Name: Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a construir um microscópio HIST para imagem de molécula única com campo de visão 40 vezes maior e menor ruído de fundo. Este método utiliza lente objetiva única e é compatível com sistemas comerciais.

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Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) e National Science Foundation (NSF) (1805200). Agradecemos a Michael Serge em Andor tecnologia para emprestar-se generosamente a câmera sCMOS.

1. configurar as ferramentas de microscópio, lasers e alinhamento
<ol><li>Antes de construir o microscópio, preparem-se todos os componentes necessários, incluindo a óptica, optomechanics e eletrônica conforme listado na Tabela de materiais.</li>
	<li>Preparar um corpo de microscópio composto principalmente de duas partes: um objetivo titular com uma porta de segmentação RMS e um piezo-palco montado em um bloco de alumínio (Figura 1A). Nota: O corpo feito por microscópio é usado para a conveniência e a flexibilidade da instrumentação12. Qualquer organismo microscópio comercialmente disponível pode ser usado para a microscopia HIST.</li>
	<li>Combinando múltiplas linhas de laser e acoplamento-los para uma fibra de modo único<ol>
<li>Instalar 405, 561, 638 lasers de nm para a óptica da tabela e combinar as vigas através de um divisor de feixe polarizador e um espelho dicroico-passe longo, como mostrado na Figura 1B. Certifique-se de que todos os feixes de laser passam por buracos na ferramenta de alinhamento. Inserir placas de meia onda para ajuste de potência. Nota: Use óculos de segurança para proteção dos olhos e use o feixe-blocos para absorver raios laser indesejados.</li>
		<li>Instalar uma lente de acoplamento de fibra (f = 4.5 mm) e um adaptador de fibra realizada no Tradutor de eixo z com um sistema de gaiola.</li>
		<li>Conecte o adaptador de fibra, uma fibra de modo múltiplo (MMF, Ø 62.5 µm). Ajuste cada par de espelho a direção e o z-Tradutor até que a eficiência de acoplamento de cada laser é superior a 95%. O feixe de saída tem um perfil de Gaussian em forma de perto com os padrões do salpico.</li>
		<li>Tirar a fibra multimoda e conectar uma fibra monomodo (SMF). Semelhante ao MMF, afinar e maximizar a eficiência de acoplamento de três lasers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte uma fonte de luz colimada que será usada para o alinhamento do feixe pelos caminhos da excitação e deteção. Este dispositivo é composto por uma fonte de luz coerente temporalmente (561 nm) conectado à SMF, adaptador de fibra, lente acromática (f = 60 mm), íris e Ø1 "tubo espaçador em um sistema de gaiola (Figura 1C). Ajuste a distância entre o adaptador de fibra e a lente usando um interferómetro corte para garantir a colimação.</li>
	<li>Prepare uma ferramenta de alinhamento de feixe (Figura 1D). Este é um par de posts de alumínio com furos em 2" altura da superfície de mesa óptica, que permite o alinhamento do feixe rápidas e precisas.</li>
	<li>Montar um sistema de duplo orifício que consiste de dois Ø1 "discos de alinhamento do vidro à terra em cada extremidade e duas Ø1" lente tubos (a de baixo é entalhada) como mostrado na Figura 1,E.</li>
</ol>2. configurar o caminho de deteção
<ol><li>Retire o objectivo e instalar a fonte de luz colimada. Ajuste os botões do espelho (M1) sob o titular objetivo para que o feixe de saída do microscópio é aproximadamente paralelo à tabela óptica em altura e alinhada com furos roscados na mesa. Consulte a Figura 2 para posições detalhadas de cada componente óptico.</li>
	<li>Inserir um espelho dicroico multibanda (DM) e refletir o feixe em 90 graus. Usar o tamanho máximo da íris e certifique-se de que o feixe passa através do centro do espelho dicroico sem corte.</li>
	<li>Use o feixe gotejante, passando através do espelho dicroico para guiar o alinhamento do caminho da deteção. Coloque uma câmera de sCMOS para o feixe e certifique-se que o raio do centro do chip câmera usando dois espelhos (M2 e M3).</li>
	<li>Inserir um tubo de lente (TL; f = 300 mm) aproximadamente 300 mm de distância da câmera.</li>
	<li>Remover a fonte de luz colimada e ajustar a distância relativa entre o tubo da lente e a câmera, até que um padrão no teto é claramente resolvido pela câmera.</li>
