Name: Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a visualizar meristemas apicais de caule em plantas vivas usando microscopia confocal de varredura a laser. Este método eficiente permite obter imagens de alta resolução celular em Arabidopsis, tomate e soja sem fixação laboriosa.

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Os autores reconhecem Purdue Bindley Bioscience Center Imaging facilidade para acessar o microscópio confocal de varredura a laser e para o suporte técnico, e os autores Agradecemos a ajuda de Andy Schaber na instalação de imagens Bindley de Purdue. Esta atividade foi financiada pela Universidade de Purdue, como parte das encruzilhadas AgSEED financiamento para apoiar a agricultura e Desenvolvimento Rural de Indiana.

1. preparação de pratos meios de comunicação e imagem
<ol><li>Placas de MS: Adicionar 0,5 x Murashige & Skoog MS médio, ágar de 1% em água desionizada e depois ajustar o pH a 5.8 usando a solução de hidróxido de potássio (opcional: adicionar 1% de sacarose para o crescimento de planta a longo prazo). Placas de autoclave e despeje.</li>
	<li>Pratos de imagem: encher os pratos de Petri plásticos (6 cm de largura, 1,5 cm de profundidade) para 0,5-0,8 cm com 1,5% de agarose derretido.</li>
</ol>2. planta de crescimento
<ol><li>
Crescimento de Arabidopsis<ol>
<li>Semear sementes esterilizadas em placas de MS e colocar placas abaixo de 4 ° C por dois dias. Em seguida, mover placas MS para um dia curto (8 h luz / escuro 16 h), a 22 ° C, durante duas semanas.</li>
		<li>Transplante de mudas para o solo e cultivá-las em um dia curto (8 h luz / escuro 16 h) a 22 ° C, durante quatro semanas.</li>
		<li>Transferi as plantas para luz contínua, a 22 ° C, para induzir a transição entre a vegetativa para a fase de reprodução e de imagem a inflorescência SAMs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescimento de soja e tomate<ol>
<li>Incube as sementes cobertas com papel de filtro molhado abaixo de 28 ° C, até que germinam.</li>
		<li>Transplante de mudas para o solo e cultivá-las em um dia (16 h luz / escuro 8 h) a 25 ° C, durante uma semana ou mais para as SAMs vegetativos de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dissecação do ápice de fotos
<ol><li>Dissecação do ápice atirar inflorescência<ol>
<li>Corte o ápice de tiro de inflorescência juntamente com a haste principal de 1-2 cm das plantas Arabidopsis aparafusadas com uma lâmina de barbear. Segure a parte basal do caule principal e retire como muitos órgãos de flor mais velhos quanto possível a haste principal dissecando fora os pedúnculos com fórceps de joias. Atenção: Evite os dedos de corte quando usando uma lâmina de barbear. Elimine as lâminas de barbear usadas para recipiente de uma adequada para objectos cortantes.</li>
		<li>Segure a haste anexada do ápice de fotos com joias fórceps ou dedos no campo do microscópio estereoscópico, continuar retirando o resto das flores até quase o SAM todo pode ser visto a partir das oculares. Retire os pedúnculos claramente na junção da haste principal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissecação do ápice vegetativo de fotos<ol>
<li>Para exibir as SAMs vegetativos de tomate ou de soja, dissecar para fora os cotilédones, folhas e raízes de plantas.</li>
		<li>Segure o hipocótilo das plantas sob o microscópio estereoscópico e dissecar mais fora o primordia folha cobrindo as SAMs vegetativas usando fórceps de joias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. coloração
<ol><li>Para visualizar diretamente as células no SAMs, use solução de iodeto (PI) recentemente preparada propidium manchar paredes celulares. Dissolver o pó de PI em água desionizada estéril, fazer PI de 1mL de solução de coloração na concentração de 1 mg/mL e armazenar a solução de PI em microcentrifuga tubo coberto com papel alumínio.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de PI em um ambiente limpo e vazio de Petri e mergulho todo dissecado atirar ápice em tintura de 2 min. Enxágue o ápice manchada de atirar duas vezes em água desionizada estéril. Durante o processo de coloração, mergulhe a inflorescência inteira SAM ou vegetativa SAM para a solução de PI para atingir a coloração uniforme.</li>
</ol>5. coleção de imagens
Nota: para este método, todos as SAMs são fotografados usando um microscópio confocal na posição vertical e com uma água-mergulho lente de 20x. Conforme descrito em outros protocolos9,12,13,15, também é viável para imagem SAMs usando um microscópio invertido. Além disso, a imagem ao vivo pode ser conseguida usando marcas diferentes de microscópios confocal, com as mesmas etapas de preparação de amostra. Neste estudo, as etapas de geração de imagens são descritas em detalhes como um exemplo.
