Name: Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Aprenda microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS para medir contratilidade celular durante a transição epitelial-mesenquimal induzida por TGF-β. Este método avança pesquisas em biologia celular e engenharia biomédica.

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Os autores agradecem a Tom Kodger, Michael Landry, e Christopher J. Barrett para obter assistência com a síntese do cordão. A.J.E. reconhece as bolsas do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Instituto canadense de pesquisa em saúde conceder n º 143327, sociedade canadense de câncer conceder n º 703930, e Fundação Canadense para a inovação #32749 do projeto. R. Denilson reconhece os institutos nacionais de saúde não conceder. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. foi apoiado por Fonds de Recherche Santé Québec, e Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Os autores agradecem a Johanan Idicula pela ajuda com o vídeo e o manuscrito e Zixin ele para obter ajuda na preparação do vídeo.

Nota: o protocolo a seguir guiará pesquisadores na fabricação e uso do prato TFM de vários poços mostrado na Figura 1.
1. preparação de substratos de silicone PDMS
<ol><li>Preparação da mistura da borracha de silicone de PDMS baseada em uma mistura composta de dois jogos comercialmente disponíveis.<ol>
<li>Adicione a parte A e a parte B do kit PDMS (por exemplo, GEL-8100, consulte a tabela de materiais) em uma relação de peso 1:1 no tubo de 50 ml. Nota: a mistura é misturada em um rotator em uma velocidade lenta bastante para que a mistura flua para a frente e para trás durante a volta para assegurar a mistura completa.</li>
		<li>Adicione a quantidade necessária de agente de cura para o módulo desejado do substrato. Nota: a quantidade de agente de cura a ser adicionada à mistura depende do módulo desejado da carcaça e pode tipicamente variar de 0,1% a 1,8%. Consulte a tabela 1 e a Figura 3 para obter um guia para as concentrações específicas do chapéu cabeado e os moduli resultantes.</li>
		<li>Misture a formulação no rotador por 30-45 min; garantir a rotação é lenta o suficiente para a mistura completa.</li>
	</ol></li>
	<li>Camada inferior: revestimento de substratos PDMS na corrediça de vidro<ol>
<li>Coloque o mandril personalizado-construído ilustrado na Figura 2 no spin-Coater. Limpe o vidro com etanol ou isopropanol e seque com uma limpeza sem fiapos. Coloc a corrediça de vidro no mandril e gire sobre o vácuo para prender a corrediça no lugar.</li>
		<li>Aplique PDMS não curado aproximadamente 1 cm das bordas e trabalhe em direção ao centro. Aplique o suficiente (3-4 mL) PDMS para garantir que toda a superfície será coberta. Nota: para garantir que o PDMS é uniformemente espalhado na superfície do vidro, uma ponta de pipeta pode ser útil para espalhar a mistura PDMS do centro para as bordas.</li>
		<li>Gire o vidro com a mistura de PDMS em um spin-Coater com o seguinte protocolo.<ol>
<li>Para espalhar o PDMS não curado na corrediça, acelere em 50 rpm/s de 0 a 200 rpm; Segure em 200 rpm por 1 min.</li>
			<li>Para alcançar uma camada de PDMS de 100 μm de espessura, acelere a 50 rpm/s para 300 rpm e segure por 1 min a 300 rpm. Diferentes espessuras desejadas que não 100 μm exigirá valores de velocidade específicos.</li>
			<li>Para remover, desacelere em 50 rpm/s a 0 rpm. Desactive o aspirador e retire a lâmina revestida, tomando cuidado para não tocar na superfície revestida. Nota: é importante incluir as etapas da aceleração e da desaceleração para assegurar uma superfície contínua lisa. Cuidado: para assegurar que a amostra não voe fora do mandril, o suporte feito-à-medida deve ser usado para prender a corrediça, e para não confiar simplesmente no vácuo e no mandril liso existente. Os detalhes e especificações deste suporte são dados na Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque a amostra revestida com centrifugação no forno à temperatura recomendada pelo fabricante (100 ° c) durante 2 h. Nota: a superfície do forno onde a amostra é colocada deve ser sólida (ou seja, não um rack de arame) e superfície nivelada para garantir o aquecimento uniforme e a espessura da amostra. Uma placa cerâmica ou de aço faz uma superfície ideal.</li>
	</ol></li>
	<li>Camada superior do grânulo<ol>
<li>Adicione a solução do grânulo na relação apropriada à mistura restante de PDMS. Nota: esta relação depende da concentração da solução de talão de ações e da densidade de cordão desejada na amostra. Os valores finais típicos são 9,2 x 1011 grânulos/ml e 0.05-0.2 grânulos/μm2, e um excesso dos grânulos é geralmente preferível a uma quantidade inadequada.</li>
