Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Este protocolo é significativo por duas razões principais. Número um, permite que o usuário seja capaz de determinar os estados do ciclo celular das células da pele que foram isoladas de um modelo animal. Também nos permite ser capazes de analisar a expressão proteica nas fases discretas do ciclo celular.

Em comparação com os métodos anteriores de determinação da proliferação celular, nosso método permite uma determinação mais precisa das diferentes fases do ciclo celular, e também podemos analisar mais de 40 marcadores diferentes nos vários estágios da divisão celular. Isso melhora muito a aplicação e versatilidade do método. Este protocolo pode ser usado em pesquisas sobre câncer e em qualquer outro tipo de doença onde há a necessidade de determinar padrões específicos de expressão de proteínas do ciclo celular.

Além disso, este protocolo pode ser modificado para outros tipos de células, e em outros organismos modelo. A primeira vez que o usuário deve se concentrar em obter a melhor preparação celular de qualidade possível. Isso requer o processamento oportuno da pele experimental usando reagentes frescos, tempo mínimo de digestão tecidual e eliminação cuidadosa do supernacante após centrifugação para preservar a integridade e quantidade de células.

Para começar, projete um painel de anticorpos com etiqueta metálica usando um software gratuito de design de painel on-line, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, prepare uma solução de estoque de IdU dissolvendo o pó de IdU a 10 miligramas por mililitro em 0,1 hidróxido de sódio normal a 60 graus Celsius. Depois de aliquor a solução de estoque de IdU em tubos de microcentrifuuge, congele-os a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.

Imediatamente antes do uso, ajuste o pH da solução de IdU para 7,5 com 12 ácidos clorídricos normais e teste com uma tira de pH em uma alíquota de descarte para garantir que a solução esteja em pH 7.5. Para preparar uma solução de fixação de dois x paraformaldeído, combine cinco mililitros de 10 x PBS e um mililitro de 16% PFA com 44 mililitros de água destilada de grau molecular puro. Para preparar a solução de estoque de cisplatina de 100 mililitros, dissolva 300,5 miligramas de pó de cisplatina em 10 mililitros de DMSO.

Para que os experimentos sejam usados ao longo de um dia, prepare uma solução de trabalho cisplatina de 10 mililitros. Pese camundongos e, em seguida, determine uma dose a 0,1 miligramas de IdU por grama de peso corporal. Administre a dose calculada de IDU por uma injeção intraperitoneal, e espere duas horas antes de colher células.

Use um par de tesouras de grau cirúrgico para remover cirurgicamente a orelha do rato eutanizado previamente injetado com IdU na base da orelha. Coloque a orelha em uma placa de Petri seca de 100 milímetros. Separe cuidadosamente o anterior da pele posterior usando fórceps finos para criar um bolso no meio ou na borda da área de corte, em seguida, puxe os dois retalhos de pele separados, e prossiga com as peles anterior e posterior.

Coloque cuidadosamente as peles anteriores e posteriores de uma orelha em um poço de uma placa de cultura de 12 poços, preenchida com um mililitro de solução de dispase/colagenase recém-preparada, com o lado derma da pele tocando a solução. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora para digerir a pele. Coloque a orelha digerida ou a pele neonatal em uma placa de Petri limpa com o lado da epiderme tocando a superfície do prato.

Usando fórceps, achate a pele e deslize suavemente a derme da epiderme trabalhando do centro para as bordas em um padrão circular. Com fórceps, pegue a epiderme nas bordas e retire-a suavemente, retirando-a da superfície da placa de Petri. Coloque cuidadosamente a epiderme na solução de desprendimento celular pré-aquecida em um poço de uma placa.

Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius ou 20 minutos em temperatura ambiente. Use fórceps estéreis para agarrar a epiderme e esfregar arrastando a epiderme contra o fundo do prato para dissociar as células. Adicione um mililitro de DMEM contendo 1%FBS e passe por uma peneira de célula de 40 micrômetros em um tubo de coleta.

Enxágüe bem com mais dois mililitros de DMEM e adicione à suspensão da célula. Depois de centrifugar a 120 vezes g por cinco minutos, aspire cuidadosamente o supernante. Resuspenha a pelota celular em um a dois mililitros de DMEM contendo 1%FBS, e pelotar as células novamente como anteriormente.

Para rotular células para determinar células vivas e mortas, resuspenque de uma a três milhões de células em um mililitro de DMEM contendo 25 cisplatina micromolares e incubar por um minuto. Sacie por pipetação com um volume igual de FBS. Depois de centrifugar a 120 vezes g por cinco minutos, decante o sobrenante em um béquer contendo alvejante diluído, e inverta os tubos para drenar a solução restante em uma toalha de papel.