<ol><li>Furar um buraco no centro de um prato de imagem usando fórceps e enfiar o ápice manchada de fotos vertical no meio.</li>
	<li>Encha o prato de imagem com água desionizada estéril de imergir completamente a amostra. Visualizando o microscópio estéreo, pipeta de cima e para baixo para remover as bolhas de ar preso em volta da meristema. Em seguida, ajuste o ângulo do tronco em agar para certificar-se que o SAM é totalmente visível da diretamente acima.</li>
	<li>Coloque o prato de imagem no palco amostra do microscópio confocal. Baixar água-mergulho lente e levantar o estágio de amostra de microscópio para permitir que a ponta da lente de imersão na água.</li>
	<li>Abra o software do microscópio confocal e localize o SAM no brightfield nas oculares. Mover para a direita de amostra SAM abaixo da lente objetiva, através do ajuste do controlador XY, em seguida, focar o SAM de oculares através de cautelosamente, ajuste o controlador Z.</li>
	<li>Operar a função de aquisição do software microscópio confocal (ver Tabela de materiais), iniciar o modo de viver para ver a amostra da tela do computador e configurar todos os parâmetros para o experimento de exploração do laser.<ol>
<li>Ao ajustar os parâmetros, use a função de Indicador de escala para definir se o sinal está saturado ou não.</li>
		<li>Opcionalmente, aplica a função de reutilizar para recarregar todas as configurações de parâmetro do arquivo selecionado confocal. Nota: Sugeriu parâmetros de imagem: Laser de linha (excitação): 515 nm ou 561 nm; Emissão 570-650 nm; pinhole: 1 unidade arejada (AU); Ganho: 600-750, modo de digitalização: Frame; Tamanho de quadro: 512 X 512 ou 1024 X 1024; velocidade de digitalização: de 7 a Max; Direção de digitalização: bi-direção; Número médio: 2-4; Uma média de método: quer dizer; Profundidade de bit: 16 bits; Intervalo de varredura: 0,5-1 µM. Além disso, otimize todos estes parâmetros baseados sobre a natureza das amostras de plantas diferentes e as necessidades específicas de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. processamento de imagem
<ol><li>Para poder visualizar vistas de seção transversal e ortogonais ótica, use o mesmo software comercial para a aquisição de imagens. Abra o arquivo original confocal, clique menu orto, selecione orto. Em seguida, selecione qualquer posição x, z e y posição posição da imagem e salve as imagens como arquivos tiff.<ol>
<li>Opcionalmente, selecione distância 3D função para definir a distância física entre dois pontos selecionados da pilha das imagens confocal.</li>
		<li>Como alternativa, use Fiji/Image J, o pacote de processamento de imagem aberto recurso Visualizar as vistas de seção transversal e ortogonais.</li>
		<li>Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menu, selecione pilhas e selecione vistas ortogonais.</li>
		<li>Selecione XY, YZe XZ aviões na posição intermédia e salve como imagens em formato Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para visualizar uma projeção 3D transparente, use o mesmo software.<ol>
<li>Abra o arquivo original confocal, clique menu 3De selecione transparente para gerar uma visualização de projeção em 3D.</li>
		<li>Opcionalmente, clique em menu 3D, selecione aparênciae selecione transparência para ajustar três parâmetros da projeção incluindo limiar, rampa e máxima para a transparência do 3D imagem.</li>
		<li>Clique menu 3D, selecione a aparência e selecione luz para ajustar o brilho da imagem 3D.</li>
		<li>Exportar imagens projetadas e salvá-los como arquivos Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a visualização de uma projeção de intensidade máxima 3D, abra os arquivos confocal com o mesmo software e clique no menu 3D.<ol>
<li>Selecione o menu 3D e máxima.</li>
		<li>Como alternativa, use Fiji/Image J Visualizar uma projeção 3D de intensidade máxima.</li>