	<li>Inserir um filtro passa faixa multi (BF) perante a objectiva de tubo para a imagem latente de fluorescência de cor multi.</li>
</ol>3. configurar o caminho da excitação
<ol><li>Reinstale a fonte de luz colimada no suporte da objetiva. Coloque um espelho-dobra (M4) para redirecionar a saída do feixe do microscópio por 90 graus. Ajuste os botões do espelho dicroico e dobra-espelho iterativamente até que o feixe passa através de furos na ferramenta de alinhamento do feixe.</li>
	<li>Desconectar a fonte de luz colimada e instalá-lo em cima da mesa, em que o feixe aponta para o corpo do microscópio. Alinhe o feixe usando uma ferramenta de alinhamento do feixe e um sistema de duplo vórtice.</li>
	<li>Inserir uma lente L4 (f = 400mm; Ø = 2") para o caminho óptico aproximadamente 400 milímetros longe o titular objetivo. Instalar a lente objetiva e ajuste a posição de L4 ao longo do eixo óptico até um padrão perfeito disco de Airy é formado no teto. Nota: Ao inserir a lente, a posição do feixe passando através da lente deve ser mantida inalterada. A lente L4 tem um thread de SM2 que permite que ele seja anexado/desanexado da 60 mm placa de gaiola SM2-rosca facilmente.</li>
	<li>Desaperte o objectivo e reinstalar a fonte de luz colimada com uma íris aberta. Rastreamento para a saída do feixe do microscópio com um cartão de visita. Montar um espelho M5, no lugar onde o tamanho do feixe é o menor e aproximadamente 400 milímetros longe L4, que é um plano de imagem conjugados (cIP).</li>
	<li>Instalar um espelho M6 e refletir o feixe em 90 graus. Com a ferramenta de alinhamento de feixe ajuste iterativamente M5 e M6.</li>
	<li>Inserir uma lente L3 (f = 150 mm) aproximadamente 150 mm do M5. Use um interferômetro de corte para garantir a colimação do feixe de saída.</li>
	<li>Temporariamente tire L4 e rastrear o feixe para encontrar a posição focal de L3. Coloque um espelho do único eixo galvo neste ponto, que é um avião de volta focal conjugado (cBFP). Fonte 0 volts para o espelho do galvo e girar o titular do galvo espelho que reflete o feixe em 90 graus.</li>
	<li>Coloque um espelho dobra M7. Coloque corretamente L2 (f = 100 mm) da mesma maneira como passo 3.6.</li>
	<li>Remova a fonte de luz colimada o titular do objeto. Instalar uma lente de colimação L1 (f = 100 mm), adaptador de fibra e íris. Conectar o adaptador de uma fibra de modo único e enviar o feixe através do sistema de imagem.</li>
	<li>Reinsira a L4 e afinar o sistema até que um padrão perfeito disco Airy aparece no teto.</li>
</ol>4. configurar as lentes cilíndricas
<ol><li>Inserir uma lente cilíndrica (CL1, f = 400mm) depois L1 e certifique-se de que a lente cilíndrica centra-se viga ao longo do eixo x.</li>
	<li>Inserir uma outra lente cilíndrica (CL2, f = 50 mm) para o caminho do feixe. Use um interferômetro de corte para garantir que o feixe de saída é colimado. Nota: A distância entre as duas lentes cilíndricas é 450 mm. O feixe de saída tem uma taxa de compressão de 8 e um padrão de alongado oval em forma de disco Airy é formado no teto.</li>
</ol>5. teste de imagem latente da telha
<ol><li>Prepare a amostra de hidrogel 3D. Mix 20 nm Crimson grânulos com uma solução de hidrogel, que consiste em 12% acrylamide:bisacrylamide (29:1), 0,2% (v/v) TEMED e persulfato de amónio 0,2% (p/v) em 0,75 x TAE buffer. Injete 50 µ l da solução misturada em uma câmara de fluxo, conforme descrito em outro lugar11. Depois de 10 min, a amostra de hidrogel 3D está pronta para a imagem latente.</li>
	<li>Coloque a amostra no porta-amostras. Ligue 638 nm do laser e ajustar o poder de < 1 mW para a excitação da amostra.</li>
	<li>Execute o software de controle de câmera. No painel de configuração-aquisição de câmera, selecione interno no modo de gatilho e clique em fazer um vídeo grátis executando o modo.</li>
	<li>Ligeiramente, ajuste a posição da câmera para que a imagem está localizada no centro da câmara quando 0 volts é aplicado ao espelho galvo.</li>
	<li>Gire o botão horizontal do espelho M5 para conseguir uma iluminação altamente inclinada. Nota: Com o aumento do ângulo de iluminação, a imagem de hidrogel torna-se mais clara do que a imagem de Epi como o feixe fica mais fino. No entanto, a imagem continua quase a mesma posição.</li>
	<li>Grave a imagem de telha. Calcule a largura de iluminação eficaz11. Por exemplo, a Figura 3 mostra a largura de iluminação eficaz de 12 µm.</li>
