Name: Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo ortotópico de carcinoma hepatocelular em camundongos C57BL/6 usando injeção esplênica intraparenquimatosa. Este método replica características imunes do câncer de fígado humano para estudos de imunotolerância tumoral.

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Este trabalho é apoiado por NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-o ' Carroll, PI) e NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu li, Kevin F. Staveley-o ' Carroll).

Nota: todo o procedimento, incluindo os sujeitos animais foram aprovados pelo IACUC na Universidade de Missouri. Todos os camundongos receberam cuidados humanitários de acordo com os critérios delineados no "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório". O procedimento a seguir para isolamento e inoculação celular deve ser realizado em um capô. Todos os artistas devem usar o equipamento de proteção individual padrão para o manuseio dos camundongos e tecidos.
1. indução de fibrose hepática e cirrose com injeção de IP de tetracloreto de carbono (CCl4)
Nota: consulte a Figura 1. (CCl4 é reagente altamente perigoso, ele deve ser segurado com cuidado e com luvas químico-resistentes desgastando)
<ol><li>Obter ratos machos C57BL/6J com seis a oito semanas de idade (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Prepare 10% CCl4 (v/v) solução em óleo de milho em um tubo de centrífuga. Determine o volume total com base no número de camundongos a serem injetados (consulte a etapa 1,6).</li>
	<li>Use a técnica adequada de manuseio de camundongos para selecionar um mouse para injeção.</li>
	<li>Contenha manualmente o rato com o seu lado dorsal (abdómen) para cima.</li>
	<li>Limpe o local da injeção na parede abdominal do rato esfregando com álcool 70%.</li>
	<li>Injete camundongos machos C57BL/6J com 160 μL de solução de CCl4 de 10% por injeção intraperitoneal (IP) usando uma agulha descartável de 25 gauge.</li>
	<li>Assegure-se de que a agulha penetre apenas através da parede abdominal (aproximadamente 4-5 milímetros) com chanfrar-lado acima e ligeiramente angular em 15-20 graus.</li>
	<li>Injectar ratos duas vezes por semana durante um total de quatro semanas-cada rato receberá um total de oito injeções. Nota: duas semanas após a última injeção, os camundongos tratados estão prontos para a inoculação de hepatócitos oncogênicos de ISPL de MTD2 camundongos.</li>
</ol>2. isolando tag-hepatócitos transgênicos da linha MTD2 camundongos
Observação: consulte a tabela 1 para obter receitas de solução.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Solução de sal equilibrado de 10x Earle sem CA ou magnésio (EBSS sem CA ou magnésio)</td>
			<td>4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2o 10 g de dextrose Adicione a água a 1 litro, pH a 4,32 Passar pelo filtro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução 1</td>
			<td>20 mL 10x EBSS sem CA ou mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1.5 M HEPES 10 mL de 10 mL de EGTA Adicionar água a 200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução 2</td>
			<td>100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M HEPES Adicione a água a 1 litro</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,75% solução de colagenase</td>
			<td>15 mg de colagenase tipo 1 20 mL de solução 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio completo</td>
			<td>2 O RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x penicilina-estreptomicina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: receitas de soluções.
<ol><li>Obter linha MTD2 camundongos38 para servir como a fonte de hepatócitos oncogênicos.</li>
	<li>Anestesiam ratos de 5 semanas de idade MTD2 usando 2,5% de isoflurano. Nota: a anestesia apropriada será verificada pelo método da pitada do dedo do pé. Em resumo, usando dois dedos, dar o dedo do pé do mouse/Foot um bom aperto. Se não houver reação de abstinência, o animal é julgado profundamente o suficiente para iniciar a cirurgia.</li>
	<li>Quando sedado adequadamente, coloc ratos em uma posição supina e fixe as extremidades com a fita para fornecer a exposição adequada da superfície abdominal.</li>
	<li>Realize uma incisão laparotomia Midline usando tesouras ao longo do comprimento da Linea Alba grande o suficiente para fornecer uma exposição adequada do fígado.</li>
	<li>Deslocar os intestinos para a esquerda para proporcionar uma melhor exposição do fígado e da Tríade Portal.</li>