		<li>Misture a solução de cordão com o PDMS não curado. Isto pode ser conseguido coloc o tubo em um rotator por aproximadamente 30 minutos, vortexing para 1-2 minutos, ou sonication por 30 minutos. Esses métodos podem ser combinados. Nota: em nossa aplicação, nós achamos que sonication é eficaz em quebrar grânulo agregados, e rotação é eficaz na mistura. Contas fiduciárias sintetizadas podem agregar no armazenamento. Antes de usar, eles podem ser ressuscitados em hexano e sonicated. Se existirem grandes agregados significativos, pode-se filtrar a suspensão do cordão através de um filtro de seringa de 5 μm. Esta etapa da filtração é opcional; ajuda a revestir a amostra com grânulos monodispersos, mas uma fração significativa de grânulos pode ser perdida no filtro.</li>
		<li>Retire o slide do forno, deixe esfriar a temperatura ambiente, e colocá-lo no spin-Coater.</li>
		<li>Adicione 3-4 mL do talão e a mistura de PDMS não curada na superfície da amostra revestida. Nota: a mistura com grânulos adicionados é menos viscosa devido ao hexano. Certifique-se de não tocar na superfície do substrato, pois pode danificar o substrato PDMS já revestido. Adicionalmente, a mistura do grânulo não pode inicialmente molhar a superfície; Tome cuidado para que a mistura não flua imediatamente para fora da superfície de PDMS curada.</li>
		<li>Gire o exemplo com o seguinte protocolo.<ol>
<li>Para espalhar o grânulo e a mistura uncured de PDMS, acelere em 100 RPM/s de 0 a 500 rpm; Segure em 500 RPM por 1 min.</li>
			<li>Para conseguir uma camada fina de PDMS grânulo-encaixado (~ 1 μm), acelere em 200 rpm/s de 500 a 5000 rpm; segurar a 5000 rpm por 10 s.</li>
			<li>Para remover, desacelere em 100 RPM/s a 0 rpm. Desabilite o vácuo e remova a corrediça revestida, tomando o cuidado para não tocar na superfície revestida.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque a amostra revestida com centrifugação no forno a 100 ° c durante 1 h. Nota: temperaturas acima de 100 ° c ou durações maiores que 1 h podem reduzir a fluorescência do cordão. Certifique-se de que a temperatura do forno está definida para 100 ° c e não superior.</li>
		<li>O protocolo pode ser pausado aqui. Para armazenar a amostra, cubra a superfície para evitar a exposição à poeira e à luz. Certifique-se de que nada toque na superfície. A amostra é prateleira-estábulo na temperatura ambiente indefinidamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem da placa<ol>
<li>Adicione a parte A (base) e a parte B (agente de cura, por exemplo, Sylgard) de um kit de elastômero PDMS em uma relação de peso 10:1 no tubo de 50 mL.</li>
		<li>Misture a mistura no rotador por 30-45 min. Nota: para uma placa, misture 5 mL de base com 0,5 mL de agente de cura. Pode ser adicionado até 1 mL de hexano para reduzir a viscosidade da mistura.</li>
		<li>Aplique a mistura na parte inferior do divisor e espalhe a mistura. Nota: o divisor deve ser colocado de cabeça para baixo.</li>
		<li>Coloque o substrato sobre o divisor de cabeça para baixo.</li>
		<li>Coloque a amostra de cabeça para baixo no forno a 65 ° c durante 2 h.</li>
		<li>Retire as amostras do forno e limpe a parte inferior do vidro com 70% de etanol ou isopropanol para remover qualquer resíduo PDMS. Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. Para armazenar a amostra, coloque uma tampa no substrato e enrole o dispositivo em folha de alumínio para evitar a exposição à luz. A amostra é prateleira-estábulo na temperatura ambiente indefinidamente. O divisor utilizado neste método está em um formato 96-well; no entanto, os pesquisadores podem empregar outros formatos (384-bem, 2-bem, 4-bem, 8-bem, etc.) dependendo das configurações de experimento desejadas e disponibilidade de estruturas divisórias. Algumas outras otimizações podem ser necessárias.</li>
	</ol></li>
</ol>2. funcionalização de superfície
<ol><li>Dissolver 80 μL de uma alíquota de sulfo-SANPAH em 40 mL de tampão HEPES de 0,1 M (pH 7-9). Nota: prepare alíquotas de sulfo-SANPAH dissolvendo 100 mg de sulfo-SANPAH em pó em 2 mL de dimetil sulfóxido estéril (DMSO). Prepare 0,1 M tampão HEPES diluindo 50 mL de HEPES em 450 mL de água desionizada estéril e filtre através de um filtro de poros de 0,22 μm.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de solução diluída de sulfo-SANPAH a cada poço da placa de 96 poços.</li>
	<li>Expor a placa à luz UV (300-460nm) na distância e na duração apropriadas. Nota: após a exposição UV, a cor da solução deve ser mais escura. A distância e a duração UV da exposição dependem do poder da lâmpada UV. Em nossa aplicação, exporemos para 10-15 min a uma distância de 5 cm.</li>