</ol>6. HIST de imagem
<ol><li>Prepare uma placa de aquisição de dados conectada com um bloco de terminais. Conecte o conector BNC 1 usuário com P0.0 através de um fio elétrico. Use 1 usuário como uma saída digital para o acionamento externo da câmera sCMOS. Conectar um analógico AO0 de saída para um driver de espelho galvo.</li>
	<li>Gerar trens de pulso TTL de P0.0 usando um programa feito sob medido (Figura 4A) e defina o período de tempo = 400 ms e t_ON = 2 ms. verificar os pulsos gerados de 1 usuário terminal BNC por um osciloscópio digital e em seguida, conecte o cabo BNC para a câmera Porto de gatilho externo. Nota: O software de controle usado neste documento está disponível mediante pedido. Quando a imagem latente em taxas de quadro de câmera diferentes, o período de tempo deve ser ajustado em conformidade.</li>
	<li>Comecem a varrer um espelho galvo através do programa feito sob medido. Ajustar Vmin a-500 mV e Vmáx 500 mV para a imagem latente de FOV completo. Observe que no âmbito desta operação, amostras de hidrogel 3D ainda mostram fundo elevado semelhante ao Epi-iluminação.</li>
	<li>Alterar a definição de aquisição de câmera.<ol>
<li>Selecione externo em modo de disparo e para baixo (sequencial) no menu drop-down de LightScan Plus como mostrado na Figura 4B. Nota: Neste cenário, a câmara não aceita imagens a menos que um sinal de gatilho está ativado.</li>
		<li>Clique em Controle de velocidade de varredura para janela altura e linha exposição tempo de controle e defina os valores como 180 linhas e 28 ms, respectivamente. Nota: Quando uma telha largura (WFEP) é de 180 linhas (12 µm) e um tempo de integração por linha (Tint) é 28 ms, um tempo de atraso entre as linhas (TD) é determinado como TD = Tint/wFEP = MS. 0.156 para imagem x 2.048 2.048 pixels, o tempo de aquisição total é de 2.048 x TD + Tint = 346 ms, correspondente a ~2.9 fps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um pouco ajustemáximo V e Vmin para obter imagens mais claras.</li>
	<li>Obter imagens de pilha 3D usando o programa feito por comutação em pilha 3D ON e especificando o número de pilhas e o tamanho do passo.</li>
</ol>

<ol><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li>
<li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+structural+biology%3A+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li>
<li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047(2011).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641(2015).</li>
<li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123(2018).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li>
<li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li>
<li>Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li>
</ol>

Universidade de Florida Central entrou com um pedido de patente, cobrindo o trabalho descrito neste artigo.

Há duas etapas críticas neste protocolo. A primeira é a colocação apropriada do L4 na etapa 3.3, garantindo que o feixe incidente passa através do centro da lente e um padrão perfeito disco de Airy é formado no teto. A posição de L4 determina a colocação de todos os outros componentes ópticos, incluindo L2, L3, GM e M5. O segundo passo crítico é o processo de sincronização. Para rejeitar a fora do plano de foco, pixels ativos cuja largura de detecção eficaz é igual à largura da telha devem ser sincronizados com a varrição de feixe. Portanto, é necessário medir a largura de iluminação eficaz de um feixe de telha (etapa 5.6) e parâmetros de ajuste de câmera em conformidade na etapa 6.4.
Quando imagem com FOV muito grande, o método apresentado mostra um aumento do fundo de um lado, em comparação com o outro lado. Isto é atribuído ao ligeiramente alterados ângulos de iluminação em diferentes posições da imagem latente. Implementar um segundo espelho galvo em vez de M5 alivia este problema como demonstrado antes, sincronicamente, ajustando a posição e o ângulo varredura11. Em vez de criação acromáticas parelhas, uma lente de varredura de telecêntrico será também útil. No entanto, para uma área de imagem < 8.080 µm2, galvo único espelho varrição era suficiente. Microscopia HIST tem um limite da profundidade da imagem, no entanto, é capaz de obter um bom SBR quando até ~ 15 µm com um feixe de telha 12 µm e uma de lente objetiva de imersão111,45 nd óleo de imagem.