	<li>Dissecar acima do fígado para expor a veia cava inferior (IVC).</li>
	<li>Ligate o IVC acima do fígado usando uma braçadeira da artéria.</li>
	<li>Voltando à borda inferior do fígado, use uma agulha de borboleta (ver materiais) para obter acesso IV à veia porta. Fixe o cateter à mão.</li>
	<li>Perfuse sucessivamente o fígado do rato usando uma seringa da injeção em 8,9 ml/min com com 15 ml da solução 1, 15 ml da solução 2 do colagenase de 0,75%, e 15 ml da solução 2 através do cateter.</li>
	<li>Colha o fígado perfundidos cortando e tomando a massa de tumor de MTD2 ratos em um tubo cônico de 50 ml com 10-15 ml de PBS.</li>
	<li>Remova o PBS e lave um tempo adicional com PBS; Não centrifugue nesta etapa.</li>
	<li>Corte o fígado em pedaços menores usando tesouras e depois lave novamente com PBS 2x para remover o sangue restante.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio RPMI completo ao tubo cônico e mince continuamente o fígado com tesouras para pequenas peças (< 3 mm)-o tecido deve passar suavemente por uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Adicione RPMI completo a um volume final de 30 mL e suspenda o fígado usando uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Filtre a solução mista com um filtro de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Lave o filtro diversas vezes com RPMI completo e ajuste o volume final a 50 mL adicionando o meio adicional de RPMI.</li>
	<li>Gire rapidamente a suspensão por centrifugador a um máximo de 500 rpm; uma vez que a velocidade é acelerada a 50 x g, o centrifugador deve ser parado.</li>
	<li>Decantar o sobrenadante e suspender as pelotas em 20 mL de PBS.</li>
	<li>Contagem de células usando trypan exclusão azul e um Hemocytometer, em seguida, ajustar a concentração celular para 2,5 x 106/ml para a seguinte inoculação celular. Nota: o rendimento esperado de 5 gramas de tecido tumoral é de 80 milhões hepatócitos com viabilidade > 95%.</li>
</ol>3. inocular os hepatócitos de camundongos MTD2 para o fígado de camundongos selvagens tipo C57BL/6J por injeção ISPL
<ol><li>A técnica asséptica deve ser utilizada em todos os procedimentos</li>
	<li>Anestesiam os camundongos C57BL/6J machos tratados com CCl4com 2,5% de isoflurano, os camundongos devem ser tratados com lubrificante ocular para evitar que os olhos SECem.</li>
	<li>Preparar seringas com 200 μL de hepatócitos para injecção.</li>
	<li>Quando sedado adequadamente, posicione os camundongos com o lado esquerdo para cima.</li>
	<li>Raspar todo o flanco esquerdo dos camundongos, em seguida, esfregar a área, alternando entre 70% álcool e Betadine três vezes.</li>
	<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno subcutaneouly antes da incisão cirúrgica.</li>
	<li>Faça uma incisão de 1 cm no flanco esquerdo paralelo à 13ª costela do início extremo dorsal logo abaixo do músculo da coluna vertebral.</li>
	<li>Identifique o baço, então exteriorização-o usando fórceps Blunt-pointed.</li>
	<li>Grampeie o baço com dois clipes de titânio de tamanho médio. Coloque ambos os clipes entre a artéria esplênica e a veia, deixe espaço entre os clipes para cortar mais tarde após a inoculação. Nota: o objetivo é isolar o pólo inferior do baço para reduzir o risco de semeadura.</li>
	<li>Injete 200 μL (500.000) dos hepatócitos preparados no pólo inferior do baço utilizando uma agulha de 27 G.</li>
	<li>Grampeie o ramo inferior do pedículo (vasos inferiores do pólo esplênico) com um clipe de tamanho médio.</li>
	<li>Corte o baço entre os dois clipes colocados inicialmente.</li>
	<li>Retire o pólo inferior do baço que foi injetado diretamente com células tumorais.</li>
	<li>Use 3-0 Poliglactina 910 interrompendo a sutura para fechar a camada interna do músculo.</li>
	<li>Use os grampos de aço esterilizados da ferida para fechar a camada exterior da pele. Nota: grampos de aço são preferidos sobre suturas para evitar animais mastigando suturas, deixando uma ferida escancarada.</li>
	<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea após a sutura.</li>
	<li>Coloque todos os animais em recuperação em uma almofada de aquecimento controlada por temperatura e monitore de perto até que esteja totalmente recuperado da anestesia.</li>
	<li>Dê aos ratos acesso livre à água após a cirurgia. Se o rato se tornar desidratado durante a cirurgia, administre fluidos subcutâneos (< 1 mL).</li>
	<li>Remova os grampos da pele em 7-10 dias post-operatively.</li>
</ol>

