Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal
1 de junho de 2019
Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.
Meu laboratório está interessado em mecanobiologia, que examina como as células se exercitam e são influenciadas por forças mecânicas. Uma maneira de quantificar a mecanobiologia é medir a contratilidade celular. Nas células aderentes, a contratlidade se manifesta em forças de tração exercidas no substrato celular. Quantificamos essas forças usando uma metodologia geralmente referida como microscopia de força de tração ou TFM. E tfm é implementado em uma ampla variedade de métodos diferentes, mas um aspecto comum é que é uma técnica de laboratório bastante serial e lenta feito tipicamente em um único prato como este aqui. Isso nos restringe a avaliar uma população ou condição de cada vez. Ao longo da cultura celular foi melhorado há algum tempo, mas criar pratos multiwell e pensamos, não seria ótimo que pudéssemos para tfm com o mesmo rendimento aumentado e a mesma eficiência de tempo e reagentes? E essa era nossa solução. Então criamos um prato de força de tração 96 bem. E se parece muito com um prato convencional de cultura de tecido 96, no entanto, com este prato podemos não só examinar 96 condições diferentes de cultura celular, mas também quantificar sua contratilidade celular. Isso apresenta uma solução de throughput muito maior do que abordagens de prato único, permitindo-nos examinar diversas condições celulares e respostas contratuais. Durante a metástase do câncer, as células cancerígenas viajam de seu local principal para locais secundários, espalhando a doença em nosso corpo. Esse comportamento metastático das células cancerosas é responsável por 90% da morte relacionada ao câncer. Um dos mecanismos propostos para que as células cancerígenas epiteliais adquiram um fenótipo mais migratório e invasivo é a transição epitelial-mesenquimal, EMT. Durante o EMT, eles se tornam mais migratórios e invasivos, mudando seu comportamento físico. Para entender melhor essas mudanças no comportamento físico, utilizamos nosso substrato de silício macio para medir mudanças na contratilidade das células da glândula mamária do rato com indução de EMT pela TGF-Neste estudo, investigamos como diferentes concentrações e tempo de incubação do comportamento físico das células TGF-afet. Polidimtilsiloxano é uma borracha muito compatível com o módulo mais baixo de Young de cerca de 0,6 quilopascal. A rigidez deste material também pode ser incapaz de usar diferentes concentrações de agente crosslink, incluindo SYLGARD 184.To medir propriedades mecânicas do PDMS usamos um reômetro. Depois de misturar a parte A e a parte B do PDMS, em uma relação de peso de um para um e adicionar o agente de cura com a porcentagem de peso especificada, carregue o lote preparado na placa de reômetro. Certifique-se de carregar o suficiente da amostra para cobrir completamente a área do eixo. É importante ter certeza de que o fuso toca a amostra completamente sem espaço livre na borda. Qualquer amostra extra deve ser cuidadosamente aparada e limpa da placa. Meça o módulo final de armazenamento e a dependência de tempo da viscoelasticidade de cada amostra fazendo varreduras de tempo e frequência em uma cepa de cisalhamento oscilatória de 0,5%Newsha]Este gráfico é um exemplo de teste seq de tempo, tendo feito para medir o comportamento reológico de polidimtilsiloxano com cepa de cisalhamento oscilatória aplicada de 0,5% e temperatura de 100
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Visão Geral
Este estudo apresenta um ensaio de força de tração de alto rendimento fabricado com borracha de silicone (PDMS), projetado para investigar alterações físicas na contratilidade celular durante diversos processos biológicos. A utilidade do método é demonstrada por meio da medição de aumentos dependentes de TGF-β na contratilidade durante a transição epitelial para mesenquimal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Biomecânica
- Engenharia biomédica
Contexto
- A contratilidade celular é fundamental em diversos processos biológicos.
- O entendimento das alterações na contratilidade pode fornecer insights sobre doenças.
- Os métodos tradicionais podem apresentar baixa produtividade e sensibilidade insuficiente.
- O PDMS é um material versátil para a criação de ensaios.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio de alto rendimento para medir a contratilidade celular.
- Avaliar o impacto do TGF-β na contratilidade durante a transição epitelial-mesenquimal.
