Name: Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Aprenda a usar laranja de tiazol como alternativa segura ao brometo de etídio em eletroforese de DNA. Este método permite detecção com luz azul, preservando a integridade do DNA para experimentos subsequentes.

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Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização a TDG de Christopher Newport University.

1. preparar o gel
Nota: Para protocolos de eletroforese de gel geral, ver também P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Misture a agarose (~ 1% p/v, percentagem pode ser variada para separações de determinado tamanho) em buffer (aproximadamente 70 mL para um mini gel (8 x 7 cm)). Buffers são comumente TAE (pH tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8,6) ou TBE (pH tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).</li>
	<li>Adicione tiazol laranja para uma concentração final de 1,3 μg/mL.<ol>
<li>Dissolva tiazol laranja em DMSO, tornar-se uma solução 10.000 x (13 mg/mL). Enquanto não particularmente luz sensível, armazene TO no escuro quando não estiver em uso. Esta solução é estável à temperatura ambiente para ~ meses; armazenamento a longo prazo pode ser alcançado por congelamento alíquotas (DMSO irá congelar em um refrigerador padrão). Certifique-se inteiramente derreter e ressuspender uma solução congelada antes do uso. Nota: O gel pode também ser manchado com TO após eletroforese (ver passo 2.6). Enquanto que tem um perfil de segurança melhorada sobre o brometo de ethidium, segurança de laboratório padrão biologia molecular precauções devem ser mantidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A mistura de agarose e buffer de agarose tiazol laranja para dissolver no microondas (cerca de 60 s). Esta etapa é comumente referida como "fusão". Redemoinho (5 s) para auxiliar a dissolução, se necessário. : Nota também pode ser adicionado após o microondas se preferir.</li>
	<li>Permitir que a solução de agarose arrefecer brevemente antes de derramar em aparelhos de fundição de gel que contém um pente apropriado.</li>
	<li>Permitir que a solução de agarose solidificar em um gel.</li>
</ol>2. carregar e executar o gel
<ol><li>Coloque o gel no aparelho de eletroforese se não estiver presente.</li>
	<li>Adicione execução buffer (TAE ou TBE como acima) para cobrir a superfície do gel.</li>
	<li>Carrega amostras de DNA (geralmente de 10 μL) usando uma tintura do carregamento. Incluem uma escada de dimensionamento de DNA para referência.</li>
	<li>Coloque a tampa e eletrodos (o gel deve ser executado para o ânodo vermelho (positivo)).</li>
	<li>Aplicar tensão (normalmente ~ 100V para um mini gel, embora o tamanho do gel podem exigir uma tensão modificada para não danificar o gel) até carregar o corante tem viajado a uma distância adequada (aproximadamente 4-7 cm para um mini gel, embora a distância pode variar dependendo do aplicação precisa). Nota: Como o brometo de etídio e muitos outros corantes de ligação a DNA, laranja tiazol é carregada positivamente. Consequentemente, estes corantes migrará na direção oposta de electrophoresing DNA. Para amostras que são longe atropelar o gel de separação reforçada, eventualmente o corante irá separar os pequenos fragmentos de DNA, resultando em coloração fraca. Nestes casos, o gel deve ser manchado como na etapa 2.6. Esta situação não é exclusiva para, qualquer um carregado positivamente tintura que interage reversivelmente com DNA irá expor este comportamento (incluindo o brometo de ethidium e outros).</li>
	<li>Se que não foi adicionado antes de fundição (etapa 1.2) do gel, mancha imergindo o gel no buffer contendo tiazol laranja.<ol>
<li>Preparar o suficiente buffer (TAE ou TBE) contendo 1,3 tiazol μg/mL laranja completamente cobrir o gel e embeba o gel com agitação suave até as bandas são totalmente detectado (aproximadamente 20 min).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualização do gel de agarose laranja tiazol (transiluminador UV)
<ol><li>Retire o gel do aparelho de eletroforese e lugar em um transiluminador UV. Atenção: A luz UV é prejudicial à pele e olhos. Certifique-se de usar o apropriado (óculos) proteção olhos e rosto (protetor de cara). As mãos devem ter luvas e mangas compridas devem ser usadas.</li>
	<li>Se desejado, corte fora desejado bandas de DNA do gel (para digestão mais ou ligadura, por exemplo). Expor o gel à luz UV para como short um comprimento de tempo possível durante a excisão. Luz (independentemente de corante de ADN) UV danifica o DNA.</li>
	<li>Extrai o DNA da fatia gel usando um prontamente disponível kit ou protocolo15.</li>
</ol>4. visualização de gel de agarose laranja tiazol (transiluminador de luz azul ou lanterna)
<ol><li>Retire o gel do aparelho de eletroforese e lugar em um transiluminador de luz azul (~ 470 nm de emissão máxima de comprimento de onda). Alternativamente, um LED azul (~ 470 nm) lanterna pode ser direccionada em gel (ou de cima ou abaixo). Nota: Enquanto a sensibilidade é menor usando um transiluminador de luz azul com brometo de etídio, DNA, corado com brometo de etídio pode ser detectada usando esse protocolo de luz azul.</li>
	<li>Use um filtro de emissão âmbar (~ 560 nm longpass, óculos de proteção ou praça) para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência de complexos de DNA: tiazol laranja. Nota: Sem o filtro âmbar de emissões, é muito difícil de detectar bandas de DNA devido à intensidade da fonte de luz azul da excitação. Atenção: Embora a luz azul não possui a habilidade de agudamente danificar tecidos (contrastando UV), prolongados exposição à luz azul intenso pode danificar os olhos e óculos de âmbar de emissão ou de filtro deve ser usado.</li>
	<li>Se desejado, corta-se bandas de DNA desejadas do gel para novas aplicações. Nota: Desde que a luz azul não danifica o DNA, não é necessário cortar rapidamente para fora de bandas (como quando usando excitação UV em passo 3.2).</li>
	<li>Extrai o DNA da fatia gel usando um prontamente disponível kit ou protocolo15.</li>
</ol>5. captura de imagem
<ol><li>Selecione configurações apropriadas de excitação e emissão em aparelhos de gel de imagem. A excitação e emissão de laranja tiazol (λex, máximo = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar excitação forte, além de forte excitação em comprimentos de onda UV); λem = 527 nm) são quase idênticos aos comerciais azul-luz – detectável comum corantes, para que instrumentos podem ter predefinir configurações de filtro que podem ser usadas. Nota: Algumas configurações de filtro de azul-luz – detectável corantes comerciais realmente usar luz de UV prejudicial para a excitação, então tome cuidado, se imagem latente antes da corte de bandas. Use uma fonte de luz azul da excitação se possível quando bandas de DNA vão ser extirpadas após a imagem.</li>
	<li>Na ausência de um sistema de imagem com filtros adequados, coloca um filtro âmbar entre a câmara e a fonte de luz azul/gel de excitação.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Brometo de etídio tem sido uma ferramenta padrão no laboratório de biologia molecular, apesar de toxicidade conhecida. Ele também sofre de exigir que a luz UV, que danifica o ADN, como ele está sendo detectado. Laranja de tiazol oferece uma alternativa barata para brometo de etídio, bem como corantes comerciais úteis mas caros.
Os benefícios da laranja tiazol são, portanto, duas vezes. Primeiro, laranja tiazol simplesmente pode ser usada como um substituto para o brometo de etídio. Géis podem ...