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<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li>
<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Não há nenhum para declarar.

Com este protocolo, nós estabelecemos um modelo murino de confiança e reprodutível de HCC que imita a iniciação e a progressão humanas do HCC. Clinicamente, muitos fatores de risco induzem sucessivamente lesão hepática, fibrose hepática, cirrose e a fase final da HCC. Em nosso protocolo, a injeção do IP de CCL4 é usada para produzir primeiramente a fibrose do fígado em ratos do tipo selvagem, que permite que os hepatócitos oncogênico subseqüentes Formem os tumores no ajuste da fibrose do fígado. Nós encontramo...

O câncer hepatocelular (HCC) é o tipo de câncer mais rapidamente crescente nos Estados Unidos (US)1,2,3. Todos os anos, aproximadamente 850.000casos novos são diagnosticados4,5 e 700.000 pacientes morrem desta doença letal6,7,8,9,10 , tornando-se a segunda maior causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A gerência de HCC inclui o resection cirúrgico, a transplantação, a ablação, o chemoembolization, ou terapias sistemáticas, tais como sorafenib11. O diagnóstico e a gerência adiantados com resection cirúrgico ou transplantação têm o benefício total o mais elevado da sobrevivência4. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta-se em estágio posterior e requer manejo com ablação, Quimioembolização ou sorafenib12. Sorafenib, um inibidor da tirosina quinase do receptor (rtki), foi aprovado pelo alimento e pela administração da droga em 2008 como a única terapia de droga sistemática disponível para tratar o HCC irressecável. Embora a droga só forneça um aumento modesto na sobrevida global, de 7,9 a 10,7 meses13, ele forneceu uma nova estratégia terapêutica que poderia ser utilizada para gerenciar o HCC.
Manipular o sistema imunológico para eliminar os cânceres estabelecidos é um campo de rápido crescimento na pesquisa de câncer14. Estudos imunológicos de Checkpoint têm consideravelmente avançadodesenvolvimento de fármacosimunoterapêuticos no tratamento do câncer15,16. O FDA aprovou o uso de anticorpos (ABS) contra o antígeno citotóxico T-linfócito 4 (CTLA-4), a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), e seu ligante PD-L1 para o tratamento de melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço e câncer de bexiga17, 18 anos de , 19 anos de , 20. ensaios clínicos de monoterapia ou terapêutica combinada com um ou vários anticorpos contra PD-1, PD-L1 ou CTLA-4 para o tratamento de HCC avançado estão em curso21,22,23, e alguns testes mostraram resultados favoráveis. Em 2017, o FDA concedeu a aprovação acelerada para o anticorpo anti-PD-1 para tratar pacientes de HCC, que são resistência ao sorafenib, mas a taxa de resposta total desta terapia é somente 14,3%. Outras estratégias não foram traduzidas para a prática clínica neste momento24,25. Superando a tolerância imune profunda tumor-induzida para melhorar a terapia imune do Checkpoint26; prevendo a eficácia da terapia imune do Checkpoint; prevenção de acontecimentos adversos relacionados com a imunidade; Otimizando a rota de administração, dosagem e frequência; e encontrar combinações efetivas de terapias27,28,29 todos permanecem tarefas extremamente desafiadoras.
Existem várias abordagens convencionais usadas para induzir a HCC em modelos de mouse atualmente e são utilizadas dependendo da questão de pesquisa particular do investigador30. Os modelos quimicamente-induzidos do rato de HCC com compostos genotóxico imitam a malignidade ferimento-induzida. Os modelos de xenograft através da implantação ectópica ou transplantação orthotopic do de linhas de pilha de HCC são apropriados para a seleção da droga. Vários camundongos geneticamente modificados foram projetados para investigar a fisiopatologia da HCC. Camundongos transgênicos expressando genes virais, oncogenes e/ou fatores de crescimento permitem a identificação de vias envolvidas na hepatocarcinogênese. Devido às limitações inerentes, estes modelos não recapitulam as características imunes típicas consideradas no HCC humano, que impediu significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterápicos inovativas14 ,15. Recentemente, criamos um modelo murino clinicamente relevante. Este modelo novo não somente imita a iniciação e a progressão humanas de HCC mas igualmente reflete a maioria de características típicas da doença humana que inclui a deficiência orgânica imune. Caracterizamos suas características biológicas e imunológicas. Aproveitando este modelo novo, nós exploramos várias estratégias imunoterápicos para tratar HCC31,32,33,34,35,36, 37. esta plataforma única nos permite estudar mecanismos de imunotolerância induzida por tumor e desenvolver estratégias terapêuticas de prova de conceito para HCC em direção a eventual tradução clínica.