Neste protocolo, fazíamos uma taxa de compressão do feixe de 8 um feixe de telha. Uma iluminação mais fina pode ser usada em microscopia HIST para alcançar maior SBR, que pode ser poderosa para tecido único-molécula de imagem11. No entanto, neste caso, fotobranqueamento efeito deve ser considerado por uma intensidade maior excitação enquanto a atual taxa de compressão do feixe mostrou fotobranqueamento reduzido em imagem em 3D em comparação com Epi11. Em comparação com microscópios de luz-folha com dois objectivos colocados ortogonalmente, microscopia HIST é simples de implementar e compatível com as preparações convencionais de amostra. A SBR reforçada e grande FOV de microscopia HIST é apropriado para estudar as interações e dinâmica de biomoléculas única em várias células e pode ser usado mais em Super-resolução imaging e rastreamento único-molécula.

Imagem de único-molécula fluorescência desempenha um papel importante em muitos estudos biológicos que revelam ultrastructures, dinâmica e a quantidade de biomoléculas1,2,3. No entanto, isso tem sido desafiador para estudar single-moléculas no interior das células ou tecidos. Microscopia confocal fornece alta corte capacidade4, não é apropriado para a imagem latente de único-molécula devido à severo fotobranqueamento pela excitação de alta intensidade ou velocidade lenta de imagem. Microscopia Widefield usa iluminação mais fraca, mas sofre de um sinal de fundo ratio (SBR)5. Microscopia de luz-folha, por outro lado, poderia mostrar bom corte e baixa fotobranqueamento6; no entanto, a disponível abertura numérica (NA) é grandemente limitada pela exigência de objectivos colocados ortogonalmente7. Alternativamente, requer especiais iluminadores e amostra câmaras8,9.
Por estas razões, a microscopia folha óptica altamente inclinado e laminado (HILO) tem sido amplamente utilizada para 3D único-molécula de imagem10. Quando um feixe inclinado encontra uma interface de dois meios (vidro e água, por exemplo), o feixe é refratado de acordo com a lei de Snell. Importante, o feixe refratado fica mais fino, e sua espessura é descrita como dz = R/tan(θ), onde R é o diâmetro do feixe inclinado e θ é o ângulo de refração do feixe transmitido. Essa implementação simples resulta em uma boa capacidade de corte. No entanto, esta relação indica que uma iluminação fina (ou seja, alta capacidade corte) requer um pequeno R e/ou um θ grande. Por exemplo, quando R = 20 µm e θ = 72 graus, um pode obter dz = 6,5 µm. Desde que há um limite prático para aumentar o ângulo de refração para dentro de células de imagem e evitar a reflexão interna total, há um acoplamento forte de diâmetro a iluminação e a espessura do feixe. Por esta razão, as imagens de HILO mostram um relativamente pequeno campo de visão (FOV) que restringe consideravelmente suas aplicações em imagiologia multicelular.
Recentemente, ultrapassámos esse problema por microscopia de telha varrida altamente inclinado (HIST) onde o FOV é desassociado a espessura do feixe em uma maneira muito simples de11. Primeiro, um feixe alongado em uma direção é gerado através de um par de lentes cilíndricas. Este feixe, denominado como um azulejo, produz uma iluminação fina com dz ~ 4 µm enquanto sua FOV é 130 x 12 µm2. Em seguida, a telha é varreu a amostra usando um espelho rotativo do galvo. Enquanto isso, a imagem de fluorescência é gravada em uma câmera de científico de semicondutor de óxido metálico complementar (sCMOS) que filtra o fundo fora de foco com eficiência, operando em um modo de obturador de rolamento que serve como detecção de fenda confocal ajustáveis. Desta forma, HIST microscopia permite imagem de único-molécula com um maior campo de visão (~ 130 x 130 µm2) e uma iluminação mais fina do que a imagem do HILO. Nós aplicamos esta imagem nova técnica para detectar os transcritos de RNA com um único teste em células ou com alguns testes nos tecidos do cérebro de rato, que tem um potencial significativo para o estudo de doenças e expressão gênica. Ao contrário de outras abordagens, HIST emprega apenas um objectivo único abertura numérica elevada sem um iluminador adicional ou objectivos de detecção remota e é totalmente compatível com microscópios invertidos. Estas vantagens junto com um grande FOV e alto contraste fará HIST microscopia uma ferramenta proeminente em biologia e medicina. Apresentamos instruções detalhadas sobre instrumentação de microscópio HIST e como testar e calibrar seu desempenho como abaixo.

