfície secos a 60 ° C, até peso constante. Medir o peso seco de cada tecido de planta.</li>
	<li>Permitir que o solo secar antes de extrair os recipientes e colheita das raízes.</li>
	<li>Delicadamente escove fora como tanto do solo quanto possível de sistemas da raiz e lavá-los em uma panela de água, ou sob uma ligeira corrente de água sobre uma peneira de 250 microns de tamanho de poro.</li>
	<li>Permitir que as raízes secar ao ar e pesar todo o sistema da raiz.</li>
	<li>Clip do sistema da raiz ao acaso e armazenar os fragmentos de raiz em etanol a 50%. Depois que eles estiverem manchados33, use estes fragmentos para quantificação da colonização de raiz usando a linha de grade interseção método34.</li>
	<li>Re-pesar o restante sistema de raiz e armazená-lo em um envelope de papel etiquetados para secar a 60 ° C para avaliação do peso seco. Use a seguinte equação para calcular o peso de todo o sistema de raiz:</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59338/59338eq1v2.jpg" style="opacity: 0.9;">
9. análises de isótopos estáveis e nutrientes mineral
<ol><li>Agrupar as mudas por biomassa em "decis" ou 10 grupos, "octiles" ou 8 grupos, "quartis" ou quatro grupos, etc, depois rank-ordenando-os em peso se a quantidade de tecido é muito baixa para os requisitos mínimos para a digestão determinar o nutriente mineral concentrações.</li>
	<li>Envie amostras foliares para um laboratório contratado para análises de isótopos estáveis e nutrientes minerais (Tabela de materiais).<ol>
<li>Descreva a abundância isotópica usando a seguinte expressão habitual: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59338/59338eq2v2.jpg"> onde R representa a 15N /14N ratio de uma amostra ou da norma que é n atmosférico.</li>
		<li>Uso o não-modificadas, tratamento de sólidos recipiente para servir como um controle para rácios de 15N fundo na seguinte equação de balanço de massa quando quantificar a quantidade de 15N ocupada por uma planta de alvo em cortada ou tratamentos intactos do CMN: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59338/59338eq3v2.jpg" style="opacity: 0.9;"> onde δ15N representa a abundância isotópica de alvos, vizinhos e alvo de plantas no tratamento não CMN, e x representa (como uma fração decimal) o nitrogênio por cento obtidos pela planta alvo de recipientes vizinho ao qual foi adicionado o rótulo. Para δ15Nvizinhos obtidos são para compostos vizinhos do cada planta alvo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nossos resultados afirmam que nosso método de núcleo girado agudamente pode se concentrar sobre o papel da CMNs em interações planta belowground. Existem vários passos críticos no protocolo, no entanto, que se alterou, têm potencial para influenciar a capacidade de detectar os efeitos do CMN. É fundamental para encher os recipientes de área intersticial circundante com um meio nutriente-pobres. Na nossa experiência de planta alvo malsucedido, girado-núcleo com mudas de árvores de goiaba, embora tenha havido uma acentuada...