<table><tbody><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>máquina de anestesia para cirurgia</td></tr><tr><td>Agulha borboleta</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Agulha usada para perfusão hepática</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Camundongos usados no prototol</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>carprofeno para liberação de dor</td></tr><tr><td>Filtro de Células&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Filtro de células, 70&micro; m, para isolamento de hepatócitos</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>para isolamento celular</td></tr><tr><td>Clips&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Clipes de titânio para microscópio de baço</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>microscópio para observação celular</td></tr><tr><td>Mtd2 camundongos</td><td>N / A</td><td></td><td>Presente do Dr. William A Realizado no Roswell Park Cancer Institute em 2002, mantido em nosso laboratório</td></tr><tr><td>Agulha</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD agulha de deslizamento de precisão, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr> <tr><td>Sutura</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>revestido com sutura VICRYL</td></tr><tr><td>SV40 T Ag anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 anti-SV40 anticorpo de antígeno T para</td></tr><tr><td>IHC Seringa</td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>Seringa TB de 1 mL para injeção celular</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Solução de azul de tripano para teste de viabilidade celular</td></tr><tr><td>Clipes de ferida</td><td></td><td>Reflexo de reflexo9, Part. No. 201-1000</td><td>clipes de ferida de aço inoxidável para fechamento de ferida</td></tr></tbody></table>

um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

A ausência de um modelo animal clinicamente relevante abordando as características imunes típicas do câncer hepatocelular (HCC) tem impedido significativamente a elucidação dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas inovadoras. Para desenvolver um modelo animal ideal que recapitulando o HCC humano, os ratos masculinos imuno-competentes de C57Bl/6J recebem primeiramente uma injeção do tetracloreto de carbono (CCL4) para induzir a fibrose do fígado, a seguir recebem hepatócitos oncogênico histològica-normais do macho novo Antígeno SV40 T (TAg)-camundongos transgênicos (MTD2) por inoculação intra-esplênica (ISPL). Andrógeno gerado em ratos machos receptores na puberdade inicia a expressão de TAg o controle de um promotor específico do fígado. Como resultado, os hepatócitos transferidos tornam-se células cancerosas e formam massas tumorais no cenário de fibrose hepática/cirrose. Este modelo novo imita a iniciação e a progressão humanas do HCC no contexto da fibrose/cirrose do fígado e reflete as características as mais típicas do HCC humano que inclui a deficiência orgânica imune.