	<li>Retire a solução de sulfo-SANPAH dos poços e adicione 200 μL de solução de fibronectina de 5 μg/mL a cada poço. Nota: a proteína especific investigador pode ser usada para o revestimento de superfície. Algumas proteínas comumente usadas são colágeno, fibronectina e laminina. Nós encontramos sulfo-SANPAH para ser o método o mais eficaz, e a limpeza do plasma quando empregando às vezes em PDMS é desencorajado porque cria uma camada do dióxido de silicone e danifica visivelmente a superfície.</li>
	<li>Incubar a placa a 4 ° c durante a noite. Nota: diferentes métodos de incubação podem ser aplicados dependendo da proteína utilizada para o revestimento.</li>
	<li>Retire a solução de fibronectina e lave cada poço com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) duas vezes.</li>
	<li>Coloque uma tampa na amostra.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de PBS a cada poço. Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. As amostras revestidas com fibronectina podem ser armazenadas a 4 ° c por até 2 semanas.</li>
</ol>3. esterilização UV
<ol><li>Esterilize a amostra a luz UV em um armário de segurança biológico por 30 minutos. Nota: os tempos de exposição UV mais longos podem impactar negativamente a fluorescência do grânulo. Todas as etapas subsequentes devem ser executadas em condições estéreis.</li>
</ol>4. cultura de células
<ol><li>Remova PBS de cada poço e adicione 200 μL das pilhas suspendidas nos meios de cultura a cada poço.<ol>
<li>Placa as células na densidade da célula desejada. A densidade da célula depende do experimento desejado. Para estudos de célula única, as células devem ser mínimas de 50 μm de distância e as células próximas às bordas da janela de imagem não devem ser incluídas na medição de TFM. Para células monocamada, a janela de imagem deve ter o campo de visualização coberto com uma camada confluente de células.</li>
		<li>Prepare os meios de cultura de crescimento completo para células NMuMG completando DMEM com 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL de insulina, 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mM L-glutamina, e 0,5 μg/mL de anfotericina B.</li>
		<li>Prepare o caldo de insulina reconstituindo-se em água acidificada (2,5 mL de ácido acético glacial em 130 mL de água desionizada) para uma concentração de 10 mg/mL. Armazene a solução de estoque a 4 ° c. Aguarde até que a solução esteja limpa e, em seguida, filtre por um filtro de poros de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adição de TGF-β<ol>
<li>Para preparar o estoque de TGF-β, dissolver 2 μg de TGF-β em 100 μL de ácido cítrico de 10 mM (pH 3,0) e esterilizar filtro com 0,22 μm de poros. Vórtice do tubo e alíquota para os volumes desejados. Guarde as alíquotas em-80 ° c.</li>
		<li>Adicionar 1,5 μL de solução de TGF-β para 10 mL do meio de cultura celular completo para constituir o meio de cultura celular com a concentração final de TGF-β de 3 ng/mL. Nota: para fazer 10 mM pH 3,0 ácido cítrico, diluir o ácido na água e ajustar o pH para 3,0, adicionando HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. aquisição de dados
<ol><li>Para cada posição, adquira pelo menos uma imagem de partículas e células fiduciárias. Concentre-se na camada de talão. Nota: o tamanho do pixel deve ser otimizado com base no tamanho das partículas fiduciárias e do método de processamento de imagem que está sendo usado. Nesta aplicação, os autores usam um objetivo de 10x 0,4 NA, e as imagens são adquiridas com 1024 x 1024 de resolução, com 455 nm/pixel. Em geral, é útil manter uma resolução de pelo menos aproximadamente 1-5 pixels por talão; aqui, os grânulos são altamente e têm um tamanho individual de 300-500 nanômetro. É crítico que os grânulos fiduciários fluorescentes estejam no foco para que as imagens sejam usadas para cálculos de TFM. A qualidade do foco e da imagem latente dos grânulos deve ser priorizada sobre a imagem latente as pilhas elas mesmas. Não deve haver nenhum cross-talk entre os canais diferentes, particularmente toda a fluorescência não das contas fiduciário que aparece nos espectros da imagem latente dos grânulos.</li>
	<li>Uma vez que todas as posições do interesse foram gravadas, adicione a solução do destacamento a cada poço para adquirir imagens Force-Free da referência das partículas fiduciário.<ol>