(AM) micorriza arbusculares assistida plantas na colonização da terra 460 milhões de anos atrás1 e hoje, eles são simbiontes onipresentes da maioria das plantas2, fornecendo-lhes nutrientes minerais vitais para o crescimento. As hifas finas, como fio de fungos de Micorrizas arbusculares forragem para nutrientes minerais além de zonas de esgotamento de nutrientes perto de raízes, muitas vezes encontrando e colonizar sistemas da raiz de plantas em uma "rede micorrízica comum" de vizinhos (CMN). Redes micorrízicas comuns também podem formar quando fungos germlings junção estabeleceu redes3, ou quando estou hifas fusível (anastomose) com hifas coespecíficas4,5,6,7. A extensão destas hifas extra-radiculares no solo é enorme, com hifas extra-radiculares constituindo 20% a 30% da biomassa microbiana do solo total na pradaria e solos de pastagem8 e estendendo-se por 111-m·cm-3 na pastagem imperturbada9 .
Redes micorrízicas comuns partição nutrientes minerais entre interconectadas vizinhas plantas10,de11,de12,13. As plantas podem receber até 80% de seu fósforo e 25% das suas necessidades de nitrogênio de fungos de Micorrizas arbusculares, proporcionando até 20% do seu total fixada carbono dos fungos em retorno14. Recente trabalho de cultura in vitro de raiz órgão encontrou que CMNs preferencialmente troquem nutrientes minerais com raízes de anfitrião que fornecem o maioria carbono aos fungos11,12. Além disso, diferentes espécies de fungos de Micorrizas arbusculares podem diferir em sua qualidade como parceiros simbióticos, com alguns fungos trocando mais fósforo para menos carbono do que os outros15. Embora as culturas de órgão raiz são benéficos modelos para estudar a simbiose AM porque eles apresentam ambientes cuidadosamente controlados e a capacidade de observar diretamente as interconexões das hifas, não incluem fotossíntese brotos que afectam processos fisiológicos importantes como a fotossíntese, transpiração e variações diurnas, coletores de nutriente, bem como representativos de carbono e minerais.
Na natureza, mudas mais prováveis canaliza CMNs já estabelecidos. Até recentemente, no entanto, cientistas apenas examinaram o impacto dos fungos de Micorrizas arbusculares na nutrição das plantas pelo cultivo de plantas com e sem fungos, muitas vezes com uma única espécie de fungo de AM. Embora este trabalho tenha sido tremendamente informativo à nossa compreensão do fungo de micorrizas, este método tem negligenciado o papel potencialmente crucial que CMNs podem ter nas interações entre plantas hospedeiras interconectadas. Em particular, as plantas que são altamente dependentes de fungos de Micorrizas arbusculares para crescimento minimamente interagem sem AM fungos16,17, possivelmente confundir a nossa interpretação das interações mediadas por fungo AM quando utilizado como 'controles' de linha de base referência.
Propomos uma abordagem girado-núcleo de investigação do papel da CMNs em interações planta e estruturação da população. Nossa abordagem imita componentes dos simbiose AM na natureza porque toda junção de plantas estabelecidas que cmns e todas as plantas são crescidas com fungos de Micorrizas arbusculares. Removendo as interações de raiz, nossa metodologia centra-se especificamente na interações mediadas por fungos de Micorrizas arbusculares enquanto o rastreamento também a circulação de nutrientes mineral na CMNs. Nossa abordagem baseia-se em trabalhos anteriores que tem usado núcleos girados tanto no campo como na estufa para entender AM funcionamento realisticamente.
O método de núcleo girado foi estabelecido na literatura como um método para manipular hifas extra-radiculares18,19,20,21, e teve diversas reencarnações dependendo de seu propósito sobre nas últimas duas décadas. Inicialmente, sacos de malha ou barreiras, permitindo o crescimento das hifas foram usadas para fornecer livre de raiz compartimentos para quantificar a quantidade de hifas de micorrizas arbusculares no.22,o solo23. Em seguida, núcleos cilíndricos de solo entre tubos rígidos de água ou plástico, tubo com ranhuras cobertas de uma malha de nylon penetrável por hifas, mas não as raízes, foram desenvolvidos. Estas poderiam facilmente ser giradas para perturbar os micélios extra-radiculares18,24,25. Os núcleos girados foram colocados entre as plantas, e comprimentos das hifas solo por grama de solo18, 13C fluxos de micélios extra-radiculares24, ou a absorção de fósforo de planta livre núcleos foram quantificados18. Um outro uso de tais núcleos era crescer plantas dentro no campo para reduzir a colonização de raízes por fungos de Micorrizas arbusculares através de frequentes interrupções hifal como alternativa à esterilização ou a aplicação de fungicidas, os quais têm efeitos indirectos em solo orgânico matéria e outros micróbios18.
A abordagem de barreira de malha hifal serviu para investigar o particionamento de nutrientes e interações da planta através de CMNs, mas em microcosmos retangulares em vez de com núcleos girados. Walder et al26 investigado interações entre Linum usitatissimum (linho) e Sorghum bicolor (sorgo) traçando nutriente mineral para troca de carbono utilizando isótopos através de CMNs de qualquer um dos fungos de Micorrizas arbusculares Rhizophagus irregularis ou Funneliformis mosseae26. Os microcosmos em seus compartimentos de planta do estudo composto separados por malha de barreiras, compartimentos hifais acessíveis apenas às hifas micorrízicas e rotulado de compartimentos hifais que continha isótopos radiativos e estáveis. Como controles, o estudo utilizou tratamentos sem fungos micorrízicos. Song et al27 usado uma abordagem semelhante para encontrar essa planta sinais poderiam ser feitos apenas entre CMNs estabelecidas de F. mosseae quando uma planta foi infectada por um patógeno fúngico. Também, da mesma forma a Walder et al26, Merrild et al.28 cresceu plantas em compartimentos individuais, separados por mesh para investigar o desempenho da planta de plântulas de Solanum lycopersicum (tomate) ligados por CMNs para um grande de Cucumis sativus planta (pepino) que representou uma fonte abundante de carbono. Eles também usaram tratamentos sem fungos micorrízicos em vez de cortar CMNs28. Em um experimento de segundo, relacionado, carbono para troca de fósforo foi examinado usando sacos de malha rotulados com 32P. microcosmos com malha hifal barreiras e CMN separando como tratamento foram usado por Janos et al.29, que investigou competitiva interações entre mudas das espécies arbóreas savana tetrodonta de eucalipto e mudas de árvore de floresta tropical, Litsea glutinosa. Nesse estudo, Janos et al29 levantado compartimentos contendo mudas alguns centímetros, deslizamento de camadas de malha um contra o outro para quebrar interconexões hifal29.
A etapa final da evolução do método girado núcleo tem sido de cultivar plantas dentro de núcleos que estão dentro de potes ou microcosmos de20,30. Wyss30 usado núcleos girados para verificar se o micélio extra-radicular do AM poderia colonizar mudas de Pinus elliottii quando espalhar de um doador ou planta hospedeira de 'enfermeira' AM, Tamarindus indicae micélio extra-radicular como de ectomicorrízicos desempenho de plântulas de influências fungos. Mudas tubulares comerciais grandes recipientes (Tabela de materiais) dentro microcosmos foram de qualquer plástico sólido (sem CMNs) ou entalharam e coberto com uma membrana hidrofóbica. Recipientes de mudas com fenda foram ou não girados (CMNs intactas) ou girada para cortar estabelecidos núcleos CMNs. rotacionada com barreira de malha de diferentes tamanhos foram usados por Babikova et al.20 para investigar belowground sinalização através de CMNs entre Vicia faba plantas (feijão). Em seu estudo, uma planta central doador em mesocosmos de 30 cm de diâmetro foi interligada por raízes e hifas (sem barreira) ou apenas por CMNs estabelecidas através de uma malha de 40 μm. Centrais plantas estavam cortadas de interações com as plantas vizinhas através de rotação dos núcleos de malha fechada, ou CMNs foram impedidos por uma malha fina de 0,5 μm envolvendo o núcleo.
Aqui, apresentamos um método que combina aspectos de prévias girado-núcleo abordagens para examinar a influência da CMNs sobre interações planta direto combinado com rastreamento de isótopo estável. Nosso método utiliza uma abordagem de 'planta de destino', em que a planta central de interesse está rodeada por plantas vizinhas. As plantas são crescidas dentro de recipientes de mudas rotativos que são encaixados e cobertos com tela de nylon do silk-screen, membrana hidrofóbica, ou são de plástico sólido não modificado. Redes micorrízicas comuns são cortadas uma vez por semana ou mantidas intactas, e isótopos estáveis de 15N rastrear o movimento do nitrogênio de núcleos girado dos vizinhos para a planta do alvo central. Comparando o tamanho da planta com captação do isótopo estável e nutrientes minerais, avaliamos que as plantas podem beneficiar ou sofrem de CMNs nas interações entre plantas hospedeiras.

