Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal
June 1st, 2019
Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.
Meu laboratório está interessado em mecanobiologia, que examina como as células se exercitam e são influenciadas por forças mecânicas. Uma maneira de quantificar a mecanobiologia é medir a contratilidade celular. Nas células aderentes, a contratlidade se manifesta em forças de tração exercidas no substrato celular. Quantificamos essas forças usando uma metodologia geralmente referida como microscopia de força de tração ou TFM. E tfm é implementado em uma ampla variedade de métodos diferentes, mas um aspecto comum é que é uma técnica de laboratório bastante serial e lenta feito tipicamente em um único prato como este aqui. Isso nos restringe a avaliar uma população ou condição de cada vez. Ao longo da cultura celular foi melhorado há algum tempo, mas criar pratos multiwell e pensamos, não seria ótimo que pudéssemos para tfm com o mesmo rendimento aumentado e a mesma eficiência de tempo e reagentes? E essa era nossa solução. Então criamos um prato de força de tração 96 bem. E se parece muito com um prato convencional de cultura de tecido 96, no entanto, com este prato podemos não só examinar 96 condições diferentes de cultura celular, mas também quantificar sua contratilidade celular. Isso apresenta uma solução de throughput muito maior do que abordagens de prato único, permitindo-nos examinar diversas condições celulares e respostas contratuais. Durante a metástase do câncer, as células cancerígenas viajam de seu local principal para locais secundários, espalhando a doença em nosso corpo. Esse comportamento metastático das células cancerosas é responsável por 90% da morte relacionada ao câncer. Um dos mecanismos propostos para que as células cancerígenas epiteliais adquiram um fenótipo mais migratório e invasivo é a transição epitelial-mesenquimal, EMT. Durante o EMT, eles se tornam mais migratórios e invasivos, mudando seu comportamento físico. Para entender melhor essas mudanças no comportamento físico, utilizamos nosso substrato de silício macio para medir mudanças na contratilidade das células da glândula mamária do rato com indução de EMT pela TGF-Neste estudo, investigamos como diferentes concentrações e tempo de incubação do comportamento físico das células TGF-afet. Polidimtilsiloxano é uma borracha muito compatível com o módulo mais baixo de Young de cerca de 0,6 quilopascal. A rigidez deste material também pode ser incapaz de usar diferentes concentrações de agente crosslink, incluindo SYLGARD 184.To medir propriedades mecânicas do PDMS usamos um reômetro. Depois de misturar a parte A e a parte B do PDMS, em uma relação de peso de um para um e adicionar o agente de cura com a porcentagem de peso especificada, carregue o lote preparado na placa de reômetro. Certifique-se de carregar o suficiente da amostra para cobrir completamente a área do eixo. É importante ter certeza de que o fuso toca a amostra completamente sem espaço livre na borda. Qualquer amostra extra deve ser cuidadosamente aparada e limpa da placa. Meça o módulo final de armazenamento e a dependência de tempo da viscoelasticidade de cada amostra fazendo varreduras de tempo e frequência em uma cepa de cisalhamento oscilatória de 0,5%Newsha]Este gráfico é um exemplo de teste seq de tempo, tendo feito para medir o comportamento reológico de polidimtilsiloxano com cepa de cisalhamento oscilatória aplicada de 0,5% e temperatura de 100
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Visão Geral
Este estudo apresenta um ensaio de força de tração de alto rendimento fabricado com borracha de silicone (PDMS), projetado para investigar mudanças físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos. A utilidade do método é demonstrada através da medição de aumentos dependentes de TGF-β na contratilidade durante a transição epitelial-mesenquimal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Biomecânica
- Engenharia biomédica
Fundamentos
- A contratilidade celular é crucial em vários processos biológicos.
- Entender as mudanças na contratilidade pode fornecer insights sobre doenças.
- Métodos tradicionais podem carecer de rendimento e sensibilidade.
- PDMS é um material versátil para a criação de ensaios.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio de alto rendimento para medir a contratilidade celular.
- Avaliar o impacto do TGF-β na contratilidade durante a transição epitelial-mesenquimal.
- Fornecer um método confiável para estudar o comportamento celular em várias condições.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um ensaio de força de tração usando PDMS.
- Medição da contratilidade celular em resposta ao TGF-β.
- Análise de alto rendimento para avaliar múltiplas amostras.
- Avaliação da dinâmica da transição epitelial-mesenquimal.
Principais Resultados
- Medição bem-sucedida de mudanças na contratilidade celular.
- Demonstrou aumentos dependentes de TGF-β na contratilidade.
- Validou a utilidade do ensaio baseado em PDMS.
- Forneceu insights sobre a mecânica dos processos de transição celular.
Conclusões
- O ensaio de força de tração PDMS é eficaz para estudar a contratilidade celular.
- O aumento da contratilidade durante a transição epitelial-mesenquimal foi confirmado.
- Este método pode ser aplicado a vários estudos biológicos e biomédicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