<li>Para preparar a solução de descolamento celular, misture uma solução aquosa contendo 2% de TritonX-100, azida sódica de 50 mM e hidróxido de potássio de 500 mM. Nota: o acima é fornecido como um exemplo de uma solução eficaz do destacamento. Diferentes soluções de descolamento a critério dos pesquisadores podem ser usadas para separar as células da superfície do substrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análise de imagem
<ol><li>Realize a análise de imagem apropriada conforme desejado. Nota: o software de análise foi desenvolvido em casa. A análise da imagem pode ser feita com software ou software feito-à-medida disponível em linha.</li>
</ol>7. síntese do grânulo
Nota: o protocolo a seguir é baseado no método de síntese descrito por Klein et al.10.
<ol><li>uma capa de fumaça, prepare o balão de três-pescoço com um condensador de refluxo refrigerado a água. Cuidado: Configure uma síntese em uma capa de fumaça química bem ventilada.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de estabilizador PDMS e fluoróforo ao balão.</li>
	<li>Equipar um pescoço com um septo de borracha com uma agulha de entrada de nitrogênio e uma agulha de saída e equipar o outro pescoço com um septo de borracha para adicionar Reagente com uma seringa.</li>
	<li>Adicionar 100 mL de hexano anidro em 250 mL ao balão e adicionar uma pequena barra de agitação magnética.</li>
	<li>Colocar o balão no banho de óleo mineral a 75 ° c e limpá-lo com gás nitrogenado durante 1 h.</li>
	<li>Adicione 6 mL de metilmetacrilato a um balão de fundo redondo de 25 mL.</li>
	<li>Adicionar 0,100 g de 2, 2 '-azobisisobutyronitrila (AIBN) para o balão de fundo redondo e purgar a mistura com gás nitrogênio para 1 h. Nota: o methylamethacrylate nivelado através da coluna pré-embalada para remover nervos inibidores antes de usar. Adicione o methylamethacrylate e a mistura de AIBN ao balão do três-garganta.</li>
	<li>A solução inicialmente fica turva e vira leitosa. Deixe a reacção funcionar durante 3 h após a solução ficar turva.</li>
	<li>Depois de 3 h, coloque o balão num banho de água gelada.</li>
	<li>Vácuo-filtre a solução com papel de filtro grosseiro.</li>
	<li>Centrifugue o filtrado e Resuspenda as partículas em hexano. Nota: o volume do hexano a ser adicionado depende da concentração desejada da solução de cordão. Sonication facilita a re-dispersão das partículas de cordão em solução de hexano. Os grânulos produzidos pelos autores têm diâmetros do altamente de aproximadamente 300-500nm. Devido ao uso de cross-correlação padrão de rastreamento para determinar deslocamentos, monodispersas grânulos não são necessários.</li>
</ol>8. protocolo de medição de reologia
Nota: a reologia não é necessária para cada pesquisador ou experimento, mas é necessária para quantificar os moduli para novas formulações de PDMS. Neste protocolo, nós empregamos um Reômetro da tesoura para medir os efeitos do crosslinker, da freqüência, e da tensão em moduli de amostras de PDMS. Dependendo das ferramentas e da perícia disponíveis, os moduli podem igualmente ser medidos usando muitas outras aproximações mecânicas da análise. Adicionalmente, os pesquisadores que utilizam este protocolo podem optar por usar nossos moduli publicados apresentados na tabela 1, Figura 3 e Figura 4.
<ol><li>Use um Reômetro com uma geometria de placa paralela de 25 mm de diâmetro. Outras geometrias podem ser usadas.</li>
	<li>Inicializar o sistema e calibrar o dispositivo e sistema de medição (placa paralela, d = 25 mm). Depois de medir a lacuna zero, comece a carregar a amostra PDMS.</li>
	<li>Assim que o elastômero PDMS e o agente de reticulação foram misturados, Pipet a mistura na placa inferior do Reômetro.<ol>
<li>Mova o eixo para baixo para entrar em contato completamente com a parte superior da amostra PDMS.</li>
		<li>Cuidadosamente aparar o excesso de amostra carregada da placa de fundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em um teste de varredura de deformação, aplique tensões crescentes para cada composição com diferentes densidades de reticulação para garantir que a estrutura do polímero permaneça no regime viscoelástico linear durante todas as medições de cisalhamento. Nota: os valores de deformação relevantes para estudos de células são tipicamente na faixa de 0,1-10%. Nós encontramos PDMS para ser linear até aproximadamente 100% estirpe.</li>
	<li>Meça o módulo de armazenamento dinâmico de cisalhamento (G ') e o módulo de perda (G ′ ′) da rede PDMS em um teste de varredura de tempo com frequência de 1 Hz e tensão de cisalhamento oscilatória de 0,5% a 100 ° c.</li>
	<li>Para determinar a dependência de viscoelasticidade e tempo da rede PDMS final, aplique um teste de varredura de frequência com frequência variando de 0,1-100 Hz e deformação oscilatória de cisalhamento de 0,5%.</li>
</ol>