<table><tbody><tr><td>Recipiente de mudas tubulares comerciais (chamado de 'recipientes' no manuscrito)</td><td>Stuewe and Sons, Inc</td><td>Ray Leach Cone-tainer &trade;</td><td>RLC3U</td></tr><tr><td>Curso de contas de vidro</td><td>Industrial Supply, Inc.</td><td>Peneira 12/20</td><td>Tamanho #1</td></tr><tr><td>Curso areia de</td><td>sílica Areia de sílica da Flórida</td><td>6/20 sacos de 50lb</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Contas de vidro finas</td> Black <td></td><td>Beauty Black Beauty FINE Vidro triturado abrasivo (50 lbs)</td><td>BB-Glass-Fine</td></tr><tr><td>Membrana hidrofóbica</td><td>Gore-tex</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Nenhum Grande recipiente tubular comercial para mudas</td><td>Stuewe and Sons, Inc.</td><td>Deepot &trade;</td><td>D16L</td></tr><tr><td>Areia de sílica média</td><td>Areia de sílica da Flórida</td><td>30/65 sacos de 50 lb</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Malha de nylon</td><td>Tube Lite Company, Inc.</td><td>Serigrafia</td><td>LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER</td></tr><tr><td>Instalação de análise de nutrientes foliares e de solo Laboratório</td><td>de testes de solo da Universidade Estadual do Kansas</td><td>Nenhum</td><td></td></tr> Nenhum <tr><td>Instalação de núcleo de isótopos estável</td><td>Universidade de Miami</td><td>Nenhum</td><td>Nenhum</td></tr></tbody></table>