<table><tbody><tr><td>Colimador</td> <td>Acromático</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A-ML</td> de 1"</tr><tr><td>Gibão acromático de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L1,L2</td></tr><tr><td>Gibão acromático de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td>TL</td></tr><tr><td>1" Espelhos dielétricos de banda larga</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02-10</td><td>M1~M7</td></tr><tr><td>Lentes cilíndricas de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1363RM-A</td><td>CL1</td></tr><tr><td>Lentes cilíndricas de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM-A</td><td>CL2</td></tr><tr><td>1" montagem cinemática quadrada</td><td>Edmund Optics</td><td>58-857</td><td>Para montagem em espelho dicróico</td></tr><tr><td>Placa de gaiola rosqueada de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>CP02</td><td>Para segurar outras lentes</td></tr><tr><td>2" Gibão acromático</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-150-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>2" Gibão acromático</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-400-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>2" Rosqueado Placa de gaiola</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>para segurar L4</td></tr><tr><td>2 "Placa de gaiola rosqueada</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01T</td><td>Para segurar L3</td></tr><tr><td>2% Solução Bis</td> Bio <td>Rad</td><td>64085292</td><td>componente de hidrogel</td></tr><tr><td>20 nm contas fluorescentes</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8782</td><td>Para testar imagens de 30</td></tr><tr><td>mm Gaiola Ângulo Reto Cinemática Espelho Montagem</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Para objetivos e sistema de gaiola</td></tr> de <tr><td>30 mm Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CP20S</td><td></td></tr><tr><td>3-Axis NanoMax Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>solução de acrilamida a 40% Bio</td><td>Rad</td><td>64148001</td><td>componente de hidrogel</td></tr><tr><td>laser de 405 nm</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>50x tampão TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0743</td><td>componente de hidrogel</td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-DPL</td><td></td></tr><tr><td>638 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td>componente de hidrogel</td></tr><tr><td>Ferramenta de alinhamento de feixe</td> blocos de terminais BNC <td>feitos sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumentos naturais</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Placa de gaiola com roscas internas M9 x 0,5</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>Para segurar lentes asféricas</td></tr><tr><td>Sistema de gaiola Hastes</td><td>Thorlabs</td><td>Série</td><td></td>SR</tr><tr><td>Cultura de células e smFISH</td><td></td><td></td><td>Veja uma referência [11]</td></tr><tr><td>Fita dupla face&nbsp;</td>Câmara <td>de fluxo</td> <td>515182 escocesa</td><td></td></tr><tr><td>Epóxi&nbsp;</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td>Câmara de fluxo</td></tr><tr><td>Espelho Galvo</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211</td><td>GM</td></tr><tr><td>Galvo System Fonte de alimentação linear</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td></td></tr><tr><td>Placa de meia onda</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-405/561/633</td><td>Ajuste de potência</td></tr><tr><td>espelho dicróico de longa duração</td><td>Chroma</td><td>T550lpxr</td><td>Para combinar lasers</td></tr><tr><td>Lâminas</td> <td>de microscópioFisherbrand</td><td>12549-3</td><td>Câmara de fluxo</td></tr><tr><td>Mikroskopische Deckglaser</td><td>Hecht Assistent</td><td>990/5024</td> Câmara <td>de fluxo</td></tr><tr><td>Disco de alinhamento de vidro fosco montado</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td><td>Para sistema de