Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos
31 de março de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.
Este protocolo é uma alternativa fácil e barata para usar brometo de ethidium para detecção de DNA durante a eletroforese. Removendo brometo de ethidium, a luz UV ou a luz azul podem ser usadas para detecção. A luz azul não é prejudicial ao DNA, o que melhora a chance de sucesso para experimentos a jusante.
É muito fácil experimentar isso. Você só tem que substituir o brometo de ethidium em seus géis por laranja de tiazol. Para começar, prepare 1%mini-géis misturando aproximadamente 0,7 gramas de agarose em 70 mililitros de tris-acetato-EDTA ou tampões tris-borate.
Em seguida, dissolva laranja de tiazol no DMSO para fazer uma solução de estoque de 10.000X. Embora não seja particularmente sensível à luz, armazene laranja de tiazol no escuro quando não estiver em uso. Para armazenamento a longo prazo, faça alíquotas da mistura laranja-DMSO de tiazol e congele-as.
Em seguida, adicione laranja de tiazol a uma concentração final de 1,3 microgramas por mililitro, e micro-ondas a mistura de tampão de agarose e laranja de tiazol para dissolver agarose por aproximadamente 60 segundos. Despeje a mistura de agarose em um aparelho de fundição de gel contendo um pente apropriado, e permita que a solução agarose se solidifique em um gel. Para carregar o gel, primeiro coloque o gel no aparelho de eletroforese, se ainda não estiver presente.
Em seguida, adicione o tampão de execução TAE ou TBE para cobrir a superfície do gel. Em seguida, usando um corante de carga, carregue 10 microliters de uma amostra de DNA. Inclua uma escada de dimensionamento de DNA para referência.
Conecte a tampa e os eletrodos, e execute o mini-gel a 100 volts até que o corante de carga viaje aproximadamente quatro a sete centímetros para um mini-gel. Se a laranja thiazole não foi aplicada antes do fundição de gel, colori o gel, imergindo-o no tampão contendo laranja de tiazol com agitação suave por cerca de 20 minutos ou até que as bandas sejam totalmente detectadas. Para visualizar o gel usando um transilluminador UV, remova o gel do aparelho de eletroforese e coloque-o no transilluminador UV.
Para visualizar o gel usando um transilluminador de luz azul ou uma lanterna, coloque o gel no transilluminador de luz azul ou direcione a lanterna LED azul no gel de cima ou abaixo. Use um filtro de emissão âmbar para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência dos complexos laranjas de dna thiazole e para proteger os corantes. Para maior digestão ou ligadura, corte as faixas de DNA desejadas do gel e prossiga para extrair DNA usando um kit ou protocolo prontamente disponível.
Selecione as configurações de excitação e emissão apropriadas no aparelho de imagem em gel. Na ausência de um sistema de imagem com filtros apropriados, coloque um filtro âmbar entre a câmera e a fonte de excitação de luz azul-gel. Os limites de detecção são semelhantes entre brometo de ethidium, laranja de tiazol e um corante de DNA comercial comum detectável pela luz azul, com o limite de detecção para todos os três corantes sendo de um a dois nanogramas por pista em um mini-gel.
O gel de agarose manchado de laranja thiazole de um digestor de restrição é detectável quando ele está animado com um UV ou um transilluminador de luz azul ou com uma lanterna de luz azul. Enquanto a laranja thiazole parece ser menos perigosa que o brometo de ethidium, equipamentos de proteção individual padrão, como luvas e óculos, ainda devem ser usados.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta uma alternativa simples e de baixo custo ao brometo de etídio para a detecção de DNA em eletroforese em gel. Ao utilizar a orange de tiazol, os pesquisadores podem empregar luz UV ou azul para a detecção de fluorescência, aumentando a segurança do DNA durante os experimentos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Biologia Molecular
- Técnicas de Eletroforese
Contexto
- O brometo de etídio é um corante comum para DNA, mas apresenta riscos à integridade do DNA.
- A ortotiazol laranja oferece uma alternativa mais segura para a visualização de DNA.
- A detecção por fluorescência pode ser realizada com luz azul não prejudicial.
- Este método é econômico e de fácil implementação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo para detecção de DNA sem o uso de brometo de etídio.
- Demonstrar a eficácia do alaranjado de tiazol na eletroforese em gel.
- Destacar os benefícios do uso de luz azul para a visualização de DNA.
Métodos Utilizados
- Preparação de mini-géis a 1% utilizando agarose e tampões apropriados.
- Substituição do brometo de etídio pelo tiazol laranja em géis.
- Detecção de fluorescência utilizando luz UV ou azul.
- Avaliação da integridade do DNA após eletroforese.