investigação das interações planta comum redes micorrízicas usando núcleos girados

Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores

(AM) micorriza arbusculares influenciam o crescimento e absorção de nutrientes minerais vegetais, portanto, eles têm o potencial para influenciar as interações planta. O poder da sua influência em micélios extra-radiculares que se espalhou para além de zonas de esgotamento de nutrientes encontra-se perto de raízes para, finalmente, interligar os indivíduos dentro de uma rede micorrízica comum (CMN). A maioria dos experimentos, no entanto, têm investigado o papel dos fungos de Micorrizas arbusculares em interações planta pelo cultivo de plantas com versus sem fungos micorrízicos, um método que não aborda explicitamente o papel de CMNs. Aqui, propomos um método que manipula o CMNs para investigar seu papel nas interações planta. Nosso método usa modificados recipientes com fundo cónico com uma malha de nylon e/ou material hidrofóbico, cobrindo os orifícios entalhados, fertilizante 15N e uma areia intersticial pobres em nutrientes. CMNs são também deixou intacto entre indivíduos interagindo, cortada pela rotação dos recipientes, ou impedidos de se formar por uma barreira sólida. Nossos resultados sugerem que recipientes de giro é suficiente para perturbar o CMNs e evitar os seus efeitos sobre interações planta entre as CMNs. Nossa abordagem é vantajosa porque imita os aspectos da natureza, tais como mudas tocando em CMNs já estabelecidos e o uso de um conjunto de fungos que podem fornecer benefícios de diversos. Embora nossa experiência é limitada para investigar as plantas na fase de plântula, planta interações entre CMNs podem ser detectadas usando nossa abordagem que, por conseguinte, pode ser aplicada para investigar questões biológicas sobre o funcionamento da CMNs nos ecossistemas.

Para determinar como CMNs podem influenciar o desempenho da planta através de particionamento de nutrientes, crescemos Andropogon gerardii Vitman, uma grama de pradarias dominante, em um experimento de planta alvo com 6 vizinhos igualmente espaçados e intacta, decepada ou não CMNs. Achamos que o rompimento ou impedindo CMNs diminuída pesos secos dos destinos, acima do solo (Figura 2), sugerindo que CMNs intactas promoveu o crescimento da planta. Plan...

A maioria das plantas dentro das comunidades prováveis estão interligados por fungos de micorrizas arbusculares (AM), mas mediação de interações planta por eles foi investigada principalmente pelo cultivo de plantas com versus sem fungo. Apresentamos um método para manipular redes micorrízicas comuns entre plantas micorrízicas para investigar as suas consequências para as interações planta.

Investigação das interações planta comum redes micorrízicas usando núcleos girados

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The ...