orifício duplo</td></tr><tr><td>Lente asférica rochester montada</td><td>Thorlabs</td><td>A230TM-A</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico multibanda</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635- t3</td><td>DM; filtro</td></tr><tr><td>Multi-banda</td> de 3 mm de espessura <td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677-25</td><td>BF</td></tr><tr><td>Fibra Multimodo</td><td>Thorlabs</td><td>M31L02</td><td>MMF</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ML</td><td>componente de hidrogel</td></tr><tr><td>NI-DAQ placa</td><td>Natural Instruments</td><td>PCI-6733</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1 "Espelho Cinemático de Montagem</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>Para Segurar Espelhos</td></tr><tr><td>Lente Objetiva</td><td>Olympus</td><td>PLANAPO N 60X</td><td>60X 1.45NA óleo</td></tr><tr><td>Base de Pedestal Garfos de Fixação Newport</td><td></td><td>9916</td><td></td></tr><tr><td>Postes de Pilar de Pedestal</td><td>Thorlabs</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>Controlador Piezo</td><td>Thorlabs</td><td>BPC303</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de feixe polarizado</td><td>Thorlabs</td><td>PBS251</td><td>Para combinar lasers</td></tr><tr><td>Adaptador RMS-SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A3TS</td><td>Para lente objetiva</td></tr><tr><td>Suporte de haste</td><td>feito</td><td></td><td></td>sob medida</tr><tr><td>Montagem de gaiola de rotação&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1 / CRM1 / CRM1P</td><td>para HWP e câmera sCMOS de montagem de lentes cilíndricas</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Zyla-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Interferômetro de cisalhamento</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td>Teste de colimação de feixe</td></tr><tr><td>Fibra monomodo</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>SMF</td></tr><tr><td>SM1 Tubos de lente</td><td>Thorlabs</td><td>SM1S25</td><td>Para sistema</td></tr> <tr>de orifício duplo<td>Tubo de lente com fenda SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L30C</td><td>para sistema de orifício duplo</td></tr> Adaptador de fibra roscada <tr><td>feito sob medida para</td><td></td><td></td><td>montagem em palco</td></tr><tr><td>Acoplamento de fibra</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td>Z-Axis Translation Mount</td> Thorlabs SM1Z</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Imagem de único-molécula avançou grandemente nossa compreensão dos mecanismos moleculares em estudos biológicos. No entanto, tem sido um desafio para obter imagens grandes do campo de visão, alto contraste em grossas células e tecidos. Aqui, apresentamos a microscopia de telha varrida altamente inclinado (HIST) que resolve este problema. Um par de lentes cilíndricas foi implementado para gerar um feixe de excitação alongada que foi verificado em uma grande área de imagem através de um espelho galvo rápido. Uma configuração de 4f foi usada para posicionar os componentes ópticos. Uma câmera científico semicondutor de óxido metálico complementar detectou o sinal de fluorescência e bloqueou o fundo fora de foco com uma fenda confocal dinâmica sincronizada com a varrição de feixe. Apresentamos um passo a passo instruções sobre o microscópio HIST com todos os componentes básicos de construção.

Como exemplo, single-stranded DNA marcado com Atto647N foi fotografada com um comprimento de onda de excitação de 638 nm em um hidrogel 3D. DNA foi ancorado à rede através de um grupo de acrydite hydrogel durante a polimerização do gel. As imagens foram tiradas em 5 mm acima da superfície, conforme mostrado na Figura 5um. A imagem HIST mostrou muito menos fundo em comparação com a imagem de Epi, do qual o sinal à relação de fundo foi calculado para ser 1,9 ± 0,7 para a imagem HIST, enquanto a maioria dos pontos única molécula mal podia ser detectado pelo Epi.