<ol><li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+in+locomoting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li>
<li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572(2012).</li>
<li>Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449(2013).</li>
<li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Stochastic%2C+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li>
<li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li>
</ol>

A AJE e a RK têm interesse em Live Cell Technologies, empresa que fabrica materiais descritos neste artigo.

Para o sucesso deste método, é crítico ter uma amostra uniformemente revestida com uma espessura constante de aproximadamente 100 μm. O módulo deve ser cuidadosamente escolhido para examinar o significado físico do sistema biológico de interesse. Ao fabricar uma camada superior, a concentração das partículas fluorescentes de autenticação deve ser otimizada para uma análise precisa do esforço de deslocamento e tração. A análise de células isoladas únicas requer uma camada fiduciária mais densa do que a medição de monolama...

A contratilidade do acto-miosina é um elemento essencial da mecânica celular ativa, impactando os comportamentos celulares da motilidade e proliferação para a diferenciação das células-tronco. Nos tecidos, a contratilidade impulsiona a atividade da separação polar na embriogênese, à constrição das vias aéreas e à atividade cardíaca. Criticamente, para gerar tensão, as células devem primeiro aderir ao seu ambiente extracelular. Ao fazê-lo, essa contratilidade gera forças de tração em seus arredores. A microscopia da força da tração (TFM) emergiu em uma multidão de formulários como uma maneira de quantificar estas forças das pilhas diversas circunstâncias diferentes.
O campo da TFM tem visto uma amplitude excepcional de inovação e aplicação, e os resultados têm pavimentado o caminho para novas perspectivas na biologia, que incorporam mecânica e forças físicas. Começando com enrugamento de substratos de silicone1, pesquisadores têm aplicado várias técnicas para medir as forças de tração celular. Estas abordagens têm sido continuamente melhoradas e alcançaram agora um nível de resolução na ordem de vários mícrons2. No entanto, surgiu um problema principal, que é a dificuldade em criar substratos de moduli adequadamente baixo usando os silicones disponíveis. Para contornar esse problema, a poliacrilamida foi adotada como um substituto devido à facilidade de criação de substratos na ordem de 1-20 kPa3. Recentemente implementamos silicones muito complacentes em TFM4, permitindo-nos fabricar a mesma gama de moduli como poliacrilamida, mas com as vantagens de silicone inerte e robusto.
As aproximações de TFM permitiram descobertas mechano-biológicas valiosas, entretanto, um lacuna persistente são sua complexidade, restringindo frequentemente seu uso aos investigadores nas disciplinas da engenharia ou das ciências físicas. Isto é devido em grande parte às calibrações detalhadas e cálculos desafiadores que são necessários para quantificar a contratilidade. Outro desafio significativo é que os métodos de TFM são em grande parte baixa taxa de transferência e, portanto, mal adaptados para estudar muitas condições diferentes ou populações simultaneamente5. Isso tem apresentado um gargalo, que tem dificultado a transferência de TFM a partir de um especialista em Biofísica configuração em aplicações biológicas e farmacológicas mais amplas.
Desenvolvemos recentemente uma placa TFM de formato multi-bem, que permite aos pesquisadores paralelizar suas medições de TFM para uma quantificação mais rápida das métricas de contratilidade, explorando o impacto de diferentes compostos e também usando menos reagentes4 . Esta metodologia tem ampla utilidade em diversos estudos de mecanobiologia, desde a avaliação dos efeitos de compostos na atividade celular, até a quantificação das alterações contrátil da diferenciação ou da doença.
Uma área de pesquisa biomédica que beneficiará grandemente da TFM é o estudo de como as pistas físicas impactam os fenótipos malignos das células cancerosas. A metástase, responsável para 90% de mortes Cancer-relacionadas, é caracterizada por pilhas cancerosas que saem de seu local original do tumor e que colonizar um local secundário. Para que as células migrem através do tecido e passem dentro e fora do sistema vascular, eles devem mudar radicalmente suas formas para espremer através dessas barreiras físicas, gerando forças substanciais para puxar seu caminho ao longo da matriz extracelular ou mover-se entre outros Células. Essas forças são transmitidas ao substrato por meio de interações de adesão focal2,3, podendo ser quantificadas usando TFM. Embora os cânceres sejam bioquimicamente excepcionalmente diversificados, com um repertório em expansão de mutações conhecidas e alterações protéicas, algumas mudanças físicas comuns foram observadas; em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de mama, próstata e pulmão, as células metastáticas têm demonstrado exercer 2-3 vezes as forças de tração das células não metastáticas6,7,8. Estes resultados sugerem que pode haver uma forte correlação entre a progressão metastática e as forças de tração exercidas pelas células; Entretanto, as mudanças tempo-dependentes detalhadas na contractilidade são difíceis de examinar.
A transição epitelial-mesenquimais (EMT) é um processo pelo qual as células reduzem aderências-e aderência da célula celular mediada pela junção apertada, tornando-se mais migratórias e invasivas. Além de funções fisiológicas que incluem cicatrização de feridas e processos de desenvolvimento, o EMT também é um processo explorado durante a metástase, tornando-se um sistema de modelo útil para estudar esse processo. Usando TGF-β, podemos induzir o EMT em células epiteliais mamárias murinas (NMuMG)9 para quantificar diretamente as alterações físicas durante essa transformação, e caracterizar o tempo e os efeitos dose-dependentes de TGF-β em EMT e contratilidade celular. Neste artigo, nós Demonstramos a utilidade desta aproximação medindo as mudanças na contractilidade durante um EMT induzido.