A maioria das plantas na natureza são provavelmente interconectadas por fungos simpatizantes que habitam raízes chamadas fungos micorrizais. Este método examina explicitamente como as redes micorrizais comuns influenciam as interações vegetais e as consequências ecológicas subsequentes. Com este método, podemos examinar explicitamente o papel das redes micorrizais comuns, permitindo que todas as plantas sejam colonizadas por fungos, em vez de excluir fungos, o que resulta em plantas de mal crescimento.Para começar a modificar recipientes comerciais de mudas tubulares com plástico flexível, use uma prensa de perfuração e segure o recipiente contra uma cerca na prensa de perfuração, e faça uma parada com um pequeno dowel que cabe dentro do recipiente para ajudar a mantê-lo no lugar durante a perfuração. Em seguida, faça dois furos, um acima do outro, nas laterais do recipiente, de modo que os orifícios estejam a cerca de um centímetro de distância. Corte o pedaço de plástico fino restante entre os orifícios para fazer uma abertura alongada, cerca de dois centímetros de largura, e cinco centímetros de comprimento.Repita o corte dessas aberturas alongadas no lado oposto do recipiente. Para cobrir as ranhuras com malha de nylon, corte a malha poros de 40 micrômetros em até 9,5 centímetros por pedaços de 8,5 centímetros como há recipientes. Em seguida, usando cola quente industrial de alta resistência, fixe a malha de nylon externamente sobre os recipientes para cobrir ambas as aberturas, com alguma ligeira sobreposição no tecido.Aplique cola quente ao redor das aberturas do recipiente, e ao longo das longas bordas da malha de nylon, e enrole o recipiente na malha de nylon, e membrana hidrofóbica, quando usada, para evitar queimar os dedos. Adicione uma camada de cola ao longo da borda do tecido onde as bordas da malha se sobrepõem, e pressione a borda sobre algum papelão para selá-la firmemente. Uma vez que a cola tenha esfriado, use fita flexível para fixar as extremidades superior e inferior do tecido ao recipiente, para evitar bordas soltas e rasgos.Usando a mesma fita, cubra os pequenos orifícios nas laterais da extremidade cônica de cada recipiente para evitar o crescimento de raízes do recipiente para o resto da panela. Coloque um mármore de vidro no fundo de cada recipiente para evitar a perda do solo enquanto fornece drenagem e, em seguida, monte potes como descrito no manuscrito. Use recipientes sólidos e não modificados para um tratamento de controle que não envolva qualquer potencial para uma CMN se formar entre as plantas.Adicione o fungo AM inóculo ao solo, misturando uniformemente peças de raiz picadas de 1,2 centímetros de comprimento com o solo. Selecione um solo desejado misturado com uma areia de sílica infértil ou contas de vidro para diminuir a concentração de nutrientes minerais disponíveis para as plantas. Posicione os recipientes preenchidos em espuma perfurada previamente construída nos vasos.Para fazer uma mistura de areia de sílica pobre em nutrientes de drenagem adequada, misture areia de tamanho médio de partículas com areia de pequeno tamanho de partícula em um misturador de cimento. Encha o espaço intersticicial com esta mistura usando um funil para ajudar no preenchimento de pequenos espaços. Em seguida, o pré-tratamento de transplante, ou as chamadas plantas enfermeiras, das espécies desejadas em cada recipiente para sustentar fungos AM, que se espalharão entre os recipientes e estabelecerão redes micorrizais comuns.Cultivar as plantas por dois a três meses a aproximadamente 24 graus Celsius em uma estufa para permitir o estabelecimento do CMN. Costuram plantas experimentais semeando em recipientes. Aguarde até que todos os recipientes tenham germinado mudas antes de remover plantas de enfermeiras de pré-tratamento, cortando seus brotos.Para estabelecer tratamentos cmn, deixe alguns recipientes não movidos durante a duração do experimento. Para cortar fisicamente a higeia que se estende entre os recipientes modificados, gire alguns dos recipientes semanalmente, certificando-se de fazê-lo através de uma rotação completa, para evitar alterar involuntariamente as interações acima do solo. Imediatamente após a rotação, regar fortemente todos os potes para restabelecer o contato entre o substrato intersticicial e os lados dos recipientes.A imersão de todos os potes com água após o corte das redes micorrizais comuns é fundamental para restabelecer o contato entre o recipiente e o substrato intersticial, evitando assim aeração não intencional dos recipientes. Fertilize plantas vizinhas com 0,5% de nitrogênio 15 nitrato de potássio enriquecido e cloreto de amônio. Fertilize o indivíduo alvo com um fertilizante nitrogênio 14 de igual concentração.Re randomizar as posições dos potes ao longo do experimento, pelo menos mensalmente. Meça o crescimento semanalmente medindo o maior comprimento da folha, para monitorar quando o crescimento começa a desacelerar, certificando-se de colher antes que as plantas se tornem ligadas à raiz. Para colher, corte todo o tecido acima do solo e coloque plantas individuais em envelopes rotulados com seu tratamento, maconha e posição.Em seguida, seque tecidos acima do solo a 60 graus Celsius em um forno de secagem de ar forçado, para o peso constante, e, em seguida, meça o peso seco de cada tecido vegetal. Deixe o solo secar de dois a três dias antes de remover os recipientes e colher as raízes. Após a colheita, escove suavemente o máximo de solo possível dos sistemas radiculares.Lave as raízes em uma peneira com 250 mícrons de tamanho de poros, para evitar a perda de raízes. Depois de permitir que as raízes sequem, pese todo o sistema radicular. Corte o sistema radicular aleatoriamente e coloque os fragmentos em 50% de etanol.Repesar o sistema radicular restante e armazená-lo em um envelope de papel rotulado para secar a 60 graus Celsius para avaliação do peso seco. Ao cultivar Andropogon gerardii Vitman em um experimento de planta-alvo, cortar ou prevenir CMNs diminuiu o peso seco acima do solo, sugerindo que os CMNs intactos promoviam o crescimento das plantas. Plantas com CMNs decepdas e sem CMNs responderam de forma semelhante aos seus tratamentos.A concorrência, na qual o crescimento de um indivíduo suprime o crescimento de outro indivíduo próximo, foi detectada no tratamento intacto do CMN, mas não nos tratamentos cortados ou sem CMN. Comparações minuciosas de diferentes concentrações de tecido de folhas de nutrientes minerais, versus concentrações apenas de manganese, foram positivamente associadas com a planta-alvo acima dos pesos secos, em todos os tratamentos. O tecido vegetal-alvo foi avaliado para nitrogênio 15 em tecidos de folhas versus tamanho da planta, depois de adicionar o rótulo de nitrogênio 15 apenas aos recipientes dos vizinhos.Plantas-alvo com CMNs intactas apresentaram maiores concentrações de nitrogênio 15, em comparação com ambos os outros tratamentos. Os CMNs intactos apresentaram uma inclinação fortemente positiva, significativamente diferente da quantidade de nitrogênio, da do tratamento de CMNs cortados, sugerindo que grandes plantas obtiveram mais nitrogênio de CMNs atingindo recipientes vizinhos, do que pequenos indivíduos-alvo. Em um experimento de campo usando núcleos rotacionados feitos de tubo de PVC, o micélio extraradical além dos tubos teve pouco efeito no crescimento do sabão durante o experimento de 13 meses.No entanto, cortá-lo por rotação de tubos reduziu as concentrações de nitrogênio foliar, fósforo e cobre, substancialmente mostrado pelas plantas clorolóticas. Gire os recipientes na mesma direção em que o tecido é colado em cada recipiente para evitar o rasgo do tecido, e gire 360 graus para reduzir as mudanças acima do solo nas plantas. Este procedimento pode ser usado no campo com tubos de PVC modificados cheios de solo estéril para examinar o papel do micélio extra-anárquico na colonização radicular, e sua influência na absorção de nutrientes.Esta técnica permite a comparação de plantas com redes micorrizais comuns, com plantas micorrizais que não são interligadas por redes, em vez de pequenas plantas sem micorrizas, como é mais frequentemente feito.