Fluorescência de RNA único-molécula hibridação in situ (smFISH) foi realizada com 4 sondas de peixe. Figura 5 b exibe imagens do smFISH de EEF2 (factor de alongamento eucariótico Tradução 2) rotuladas com AlexaFluor 647 A549 células em um buffer de imagem (consulte nosso trabalho anterior sobre a preparação de amostra11). Realizou-se uma projeção de intensidade máxima em 20 z-pilhas correspondente a 5 µm de espessura. A imagem HIST mostrou não só SBR melhorou muito, mas também mais iluminação uniforme em comparação com a imagem de Epi. Para a imagem latente de Epi, o tempo de exposição foi 400 ms, enquanto para HIST a integração de imagem tempo por linha foi 32 ms, que ambos tinham o mesmo poder de iluminação de 7,5 mW medido antes o objectivo. As velocidades da imagem latente de Epi e HIST foram 2,5 fps.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg"> Figura 1 . Ferramentas de corpo, lasers e alinhamento de microscópio. (A) objectivo e titular da amostra. (B) foto de sistemas laser. LP, espelho dicroico passe longo; Placas λ/2, de meia-onda; PBS, refletores polarizador. (C) fonte de luz Collimated. (D) ferramenta de alinhamento de feixe com dois furos inseríveis. (E) sistema de duplo vórtice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg"> Figura 2 . Configuração detalhada para microscopia de telha varrida altamente inclinado (HIST). Foto (A) e esquema (B) do sistema de microscópio HIST. BF, filtro passa faixa multi; Lentes CL1-2, cilíndricas; DM, espelho dicroico; GM, galvo espelho; BF, filtro passa-banda; M1-7, espelhos; L1-4, lentes; SMF, fibra de modo único; TL, tubo de lente; cIP, plano de imagem conjugados; cBFP, conjugados plano focal volta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg"> Figura 3 . Telha de iluminação com uma taxa de compressão de 8. (A) imagem de fluorescência de 20 grânulos nm em um hidrogel 3D. Barra de escala, projeção 20 µm. (B) desvio-padrão ao longo da direção y de A, suavizada por pontos de 10 dados. A seta vermelha indica uma largura de iluminação eficaz de 12 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg"> Figura 4 . Controle e software de imagem frontal painéis. (A), A medida LabView programa sincronicamente controla a varredura de espelho galvo, a aquisição inicial da câmera de sCMOS e o movimento da fase de piezo. Painel de controle (B) definição de aquisição de câmera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg"> Figura 5. (A) imagens de Atto647N-etiquetada do ADN em um hidrogel 3D com iluminação Epi e HIST. (B) smFISH imagens de EEF2 usando 4 peixes sondas A549 células por microscopia Epi e HIST. Mancha DAPI é mostrada em azul. Escala de bares, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Uma instrução detalhada é descrita em como construir um altamente inclinado varrido telha (HIST) microscópio e seu uso para a imagem latente de único-molécula.

Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Nosso método nos permite visualizar moléculas únicas com uma área de imagem 40 vezes maior do que os métodos convencionais, e tem um sinal de fundo muito reduzido. Ao contrário de outras técnicas, nossa abordagem usa uma única lente objetiva, não requer uma câmara de amostra especial, e é facilmente compatível com sistemas de microscópio comercial. Depois de reunir os componentes necessários, comece a construir o sistema.Aqui, vários elementos já estão em posição no banco. Montado em um bloco de alumínio está um corpo de microscópio com um estágio Piezo e suporte de amostra. Também no banco estão três lasers e elementos ópticos para combinar os feixes.Os feixes combinados são acoplados a uma fibra de modo único da forma mais eficiente possível. Como etapa preliminar final, monte uma fonte de luz colidida em um sistema de gaiola. Este tem uma fonte de luz coerente temporária conectada a uma única fibra de modo, um adaptador de fibra, lente acromática e íris.Comece a trabalhar com o caminho de detecção. Primeiro, coloque a fonte de luz colidida na porta objetiva do corpo do microscópio. Ajuste o espelho sob os objetivos para que o feixe de saída esteja aproximadamente horizontal e alinhado com os orifícios do banco.Insira um espelho dicroico no caminho do feixe e reflita o feixe em 90 graus. Adicione espelhos para permitir o ajuste do caminho do feixe transmitido para uma câmera sCMOS. Use os espelhos para garantir que o feixe atinja o centro do chip.Em seguida, insira uma lente de tubo focal de 300 mililitros sobre uma distância focal da câmera. Remova a fonte de luz colidida do corpo do microscópio. Em seguida, ajuste a posição da lente do tubo para definir seu plano focal.Pare os ajustes quando a câmera resolver claramente o padrão no teto. O caminho de detecção é retratado neste esquema. Observe a adição de um filtro de passe de várias bandas antes da lente do tubo para imagens de fluorescência multicolorida.Volte ao corpo do microscópio. Lá, reinstale a fonte de luz colidida no suporte objetivo. Após o espelho dicroico, coloque um espelho