- Fornecer um método confiável para estudar o comportamento celular em diversas condições.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um ensaio de força de tração utilizando PDMS.
- Medição da contratilidade celular em resposta ao TGF-β.
- Análise de alto rendimento para avaliar múltiplas amostras.
- Avaliação da dinâmica da transição epitelial para mesenquimal.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida de alterações na contratilidade celular.
- Comprovado aumento da contratilidade dependente de TGF-β.
- Validada a utilidade do ensaio baseado em PDMS.
- Fornecidos insights sobre a mecânica dos processos de transição celular.
Conclusões
- O ensaio de força de tração em PDMS é eficaz para estudar a contratilidade celular.
- Foi confirmado o aumento da contratilidade durante a transição epitelial para mesenquimal.
- Este método pode ser aplicado a diversos estudos biológicos e biomédicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma de microscopia de força de tração de alto rendimento permite a avaliação quantitativa da contratilidade celular em um formato escalável, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao associar a transição epitelial-mesenquimal induzida por TGF-β a alterações biofísicas mensuráveis, o método oferece valor preditivo para a validação de alvos na pesquisa de fibrose e metástase. O sistema baseado em PDMS oferece reprodutibilidade e compatibilidade com fluxos de trabalho existentes em multiplacas, aumentando a reutilização em larga escala nos processos de biologia de descoberta e desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar o TGF-β como modulador da contratilidade celular durante a EMT, apoiando testes de hipóteses sobre alvos.
- Valor Operacional: Fornece dados de contratilidade dependentes de dose e resolvidos no tempo, para priorizar alvos mecanicistas nas vias de fibrose e câncer.
- Valor Preditivo: Quantifica fenótipos biofísicos associados à EMT, auxiliando na seleção pré-clínica de alvos e na redução de riscos nas vias metabólicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas de contratilidade independentes do substrato para padronização de ensaios em triagens de mecanobiologia.
- Valor Operacional: Compatível com formatos de 96 poços, permitindo triagem paralela de bibliotecas de compostos ou doses de citocinas.
- Prontidão do Ensaios: Utiliza substratos de PDMS estáveis e inertes com módulo ajustável (0,4–100 kPa) e vida útil indefinida, reduzindo a variabilidade entre lotes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona a dose e duração do TGF-β com a produção contrátil, apoiando modelos pré-clínicos alinhados a biomarcadores de EMT.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação de alterações na contratilidade como leitura funcional em sistemas relevantes para a doença antes da validação in vivo.
- Avanço com Base em Risco: Apoia decisões de prosseguir ou não ao correlacionar intervenções moleculares com a modulação de fenótipos biofísicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo leituras biofísicas que orientam a tomada de decisões nas fases iniciais.
- Biologia de Descoberta: Apoia o teste de hipóteses sobre os efeitos da sinalização de TGF-β na mecânica celular e contratilidade.
- Triagem: Permite a quantificação de alto rendimento e reprodutível de forças de tração em formatos multi-poço para análise de resposta à dose.
- Análise: Gera métricas de contratilidade (magnitude e distribuição da força) que permitem comparar concentrações de TGF-β e tempos de exposição.
- Pesquisa Translacional: Conecta a indução de EMT in vitro a alterações biomecânicas mensuráveis, apoiando a relevância do modelo pré-clínico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de força de tração aplicável entre diferentes tipos celulares e alvos de mecanobiologia em oncologia e fibrose.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade em fenótipos mecanobiológicos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de substratos padronizados de PDMS e compatibilidade com placas de múltiplos poços.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir testes paralelos de condições e reduzir o consumo de reagentes por ponto de dado.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base em deslocamentos quantitativos da contratilidade durante transições patogênicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células, análise de imagens de microscopia de força de tração (TFM) e preparação de substratos de PDMS.
- Depende da reometria para caracterização do substrato e da microscopia de fluorescência para quantificação das forças de tração.
- Necessita padronização da densidade de semeadura, funcionalização do substrato e condições de imagem entre os poços.
- A adaptação a diferentes tipos celulares pode exigir otimização da rigidez do substrato e dos ligantes de adesão.
- As limitações práticas incluem a uniformidade da espessura do substrato e a possível autofluorescência do PDMS em certos comprimentos de onda.