		<li>Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menu e selecione a pilhas.</li>
		<li>Selecione o projeto 3D e salvar como imagens em formato Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para visualizar a profundidade de exibição das imagens 3D de codificação, use o mesmo software.<ol>
<li>Clique menu 3D e selecione aparência.</li>
		<li>Selecione especial e Profundidade de codificação.</li>
		<li>Como alternativa, use J Fiji/imagem para visualizar a profundidade vista de codificação.</li>
		<li>Abra os arquivos confocal, clique em menu de imagem, selecione Hyperstack.</li>
		<li>Selecione o código Temporal-cor e salve como imagens em formato Tiff. Nota: A codificação profundidade z-pilha também pode ser alcançada através do plugin Pilha de código Z para Fiji.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para poder visualizar o 3D vista de rotação como mostrado (filme 1 e 2 do filme), usar o mesmo software (consulte a Tabela de materiais).<ol>
<li>Abra os arquivos confocal, clique menu 3De selecione a série.</li>
		<li>Selecione processar a sériee selecione uma das quatro opções incluindo vira x, vire y, inicial e finale lista de posição.</li>
		<li>Salve a série render como os arquivos AVI.</li>
		<li>Como alternativa, use Fiji/Image J Visualizar o modo de exibição de rotação 3D.</li>
		<li>Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menue selecione Stacks.</li>
		<li>Selecione o projeto 3D e salvar como vídeos em formato AVI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método simples de imagem que pode ser aplicado ao estudo dos meristemas apical de tiro de diferentes plantas com pequena modificação, abrindo uma nova avenida para estudar o Regulamento de meristema nas fases vegetativas e reprodutivas de plantas do modelo e colheitas. Em contraste com o SEM e métodos de coloração histológicos, este protocolo pode ajudar a revelar tanto vista de superfície e estruturas celulares internas do SAMs, sem a necessidade de fixação da amostra de trabalho intensivo e/ou medi...

A meristema da planta contém um pool de células-tronco indiferenciadas e continuamente sustenta o crescimento de órgãos da planta e desenvolvimento1. Durante o desenvolvimento pós-embrionário, quase todos os tecidos acima do solo de uma planta derivam a meristema apical de tiro (SAM). Nas lavouras, a atividade e o tamanho de SAM e suas derivada os meristemas florais são firmemente associados com muitas características agronômicas como atirar arquitetura, produção de frutos e rendimento de sementes. Por exemplo, no tomate, um alargada SAM provoca um aumento a atirar e a ramificação da inflorescência e, portanto, resultados na geração extra flor e fruta órgãos2. No milho, um aumento no tamanho do SAM leva a um maior número de sementes e rendimento total3,4. Na soja, a indeterminação do meristema também está intimamente associada com a arquitetura de atirar e produzir5.
A morfologia e anatomia de SAMs podem ser caracterizados por diversos métodos, incluindo corte/coloração histológica e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)6, ambos os quais extremamente avançado a pesquisa meristema através do fornecimento de ou a vista secional ou uma visão de superfície tridimensional (3D) de SAMs. No entanto, ambos os métodos são demorados, envolvendo várias etapas experimentais de preparação da amostra para a aquisição de dados, e estes métodos dependem principalmente amostras fixas. Avanços recentes na técnica de microscopia confocal de varredura de laser têm de superar essas limitações e nos fornecem uma poderosa ferramenta para investigar a estrutura celular e processo de desenvolvimento da planta os tecidos e órgãos7,8. Através de óptico ao invés de tecido físico microscopia confocal, corte permite a recolha de uma série de imagens de z-pilha e a subsequente reconstrução 3D da amostra através do software de análise de imagem.
Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para investigar ambos dentro e estruturas de superfície dos SAMs vivos de diferentes espécies usando laser, microscopia confocal, que potencialmente permite que pesquisadores realizar todo o experimental de plantas processo no prazo tão curto quanto 20 minutos. Diferente de outros métodos publicados para a imagem latente confocal ao vivo, de Arabidopsis inflorescência SAMs9,10,11,12,13,14, 15 e Arabidopsis flores12,13, aqui nós demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só os meristemas de inflorescência da espécie de modelo, mas também a filmagem vegetativa de meristemas apical de diferentes culturas, como soja e tomate. Este método não depende de marcadores fluorescentes transgênicos e potencialmente pode ser aplicado para estudo de muitos diferentes espécies e cultivares, os meristemas a atirar. Além disso, também apresentamos a passos para visualizar e analisar diferentes SAMs em uma vista 3D de processamento de imagem simples. Tomados em conjunto, este método simples facilitará os pesquisadores a compreender melhor a estrutura e o processo de desenvolvimento dos meristemas de ambos os organismos modelo e culturas.

<table><tbody><tr><td>Ágar Phyto</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ponto de Agarose</td><td>Scientific Inc.</td><td>Pinça AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>ROBOZ</td><td></td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF Super Fina Ponta de Inox Tamanho .025 X .005mm, para dissecar ápices de brotos.</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Vertical LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog MS médio</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plano APO 20x/1.1 lente de imersão em água</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Produtos Científicos</td><td>229694</td><td>Uso como fabricação de placas de MS</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico60 mm X 15</td><td>Produtos Científicos CELLTREAT</td><td>229665</td><td>Uso como placas de imagem</td></tr><tr><td>Mistura de Propagação</td><td>Sungro Horticultura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>solução de 1 mg/mL em água, para manchar as paredes celulares</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>Para cortar o ápice do rebento de plantas</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen black</td><td>Zeiss</td><td>Software de aquisição de imagem</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal ao vivo de imagens de shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

As funções do meristema apical (SAM) de atirar como um reservatório de células-tronco conservada e gera quase todos os tecidos na superfície durante o desenvolvimento pós-embrionário. A atividade e a morfologia dos SAMs determinam traços agronômicos importantes, como arquitetura de atirar, o tamanho e o número de órgãos reprodutivos e o mais importante, rendimento de grãos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para analisar tanto a morfologia de superfície e a estrutura celular interna dos SAMs vivos de espécies diferentes, através do laser, microscópio confocal de varredura. Todo o processo de preparação da amostra para a aquisição de imagens em alta resolução tridimensionais (3D) pode ser realizado dentro de tão curto quanto 20 minutos. Demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só a inflorescência SAMs da espécie de modelo, mas também os meristemas vegetativos de diferentes culturas, fornecendo uma ferramenta simples mas poderosa para estudar a organização e o desenvolvimento de meristemas através de diferentes espécies de plantas.

Para avaliar a eficiência do nosso protocolo e explorar a morfologia dos meristemas de diferentes espécies, que temos realizado os experimentos de imagiologia confocal ao vivo no meristema inflorescência de Arabidopsis e os meristemas vegetativos de soja e tomate. Neste estudo, Arabidopsis ecótipo Landsberg erecta, cultivar tomate Micro-Tom e cultivar soja 82 Williams têm sido usados como exemplos.
Vis...