<table><tbody><tr><td>Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GEL-8100</td><td>Nusil Technology</td><td>GEL-8100</td><td>Kit de gel de silicone macio e dielétrico de alta pureza</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Encapsulante de silicone transparente 0,5 kg</td><td>Kit Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td>agente de cura</td></tr><tr><td>Custom Cut Glass&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Company</td><td></td><td>109.6mm&plusmn; x 72.8mm&plusmn; x 1mm espessura</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa de Nylon Target 2TM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F2513-4</td><td></td></tr> Suporte de Tira de Caixa de <tr><td>Ovos Stripwell de 96 poços Tampa</td> Universal de Microplaca de Poliestireno <td>Corning</td><td>2572</td><td></td></tr><tr><td>Com Entalhe de Canto&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3099</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EA95</td><td>0.95</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td>ACS reagente, &ge; 99,5% < / fonte ></td></tr> <tr><td>< forte > revestimento de superfície< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Plasma bovino de fibronectina</td><td>Solução Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>, filtrada estéril, BioReagent, adequada para cultura de células</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>pH 7,4, sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>4.5g/L glicose, com L-glutamina, piruvato de sódio e vermelho de fenol</td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>Qualidade Premium,&nbsp; Endotoxina < 1, Hemoglobina < 25</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent</td><td>330-050-EL</td><td>1M, ácido livre</td></tr><tr><td>Insulina Humana Recombinante</td><td>Wisent</td><td>511-016-CM</td> Solução de <td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td> de grau USP <td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>100 X, estéril filtrado para solução</td></tr><tr><td>de L-Glutamina</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td>Solução de 200mM, estéril filtrado para cultura</td></tr> <tr><td>de célulasAnfotericina B</td><td>Wisent</td><td>450-105-QL</td><td>250&mu; g/ml, filtrado estéril para cultura de células</td></tr><tr><td>TGF humano recombinante-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>HEK293 Ácido</td></tr><tr><td>Acético</td> Derivado <td>Sigma-Aldrich</td><td>537020</td><td>Glacial, &ge; 99,85%</td></tr> <tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275&nbsp;</td><td>Reagente ACS, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>NMuMG</td><td>ATCC</td><td>CRL-1636</td><td>Linha Celular de Glândula Mamária de Camundongo</td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Fisher Schientific</td><td>AC190385000</td><td>99%, extra puro, ACROS Organics</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>reagente ACS, &ge; 85%, pellets</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>grau de laboratório</td></tr><tr><td><forte>Síntese de Contas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>468495-100MG</td><td>97%</td></tr><tr><td>Metacrilato de metila</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M55909-500ML</td><td>contém &le; 30&nbsp; ppm MEHQ como inibidor, removedor de inibidor de 99%</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>306312-1EA</td><td>Coluna pré-embalada para remover hidroquinona e éter monometílico hidroquinona</td></tr><tr><td>Metacriloxilpropil Polidimetilsiloxano</td><td>Terminado Gelest&nbsp;</td><td>DMS-R31 (25.000g/mol)</td><td>Estabilizador de