A finalidade desse método é identificar o DNA em gel de agarose usando tiazol laranja (a) para a deteção de fluorescência. Devido a seu perfil de segurança de baixo custo e favorável, laranja tiazol pode ver benefício particular em laboratórios de ensino de graduação e laboratórios de pesquisa, realizando a biologia molecular, especialmente a ligadura e a clonagem.
Brometo de etídio permanece o corante mais comum para detecção de DNA em gel de agarose. Isto é principalmente porque pode ser obtido muito barata e requer apenas excitação com luz UV para a deteção. Ambas as ethidium brometo e tiazol laranja são baratos, com deteção de baixos limites (1-2 ng/pista)1. Existem duas desvantagens principais de brometo de etídio, no entanto, que laranja tiazol melhora.
Primeiro, brometo de etídio é um agente mutagénico2 com tratamento especial, transporte e eliminação requisitos, Considerando que laranja tiazol é menos mutagênico (3 – 4 x menos mutagênico no teste de Ames)3,4 e pode ser descartado em geral com resíduos químicos comuns.
Em segundo lugar, o brometo de ethidium requer luz UV para a deteção. Laranja de tiazol similarmente pode usar luz UV, se desejado, mas também pode ser detectada com luz azul. Luz UV, embora comumente utilizadas, tem algumas desvantagens importantes. Em primeiro lugar, é prejudicial para os olhos e a pele humana. Enquanto a luz UV pode ser usada com segurança por profissionais treinados, a pele ou os olhos danos acidentais (funcionalmente semelhante a queimaduras) da luz UV de laboratório não são incomuns particularmente com cientistas inexperientes. Em segundo lugar, a luz UV é extremamente prejudicial para DNA amostras5, que reduz o sucesso de experiências a jusante (tais como ligadura e transformação)1,6,7. TO permite a detecção com luz azul (λex, máximo = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar forte excitação)), que não causa danos à pele ou danificar o DNA (embora qualquer luz intensa ainda pode ser prejudicial para os olhos), diminuindo significativamente os riscos para ambos o cientista e a amostra.
Não é a alternativa de tintura fluorescente só de brometo de etídio; sua vantagem é o custo. QUE foi descoberto na década de 1980 como uma mancha de Reticulócito8e encontrou o utilitário em um número de fluorescência baseado em DNA experiências9,10,11,12,13. Atualmente é vendida por vários fornecedores. QUE é o composto de adicional, mais caro, azul-luz – detectável corantes comerciais e se comporta da mesma forma durante a electroforese, UV ou luz azul para a deteção de1. Além disso, enquanto outros corantes são mais sensíveis a concentrações muito baixas de DNA que EtBr ou TO, para experimentos de electroforese genéricos, tais corantes são proibitivamente caros, em muitos contextos.