Hepatócitos oncogênicos isolados de camundongos TAg-transgênicos (Figura 2) foram semeados no fígado de camundongos tipo selvagem por injeção intraesplênica (Figura 3). Os hepatócitos transplantados com sucesso e de forma confiável cresceram tumores ortotópicos de HCC (Figura 4) com antígeno específico SV40 TAg do tumor (Figura 5) no cenário de inflamação e fibrose hepática (Figura 1).
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Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo murino clìnica relevante do cancro do fígado que recapitulando as características imunes típicas do cancro hepatocelular (HCC).

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Usar apenas um modelo para desenvolver um modelo de massa de câncer hepatocelular poderia ajudar as pessoas a elucidar sua imunotolerância induzida pelo tumor e tratamento específico induzido por tratamento, qualquer imunoresponse tumoral. O tumor ortotópico que se desenvolve com a técnica de fibrose hepática imita as características clínicas do câncer de fígado humano. Este método poderia fornecer uma ferramenta útil no estudo imunológico do câncer hepatocelular.A demonstração visual deste método pode ilustrar os passos mais tecnicamente desafiadores, como a injeção intrasplenica, que são essenciais para uma execução bem sucedida deste protocolo. Em seguida, contenha manualmente um macho, de seis a oito semanas de idade C57 preto 6 mouse dorsal-side para cima. Use 70% de etanol alternativo e esfoliações betadinas para limpar o local da injeção três vezes.Em seguida, entregue 160 microlitadores de tetraclorito de carbono ao camundongo por injeção intraperitoneal e devolva o animal para sua gaiola doméstica. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo, em um vírus símio de cinco meses de idade 40 T camundongo transgênico, coloque o rato na posição supina e fixe os membros com fita. Faça uma incisão de laparotomia média ao longo do comprimento da linha alba, grande o suficiente para fornecer uma exposição adequada do fígado, e deslocar os intestinos para a esquerda.Dissecar acima do fígado para expor a veia cava inferior. Induzir um grampo de artéria para ligar o vaso. Use uma agulha borboleta para obter acesso intravenoso à veia portal e fixar manualmente o cateter.Comutação cuidadosa de seringas para cada solução, entregue com sucesso 15 mililitros de solução um, 15 mililitros de 0,75% de solução de colagem 2 e 15 mililitros de solução dois sem colagem através de cateter, a uma velocidade de fluxo aproximada de 8,9 mililitros de solução por minuto. No final da perfusão, colide a massa tumoral em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 a 15 mililitros de PBS. Extir esse tumor do próximo rato MTD2 como apenas demonstrado.Use uma tesoura para cortar os fígados em pedaços menores. Transfira os tecidos para um novo recipiente de PBS fresco para remover o resto do sangue do tecido antes de transferir os pedaços de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de meio RPMI completo. Pique as amostras de fígado lavadas até que os pedaços possam caber facilmente através da ponta de uma pipeta de cinco mililitros.Adicione o meio suficiente ao tubo para atingir um volume final de 30 mililitros. Use uma pipeta de cinco mililitros para triturar os fragmentos de tecido, antes de filtrar a solução através de um filtro de 70 micrômetros em um novo tubo de 50 milímetros. Lave o coador várias vezes com meio completo.Ajuste o volume final para 50 mililitros com meio completo adicional. Gire rapidamente a suspensão por centrifugação para um máximo de 50 vezes g antes de parar a centrífuga e decantar o supernatante. Em seguida, resuspende a pelota em 20 mililitros de PBS para contar.Para injeção intrasplenica dos hepatócitos MTD2, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 por cada animal receptor com 220 microlitídicos de hepatócitos por rato. Confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo em um animal anestesiado e tratado de tetraclorito de carbono. Começando logo abaixo do músculo da coluna vertebral, em seguida, faça uma incisão de um centímetro no flanco esquerdo paralela à décima terceira costela do extremo dorsal e use fórceps pontiagudas para exteriorizar o baço.Corte o baço com dois clipes de titânio de tamanho médio entre a artéria esplênica e a veia, e entregue 200 microliters de células no polo inferior do baço. Corte o ramo inferior do pedículo com um clipe de tamanho médio e corte o baço entre os dois clipes inicialmente colocados. Remova o polo inferior do baço que foi injetado diretamente com células tumorais e use 3-0 poliglactina 910 interrompida para fechar a camada muscular interna.Em seguida, use clipes de ferida de aço esterilizado para fechar a camada externa da pele e administrar subcutâneamente cinco miligramas por quilograma de carprofeno. Após o isolamento de camundongos transgênicos de antígeno T, como demonstrado, tanto hepatócitos quanto células infiltradas por tumores podem ser observados. As células normalmente demonstram uma viabilidade de quase 100% após o processamento.Após a inoculação intrasplenica em animais tratados com tetraclorito de carbono selvagem, os hepatócitos transplantados crescem com sucesso e confiabilidade tumores de carcinoma hepatocelular ortotópico que expressam o vírus símio específico do tumor 40 T. A preparação de nossa população viável e pura de hepatócitos a partir da massa MTD2 e administração precisa da injeção intrasplenica são importantes para o sucesso do procedimento. Embora nossa equipe tenha testado a inoculação hepatocitada em camundongos receptores através de injeção intravascular e intraperitoneal, esses outros métodos não foram capazes de induzir carcinoma hepatocelular ortotópico.Este modelo fornece uma plataforma única que permite a investigação para a vigilância imunológica e a tolerância em seus estágios iniciais e posteriores da progressão do tumor. Por favor, tenha cuidado ao usar o tetraclorito de carbono, pois é tóxico.