polidimetilsiloxano, 25.000g/mol, 1.000 cSt</td></tr><tr><td>2,2&prime;-Azobis(2-metilpropionitrila) (AIBN)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>441090-25G</td><td>98%</td></tr><tr><td>Hexano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>296090-2L</td><td>anidro, 95%</td></tr> <tr><td>hexano, mistura de isômeros</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>227064-1L</td><td>anidro, &ge; 99%</td></tr><tr><td>O que man&nbsp; papel de filtro qualitativo, Grau 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001055</td><td>círculos, diam. 55&nbsp; mm,</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laurell WS-650Mz-23NPPB</td><td>Laurell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVP Handheld UV Lamp Modelo UVGL-58</td><td>VWR</td><td>21474-622</td><td></td></tr><tr><td>Reômetro</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 302 WESP</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de força de tração de alta produtividade usando pdms revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

A contratilidade celular é essencial em diversos aspectos da biologia, conduzindo processos que vão desde a motilidade e divisão, à contração tecidual e estabilidade mecânica, e representa um elemento central da vida animal multicelular. Nas células aderentes, a contração do acto-miosina é observada nas forças de tração que as células exercem em seu substrato. A desregulação da contratilidade celular aparece em uma infinidade de patologias, tornando a contratilidade um alvo promissor em diversas abordagens diagnósticas utilizando biofísica como métrica. Além disso, as estratégias terapêuticas novas podem ser baseadas em corrigir o mau funcionamento aparente da contratilidade da pilha. Estas aplicações, no entanto, exigem a quantificação direta dessas forças.
Nós desenvolvemos o silicone elastomer-baseou a microscopia da força da tração (TFM) em um formato multi-bem paralelizado. Nosso uso de uma borracha de silicone, especificamente o polidimetilsiloxano (PDMS), um pouco do que o poliacrilamida comumente empregado do hidrogel (PAA) permite-nos de fazer carcaças robustas e inertes com prateleira-vidas indefinidas que não exigem nenhumas condições de armazenamento especializadas. Diferentemente das abordagens baseadas em Pilar-PDMS que têm um módulo na faixa GPa, o PDMS usado aqui é muito compatível, variando de aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Criamos uma plataforma de alta taxa de transferência para o TFM, Particionando esses grandes substratos monolíticos espacialmente em poços bioquimicamente independentes, criando uma plataforma multipoços para a triagem de força de tração que é compatível com sistemas de vários poços existentes.
Neste manuscrito, utilizamos este sistema de força de tração multipoços para examinar a transição epitelial para mesenquimal (EMT); Nós induzem o EMT em pilhas de NMuMG expondo os a TGF-β, e para quantificar as mudanças biofísicas durante EMT. Nós medimos a contratilidade em função da concentração e da duração da exposição ao TGF-β. Nossos achados aqui demonstram a utilidade da TFM paralelizada no contexto da doença Biofísica.

Antes da adição de TGF-β, um monocamada confluente das pilhas tem um paralelepípedos como a forma e é embalado firmemente. Em cima do tratamento de TGF-β, as pilhas tornam-se mais alongadas na morfologia, ampliando a área da pilha e adquirindo um phenotype mais mesenquimais. Utilizando o dispositivo do multi-poço fabricado com os elastômeros macios de PDMS, as propriedades físicas das pilhas em um total 17 circunstâncias diferentes foram estudadas. As células foram tratadas com quatro dif...

Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Meu laboratório está interessado em mecanobiologia, que examina como as células se exercitam e são influenciadas por forças mecânicas. Uma maneira de quantificar a mecanobiologia é medir a contratilidade celular. Nas células aderentes, a contratlidade se manifesta em forças de tração exercidas no substrato celular. Quantificamos essas forças usando uma metodologia geralmente referida como microscopia de força de tração ou TFM. E tfm é implementado em uma ampla variedade de métodos diferentes, mas um aspecto comum é que é uma técnica de laboratório bastante serial e lenta feito tipicamente em um único prato como este aqui. Isso nos restringe a avaliar uma população ou condição de cada vez. Ao longo da cultura celular foi melhorado há algum tempo, mas criar pratos multiwell e pensamos, não seria ótimo que pudéssemos para tfm com o mesmo rendimento aumentado e a mesma eficiência de tempo e reagentes? E essa era nossa solução. Então criamos um prato de força de tração 96 bem. E se parece muito com um prato convencional de cultura de tecido 96, no entanto, com este prato podemos não só examinar 96 condições diferentes de cultura celular, mas também quantificar sua contratilidade celular. Isso apresenta uma solução de throughput muito maior do que abordagens de prato único, permitindo-nos examinar diversas condições celulares e respostas contratuais. Durante a metástase do câncer, as células cancerígenas viajam de seu local principal para locais secundários, espalhando a doença em nosso corpo. Esse comportamento metastático das células cancerosas é responsável por 90% da morte relacionada ao câncer. Um dos mecanismos propostos para que as células cancerígenas epiteliais adquiram um fenótipo mais migratório e invasivo é a transição epitelial-mesenquimal, EMT. Durante o EMT, eles se tornam mais migratórios e invasivos, mudando seu comportamento físico. Para entender melhor essas mudanças no comportamento físico, utilizamos nosso substrato de silício macio para medir mudanças na contratilidade das células da glândula mamária do rato com indução de EMT pela TGF-Neste estudo, investigamos como diferentes concentrações e tempo de incubação do comportamento físico das células TGF-afet. Polidimtilsiloxano é uma borracha muito compatível com o módulo mais baixo de Young de cerca de 0,6 quilopascal. A rigidez deste material também pode ser incapaz de usar diferentes concentrações de agente crosslink, incluindo SYLGARD 184.To medir propriedades mecânicas do PDMS usamos um reômetro. Depois de misturar a parte A e a parte B do PDMS, em uma relação de peso de um para um e adicionar o agente de cura com a porcentagem de peso especificada, carregue o lote preparado na placa de reômetro. Certifique-se de carregar o suficiente da amostra para cobrir completamente a área do eixo. É importante ter certeza de que o fuso toca a amostra completamente sem espaço livre na borda. Qualquer amostra extra deve ser cuidadosamente aparada e limpa da placa. Meça o módulo final de armazenamento e a dependência de tempo da viscoelasticidade de cada amostra fazendo varreduras de tempo e frequência em uma cepa de cisalhamento oscilatória de 0,5%Newsha]Este gráfico é um exemplo de teste seq de tempo, tendo feito para medir o comportamento reológico de polidimtilsiloxano com cepa de cisalhamento oscilatória aplicada de 0,5% e temperatura de 100

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Aqui, apresentamos um protocolo baseado em mecânica para interromper a junção de Gap conexina 43 e medir o impacto subsequente que isso tem sobre a biomecânica endotelial através da observação de tracções e tensões intercelulares.

Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

A superfície TGT é uma plataforma inovadora para estudar o crosstalk fator de crescimento integrin. O design flexível da sonda, a especificidade do ligante de adesão e a modulação precisa das condições de estimulação permitem avaliações quantitativas robustas da interação EGFR-integrin. Os resultados destacam a EGFR como uma mecânica integrin de ajuste 'mecano-organizador', influenciando a montagem de adesão focal e a disseminação celular.

Sondas de tether medidor de tensão para quantificar fator de crescimento mediado mecânica integrin e adesão

Aprenda microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS para medir contratilidade celular durante a transição epitelial-mesenquimal induzida por TGF-β. Este método avança pesquisas em biologia celular e engenharia biomédica.

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