investigation-plant-interactions-across-common-mycorrhizal-networks

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Escavação de raízes de plantas do campo, bem como processamento de amostras em endosphere, rizosfera e solo são descritas em detalhes, incluindo os métodos de análise de dados e extração de DNA. Este papel é projetado para permitir que outros laboratórios de usar essas técnicas para o estudo do solo, endosphere e microbiomes da rizosfera.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

A análise de rede foi aplicada para avaliar a associação de diversas comunidades microbianas ecológicas, como solo, água e rizosfera. Apresentado aqui é um protocolo sobre como usar o algoritmo WGCNA para analisar diferentes redes de co-ocorrência que podem ocorrer nas comunidades microbianas devido a diferentes ambientes ecológicos.

Divergência de Microbiota Raiz em Diferentes Habitats baseados em Redes de Correlação Ponderada

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Aqui, descrevemos uma técnica simples e barata para inocular e observar fungos micorrízicos arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros.

Inoculação e observação de culturas micorrízicas arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros

Detecção rápida e exata de patógenos no local, especialmente de solo-carregadas patógenos vegetais, é crucial para prevenir mais produção de inóculo e proliferação de doenças de plantas no campo. O método desenvolvido aqui, usando um sistema de detecção de PCR em tempo real portátil permite o diagnóstico no local em condições de campo.

Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real

Aprenda a investigar interações entre plantas através de redes micorrízicas comuns usando núcleos girados. Este método permite examinar as consequências ecológicas dessas redes simbióticas em ecologia vegetal.

Investigação das interações planta comum redes micorrízicas usando núcleos girados

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