Resuspend a pelota celular em dois mililitros de PBS sem cártio de bário, e centrifuá-los novamente como descrito anteriormente. Para consertar as células, resuspenja a pelota celular em um mililitro de PBS livre de cátio de bário. Vórtice as células sob baixa potência contínua e adicionam um mililitro do buffer de fixação de dois x PFA em termos de queda.

Coloque em uma plataforma de balanço e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois de centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos, decante cuidadosamente o supernante. Lave as células com dois mililitros de PBS sem cárpio, centrífuga novamente sob as mesmas condições e repita a etapa de lavagem.

Finalmente, resuspense a pelota em dois mililitros de PBS sem cátio de bário. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos e decantar cuidadosamente o supernante. Resuspenda as células em um mililitro de um tampão de fixação x, e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e repetir a centrifugação.

Para lavar as células, adicione um mililitro de tampão de permeabilização de código de barras. Durante a centrifugação celular a 500 vezes g por cinco minutos, prepare os códigos de barras adicionando 100 microliters de tampão de permeabilização de código de barras a eles e misture imediatamente. Resuspende a pelota celular em 800 microliters de tampão de permeabilização de código de barras.

Adicione a solução de código de barras às células, misture e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos. Lave células em dois mililitros de tampão de coloração celular e centrífuga novamente.

Em seguida, resuspende de um a três milhões de células em um mililitro de solução de trabalho de tampão de manchas de antígeno nuclear, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos, decante cuidadosamente o supernante. Resuspend as células em um mililitro de tampão de permeabilização de antígeno nuclear e centrífuga novamente.

Após repetir a ressuspensão e centrifugação, resuspense a pelota celular no volume residual com vórtice suave. Adicione 50 microliters de coquetel de anticorpos intracelulares, misture e incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Adicione dois mililitros de tampão de coloração celular.

Centrifugar novamente sob as mesmas condições da etapa anterior, e remover o supernante. Resuspenda a pelota em dois mililitros de tampão de coloração celular, centrífuga a 500 vezes g por cinco minutos, e repita a resuspending e centrifugação. Resuspenque as células em um mililitro de solução de intercalação, e armazene por um a três dias a quatro graus Celsius.

Depois de centrifugar as células novamente, lave a pelota com dois mililitros de tampão de coloração celular, centrífuga sob as mesmas condições, e realize duas lavagens adicionais com dois mililitros de água, com a mesma centrifugação. Resuspend a pelota celular a uma concentração de um milhão de células por mililitro com solução de contas EQ diluída, e, em seguida, executar as amostras no cítmetro de massa. São determinados rendimentos de células esperadas e viabilidade da orelha do camundongo adulto e da pele neonatal.

O rendimento aproximado depende da superfície da pele. A pele neonatal é uma escolha melhor para experimentos que requerem um número maior de células. A estratégia básica de gating para selecionar para células intactas, únicas e viáveis, após a normalização e a desconvolução de dados de citometria de massa em código de barras, é mostrada.

A porcentagem de células viáveis pode ser indicativa da qualidade ou condição das células antes da coloração. Diferenças na viabilidade entre células de carcinoma cultivadas versus célulasuriculares isoladas do rato também são mostradas. Células viáveis foram fechadas no comprimento do evento versus CD45 para excluir células hematopoiéticas.

A inclusão de marcadores de linhagem permite a seleção de populações celulares de interesse em diferentes fases do ciclo celular. O perfil básico do ciclo celular é obtido pela detecção de BrdU versus PI em citometria de fluxo baseada em fluorescente. No entanto, a inclusão de outros marcadores de proliferação com citometria em massa, permite uma identificação mais precisa das fases do ciclo celular.

Seguindo essa abordagem, os perfis de ciclo celular podem ser construídos para diferentes tipos de células ou condições experimentais, como os perfis de células negativas cd45 versus CD45 do mesmo experimento. Em outro exemplo, a análise de marcadores que definem as vias de sinalização EGFR e mTOR PI3K na fase G-one, revelou perfis de expressão semelhantes em células negativas CD45, mostrados em laranja, e células positivas CD45, mostrados em azul. A citometria em massa requer muitas células de alta qualidade.

Se um usuário está interessado em uma população de células raras, um número maior de células pode ser necessário. Células vivas isoladas podem ser usadas para análise de DNA ou RNA, estudos bioquímicos, ou podem ser usadas na cultura tecidual antes da fixação e coloração para citometria em massa. O usuário deve usar equipamentos de proteção individual e um gabinete de segurança quando necessário, quando necessário, ao trabalhar com paraformaldeído, ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.