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Atire em meristems apical controle o crescimento e a reprodução das plantas. Este método nos ajuda a investigar a morfologia e as estruturas internas de meristems apical shoot não apenas nas espécies modelo, mas também em diferentes culturas. Esta técnica é um procedimento muito eficiente.O meristem apical de tiro pode ser diretamente visualizado em uma alta resolução celular sem qualquer fixação de amostra intensiva em mão-de-obra e etapas de secção de tecidos. Para começar, cultivar plantas arabidopsis, tomate e soja conforme detalhado no protocolo de texto. Corte o ápice de inflorescência das plantas arabidopsis aparafusadas.Segure a parte basal do caule principal, e use fórceps para remover o maior número possível de órgãos florais mais antigos do caule principal. Continue removendo o resto das flores no campo do microscópio estéreo até que o meristem apical de tiro possa ser visto a partir das oculares. Para ver os meristamos vegetativos apical de tomate ou soja, dissecar os cotilledons, folhas e raízes da planta.Segure os hipocotilas da planta sob o microscópio estéreo, e use fórceps para dissecar ainda mais as folhas e a folha primordia cobrindo os meristems de brotos vegetativos. Pipeta 50 microliters de solução de iodeto de propidium em uma placa de Petri limpa e vazia. Mergulhe todo o ápice de tiro dissecado em corante por dois minutos.Durante o processo de coloração, mergulhe toda a inflorescência atire meristem apical ou meristem de tiro vegetativo na solução de iodeto propidium para alcançar a coloração uniforme. Enxágüe o ápice de tiro manchado duas vezes em água estéril e deionizada. Agora, fure um buraco no centro de uma antena de imagem preparada usando fórceps, e coloque o ápice manchado de tiro ereto no meio.Encha o prato de imagem com água estéril e deionizada para imergir completamente a amostra. Veja a amostra através do microscópio estéreo. Pipeta para cima e para baixo para remover bolhas de ar presas ao redor do meristem.Em seguida, ajuste o ângulo da haste no ágar para ter certeza de que o meristem apical de tiro é totalmente visível diretamente acima. Agora, coloque o prato de imagem no estágio amostral do microscópio confocal. Abaixe a lente de mergulho de água e levante o estágio da amostra do microscópio para deixar a ponta da lente mergulhar na água.Abra o software de microscópio confocal e use as oculares para localizar e focar no meristem apical de tiro no campo brilhante. Opere a função Aquisição no software de microscópio confocal. Inicie o modo ao vivo para visualizar a amostra a partir da tela do computador e configure todos os parâmetros para o experimento de varredura a laser.Ao ajustar os parâmetros, use a função Indicador de alcance para definir se o sinal está saturado ou não. O mesmo software que foi usado para aquisição de imagens pode ser usado para visualizar uma projeção transparente tridimensional. Abra o arquivo confocal original, clique no menu 3D e selecione Transparente para gerar uma exibição de projeção 3D.Opcionalmente, selecione Transparência para ajustar três parâmetros da projeção, incluindo Limiar, Rampa e Máximo para a transparência da imagem 3D. Agora, selecione Luz para ajustar o brilho da imagem 3D. Exporte as imagens projetadas e salve-as como arquivos TIFF.Para visualizar a visão de codificação de profundidade das imagens 3D, use o mesmo software. Novamente, clique no menu 3D e selecione Aparência. Selecione Especial e selecione Codificação de profundidade.Exporte as imagens projetadas e salve-as como arquivos TIFF. Esta imagem da seção ortogonal até o meio da Arabidopsis shoot apical meristem mostra que as paredes horizontais estão manchadas com iodeto de propídio em quase todas as células em múltiplas camadas celulares. Uma visão de uma seção transversal através do corpus da inflorescência shoot apical meristem mostra que as células do plano XY também são claramente imagens.A visão de projeção 3D revela que a inflorescência meristem forma uma estrutura semelhante a uma cúpula e é cercada pela primordia da flor em desenvolvimento. Esta imagem da seção ortogonal até o meio do molho de tomate apical meristem também mostra que as paredes horizontais estão manchadas com iodeto de propídio em múltiplas camadas celulares, embora o sinal de iodeto propidium da região interior profunda seja ligeiramente menor. Uma imagem de uma seção transversal através das camadas profundas do meristem apical de tiro vegetativo revela as células dos planos XY e a fronteira formada entre o meristem vegetativo e a folha primordia.A visão de projeção 3D pode fornecer ainda uma visão abrangente da forma e organização do meristem vegetativo do tomate. Mostrado aqui é uma visão ortogonal através do meio do broto de soja apical meristem e uma projeção 3D do mesmo meristem apical tiro. O meristem vegetativo em forma de cúpula e sua nova folha derivada primordia também são observáveis.O iodeto de propidium pode facilmente manchar células danificadas ou mortas, o que influenciará muito a qualidade das imagens, por isso é importante evitar qualquer dano físico enquanto prepara amostras de meristem apical.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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