Resultados Principais
- O laranja de tiazol cora eficazmente o DNA em eletroforese em gel.
- A detecção pode ser realizada com segurança usando luz azul.
- O protocolo é simples e reprodutível.
- Experimentos subsequentes mostram taxas de sucesso melhoradas devido à redução de danos ao DNA.
Conclusões
- A orange de tiazol é uma alternativa viável ao brometo de etídio.
- O uso de luz azul minimiza danos ao DNA durante a detecção.
- Este método aumenta a confiabilidade de experimentos subsequentes de biologia molecular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A eletroforese em gel de DNA permanece um fluxo de trabalho fundamental na validação de alvos e no desenvolvimento de ensaios, em que a integridade da amostra impacta diretamente a confiabilidade dos procedimentos subsequentes. A substituição do brometo de etídio pelo orango de tiazol reduz o risco genotóxico mantendo a sensibilidade de detecção, apoiando pipelines mais seguros de triagem de compostos e identificação de fármacos líderes. Isso permite que as equipes de P&D em biofármacos preservem a qualidade do DNA para clonagem, sequenciamento ou ensaios funcionais sem comprometer a produtividade ou a eficiência de custos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite testar hipóteses por meio da análise de fragmentos de DNA sem introduzir artefatos induzidos por corantes que poderiam confundir a confirmação do alvo.
- Valor Operacional: Compatível com infraestrutura existente de imagem UV ou luz azul, não exigindo reestruturação de protocolo para laboratórios que atualmente utilizam brometo de etídio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Oferece dimensionamento quantitativo de DNA com limites de detecção de 1-2 ng/linha, apoiando a análise precisa de fragmentos na eficiência de clonagem ou na validação de produtos de PCR.
- Valor Operacional: Elimina o manuseio de resíduos perigosos e os requisitos especiais de descarte associados ao brometo de etídio, simplificando a conformidade com as normas de segurança laboratorial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Preserva a integridade do DNA para aplicações posteriores, como ligação, transformação ou transfeção, melhorando as taxas de sucesso na geração de construtos para modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Permite a visualização com luz azul, reduzindo danos amostrais induzidos por UV e aumentando a reprodutibilidade entre experimentos replicados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere no fluxo de trabalho da biologia de descoberta, no qual a análise de DNA orienta a validação de alvos, a identificação de compostos iniciais e o desenvolvimento de construtos pré-clínicos, especialmente ao avaliar modificações genéticas ou os resultados de triagens.
- Biologia de Descoberta: Permite a separação e dimensionamento precisos de fragmentos de DNA, possibilitando a avaliação confiável de edições gênicas, integridade de plasmídeos ou amplicons de PCR durante a confirmação de alvos.
- Triagem: Oferece visualização reprodutível e quantitativa de bandas, essencial para avaliar a diversidade de bibliotecas ou confirmar acertos em ensaios baseados em ácidos nucleicos.
- Análises: Gera dados comparáveis de intensidade de fluorescência entre amostras, permitindo comparações consistentes de rendimento ou pureza de DNA sob diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Mantém a funcionalidade do DNA para uso em transfeção de células de mamíferos ou produção de vetores virais, essencial para avançar candidatos para testes pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Representa uma substituição direta de reagentes que pode ser padronizada entre equipes e locais sem a necessidade de requalificação do equipamento ou software de eletroforese.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao minimizar danos ao DNA induzidos pelo corante, melhorando a confiança nos dados de biologia molecular utilizados para avaliação de alvos.
- Valor Operacional: Utiliza o corante tiazol laranja, que é econômico e não perigoso, com armazenamento simples (estoque em DMSO aliquotado e congelado), reduzindo custos de reagentes e exigências de segurança.
- Valor Estratégico: Melhora a confiabilidade das decisões de prosseguir ou interromper ao preservar a integridade das amostras para sequenciamento, clonagem ou ensaios funcionais subsequentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço com ajuste de risco ao garantir que a qualidade dos dados baseados em DNA atenda aos critérios para otimização de compostos líderes e seleção de candidatos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise em biologia molecular na preparação de gel de agarose e eletroforese.
- Aparelho padrão de eletroforese com transiluminador de luz ultravioleta ou azul e filtro de emissão âmbar para detecção.
- Descongelamento e mistura consistentes de alíquotas congeladas de tiazol laranja-DMSO para garantir coloração uniforme.
- Validação da eficiência de coloração em sistemas modelo (por exemplo, plasmídeo, DNA genômico) ao adaptar o método a novos tipos de amostras.
- Limitação: Exige otimização do tempo de coloração (20 min) se for utilizada coloração pós-eletroforese, acrescentando uma etapa em comparação aos métodos com géis pré-moldados.