<table><tbody><tr><td>Escada de DNA de 2 logs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Grau de Análise Genética)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Lanterna de luz azul</td><td>WAYLLSHINE (Amazon)</td><td>WAYLLSHINE LED azul</td><td></td>escalável</tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>etídio brometo</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Para comparação, não é necessário para o protocolo</td></tr><tr><td>Aparelho de gel (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick Kit de extração de gel Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Viewing Glasses</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Necessário para usar lanterna de luz azul.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (Transiluminador de luz azul)</td>A lanterna de luz azul <td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>pode ser usada como alternativa</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Para comparação, não é necessário para o protocolo</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetato-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Thiazole orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Os óculos também estão incluídos no Invitrogen G6600</td></tr></tbody></table>

eletroforese de dna usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Eletroforese em gel de DNA usando agarose é uma ferramenta comum em laboratórios de biologia molecular, que permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho. Após a separação, o DNA é visualizado pela coloração. Este artigo demonstra como usar o DNA de tiazol laranja para manchar. Laranja de tiazol compara-se favoravelmente a métodos comuns de coloração, em que é sensível, barata, excitáveis com UV ou luz azul (para não danificar a amostra) e mais seguro do que o brometo de etídio. Laboratórios já equipados para executar experiências de electroforese de DNA utilizando o brometo de etídio geralmente podem alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes, usando luz UV para a deteção. Deteção de luz azul para evitar dano da amostra além disso pode ser alcançada com um filtro de fonte e de emissão de luz azul. Laboratórios já equipados para a deteção de luz azul podem simplesmente alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes.

Laranja de tiazol permite a detecção de DNA, sem o uso de brometo de etídio e sem usar luz UV nocivas para o DNA. Brometo de etídio é conhecido para ser mutagénico, para que eliminá-la do laboratório pode ser vantajoso. Luz UV danifica o DNA e reduz a eficiência de transformação significativamente, Considerando que a luz azul não danifica o DNA. Limites de detecção são semelhantes entre o brometo de ethidium, tiazol laranja e um corante comercial comum, azul-luz – detectável do DNA (Figura 1...

Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Este protocolo é uma alternativa fácil e barata para usar brometo de ethidium para detecção de DNA durante a eletroforese. Removendo brometo de ethidium, a luz UV ou a luz azul podem ser usadas para detecção. A luz azul não é prejudicial ao DNA, o que melhora a chance de sucesso para experimentos a jusante.É muito fácil experimentar isso. Você só tem que substituir o brometo de ethidium em seus géis por laranja de tiazol. Para começar, prepare 1%mini-géis misturando aproximadamente 0,7 gramas de agarose em 70 mililitros de tris-acetato-EDTA ou tampões tris-borate.Em seguida, dissolva laranja de tiazol no DMSO para fazer uma solução de estoque de 10.000X. Embora não seja particularmente sensível à luz, armazene laranja de tiazol no escuro quando não estiver em uso. Para armazenamento a longo prazo, faça alíquotas da mistura laranja-DMSO de tiazol e congele-as.Em seguida, adicione laranja de tiazol a uma concentração final de 1,3 microgramas por mililitro, e micro-ondas a mistura de tampão de agarose e laranja de tiazol para dissolver agarose por aproximadamente 60 segundos. Despeje a mistura de agarose em um aparelho de fundição de gel contendo um pente apropriado, e permita que a solução agarose se solidifique em um gel. Para carregar o gel, primeiro coloque o gel no aparelho de eletroforese, se ainda não estiver presente.Em seguida, adicione o tampão de execução TAE ou TBE para cobrir a superfície do gel. Em seguida, usando um corante de carga, carregue 10 microliters de uma amostra de DNA. Inclua uma escada de dimensionamento de DNA para referência.Conecte a tampa e os eletrodos, e execute o mini-gel a 100 volts até que o corante de carga viaje aproximadamente quatro a sete centímetros para um mini-gel. Se a laranja thiazole não foi aplicada antes do fundição de gel, colori o gel, imergindo-o no tampão contendo laranja de tiazol com agitação suave por cerca de 20 minutos ou até que as bandas sejam totalmente detectadas. Para visualizar o gel usando um transilluminador UV, remova o gel do aparelho de eletroforese e coloque-o no transilluminador UV.Para visualizar o gel usando um transilluminador de luz azul ou uma lanterna, coloque o gel no transilluminador de luz azul ou direcione a lanterna LED azul no gel de cima ou abaixo. Use um filtro de emissão âmbar para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência dos complexos laranjas de dna thiazole e para proteger os corantes. Para maior digestão ou ligadura, corte as faixas de DNA desejadas do gel e prossiga para extrair DNA usando um kit ou protocolo prontamente disponível.Selecione as configurações de excitação e emissão apropriadas no aparelho de imagem em gel. Na ausência de um sistema de imagem com filtros apropriados, coloque um filtro âmbar entre a câmera e a fonte de excitação de luz azul-gel. Os limites de detecção são semelhantes entre brometo de ethidium, laranja de tiazol e um corante de DNA comercial comum detectável pela luz azul, com o limite de detecção para todos os três corantes sendo de um a dois nanogramas por pista em um mini-gel.O gel de agarose manchado de laranja thiazole de um digestor de restrição é detectável quando ele está animado com um UV ou um transilluminador de luz azul ou com uma lanterna de luz azul. Enquanto a laranja thiazole parece ser menos perigosa que o brometo de ethidium, equipamentos de proteção individual padrão, como luvas e óculos, ainda devem ser usados.

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Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Descrevemos um protocolo para detecção colorimétrica de E. coli usando um teste decisivo modificado que aproveita uma DNAzima, urease e esferas magnéticas de clivagem de RNA.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

Aqui nós apresentamos um método sensível, rápido, e discriminando da mancha do borne-gel aos RNAs da imagem etiquetados com os aptâmeros do RNA Mango mim, II, III, ou IV, usando géis nativos ou desnaturando do gel da electroforese do poliacrilamida (página). Depois de executar géis de página padrão, o RNA com a tag Mango pode ser facilmente manchado com TO1-biotina e depois analisado usando leitores de fluorescência comumente disponíveis.

Visualização fluorescente da Mango-Tagged RNA em géis de poliacrilamida através de um método de pós-coloração

Aprenda a usar laranja de tiazol como alternativa segura ao brometo de etídio em eletroforese de DNA. Este método permite detecção com luz azul, preservando a integridade do DNA para experimentos subsequentes.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

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