an-oncogenic-hepatocyte-induced-orthotopic-mouse-model-hepatocellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Infecção de camundongos com um Adenovírus expressando o autoantígeno major humano do citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconhecidas pelos soros de pacientes que sofrem a partir de tipo 2 resultados da hepatite auto-imunes em uma forma persistente da auto-imune-mediada doença do fígado caracterizada por extenso hepatite fibrose, e de geração de um CYP2D6 -específica resposta imune.

O modelo animal CYP2D6: Como induzir hepatite auto-imune em ratos

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

A interrupção do fluxo biliar resulta em lesão hepática colestática inflamatória grave com uma sequência característica de alterações morfológicas dependentes do tempo. Aqui apresentamos um protocolo para a ligadura cirúrgica do ducto colédoco em camundongos que permite induzir uma forte resposta fibrótica após 21 a 28 dias.

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Aqui, apresentamos um protocolo para criar xenoenxertos de carcinoma hepatocelular ortotópico com e sem ligadura da artéria hepática e realizamos tomografia por emissão de pósitrons (PET) não invasiva de hipóxia tumoral usando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesoxiglicose ([18F]FDG).

Imagem PET/MR não invasiva em um modelo ortotópico de carcinoma hepatocelular em camundongo

Organoides gerados a partir de tumores de pacientes são injetados ortotopicamente no fígado de camundongos. A ressecção do tecido hepático não tumoral leva a um ambiente regenerativo no tecido hepático onde o tumor está localizado.

Um modelo de xenoenxerto organoide derivado de paciente com câncer hepatocelular para investigar o impacto da regeneração hepática no crescimento do tumor

O modelo de camundongo de hepatectomia parcial 2/3 (66%) é bem descrito na literatura, mas hepatectomias mais extensas mimetizando a síndrome do pequeno para o tamanho após o transplante de fígado raramente foram usadas. Descrevemos um procedimento de hepatectomia estendida de 78% em um modelo de camundongo que resulta em aproximadamente 50% de letalidade pós-operatória em camundongos saudáveis.

Hepatectomia estendida de 78% em modelo cirúrgico de camundongo

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia das células estreladas hepáticas em tecido hepático intacto. Essa abordagem combina marcação fluorescente de fibroblastos usando genética de camundongos, preparação de tecidos baseada em perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza de tecidos iDISCO para alcançar transparência óptica.

Mapeamento da morfologia das células estreladas hepáticas em modelos camundongos de fibrose hepática

Aprenda a desenvolver um modelo ortotópico de carcinoma hepatocelular em camundongos C57BL/6 usando injeção esplênica intraparenquimatosa. Este método replica características imunes do câncer de fígado humano para estudos de imunotolerância tumoral.

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

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