dobrável no caminho do feixe refletido para redirecioná-lo em 90 graus.Remova a fonte de luz colidida do corpo do microscópio e coloque-a nas proximidades. Em seguida, insira uma lente focal de 400 milímetros em cerca de uma distância focal do espelho. No corpo do microscópio instale a lente objetiva.Em seguida, ajuste a posição do espelho ao longo do eixo óptico. Observe o teto acima do objetivo e pare quando um padrão de disco arejado perfeito for formado lá. Agora remova o objetivo e reinstale a fonte de luz colidida com uma íris aberta.Determine onde ao longo do caminho do feixe o feixe é menor a cerca de 400 milímetros de distância do espelho. Uma vez identificado o ponto, monte um espelho lá, um plano de imagem conjugado. O estado da configuração neste momento aparece neste esquema.O espelho apenas adicionado é rotulado M5. Insira outro espelho para refletir o feixe de 90 graus e monte uma lente de distância focal de 150 milímetros além dele. A lente deve estar a 150 milímetros do plano de imagem conjugado. Em seguida, tire temporariamente a primeira lente no caminho do feixe de excitação.Com esta configuração encontre a posição focal da segunda lente. Coloque um espelho galvo de um único eixo neste ponto focal como um plano focal conjugado para trás. Forneça zero volts ao espelho galvo e gire seu suporte para que ele reflita o feixe de 90 graus.Em seguida, ao longo do caminho do feixe, coloque um espelho dobrável que reflete o feixe a 90 graus. Coloque a lente 100 milímetros ao longo do caminho do feixe do plano focal conjugado. Mais uma vez, remova a fonte de luz colidida do suporte do microscópio.Adicione outra lente de colisão de 100 milímetros com um adaptador de fibra e fibra de modo único, juntamente com uma íris. Em seguida, use a íris, fibra e lente para enviar um feixe colidido através do sistema de imagem. Em seguida, insira uma lente cilíndrica de distância focal 400 milímetros pouco antes da última lente de colisão no caminho do feixe.Use-o para focar o feixe. Insira uma lente cilíndrica de 50 milímetros 450 milímetros na frente da primeira. Esta é uma representação esquemática da configuração final com os caminhos de detecção e excitação.A saída dos três lasers é acoplada ao caminho pela fibra de modo único. Para testar, prepare uma amostra de hidrogel 3D. Este consiste em contas carmesim de 20 nanômetros misturadas com hidrogel.Na configuração coloque a amostra de hidrogel no suporte da amostra. Para a excitação da amostra ligue o laser de 638 nanômetros e ajuste sua potência para menos de um miliwatt. Configure o software de controle da câmera no modo de gatilho interno e capture o vídeo.Neste ponto o galvo motor tem zero volts aplicados. Posicione a câmera para que a imagem esteja no centro da lente. Em seguida, ajuste o espelho que é o plano de imagem conjugado.Gire o botão horizontal no espelho para obter uma iluminação altamente inclinada. Registo a imagem do azulejo como na imagem de fluorescência amostral do hidrogel 3D com contas de 20 nanômetros. A barra de escala é de 20 micrômetros.Prossiga depois de configurar hardware e software para varrer o espelho galvo. Este é o software de varredura galvo espelho para a configuração. Providencie uma imagem completa de campo de visão, configurando Vmin para menos 500 milvolts.Em seguida, definir Vmax para 500 milvolts. Em seguida, mude para o software de aquisição da câmera. No modo de gatilho selecione Externo.No menu suspenso LightScan PLUS selecione Down Next, clique em Controle de velocidade de varredura. Certos parâmetros de controle agora podem ser definidos. Sob a altura da janela entre 180 linhas.Em Exposição insira 28 milissegundos. Quando feito, retorne ao software de controle de espelhos. No interruptor de software de controle de espelho em pilhas 3D ON. Especifique o número de pilhas e o tamanho da etapa.Clique em tirar vídeo para começar a gravar imagens. Este é um exemplo de imagem Epi de DNA rotulado de um único fio. Em contraste, a técnica de ladrilho varrido altamente inclinado produziu esta imagem.A imagem HIST mostra menos fundo em comparação com a imagem Epi. O DNA está em um hidrogel 3D, e o comprimento de onda de excitação é de 638 nanômetros. Aqui está uma imagem Epi do fator de alongamento de tradução eucariótica rotulado 2.A imagem HIST melhorou a relação sinal-fundo. Também tem iluminação mais uniforme. Ambos têm o mesmo poder de iluminação de 7,5 miliwatts.As velocidades de imagem foram de 2,5 quadros por segundo. É importante manter constantemente um ângulo de alta inclinação e sincronizar o espelho de varredura com a leitura da câmera. Isso garante uma alta relação sinal-fundo durante a aquisição de imagens.Esperamos que a microscopia HIST beneficie várias aplicações, incluindo imagens de super resolução em profundidades de imagem mais profundas e perfil de expressão genética de alto rendimento em fatias de tecido grosso.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

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