Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

As células proscritos de antígenos dendráticos fisiológicos, denominadas PhDC, são os interruptores-mestre imunes que iniciam imunidade e tolerância celular T específicas do antígeno. Este artigo delineia um método eficiente para a produção de PhDC. O uso clínico de células dendríticas é impedido pelos métodos de citocina não fisiológicas utilizados para produzi-las.

Nosso método supera esse problema através de uma sinalização plaqueta eficiente da conversão monocito-DC em humanos e camundongos. Estes PhDC não dependem de condições de citocinas indisponíveis in vivo, de modo que podem gerar potentes respostas clínicas anti-tumores T em humanos e camundongos com cânceres estabelecidos. O início da plaqueta independente das espécies de maturação monocito-para-PhDC tem ampla aplicabilidade experimental.

O PhDC permite dissecção da fisiologia celular dendrítica, facilita a indução da imunidade anticâncular terapêutica a cânceres imunogênicos e oferece promessa de vacinação antimicrobiana personalizada. Este sistema experimental é novo, e vários aspectos dele, como revestimento da câmara plástica, tratamento de células tumorais com 8-MOP/UVA, condições de fluxo e liberação de monócitos são melhor representados visualmente. Demonstrando o procedimento será Eve Robinson, uma técnica do meu laboratório.

Para coletar células mononucleares de sangue periféricos, primeiro configure um tubo de 15 mililitros com quatro mililitros de meio de isolamento linfócitos por cinco a dez camundongos sangrados. Em seguida, lentamente camada sangue coletado de camundongos portadores de tumor em cima do meio. Gire as células em 1.000-1.500 vezes G por 20 minutos para separar os PBMCs dos glóbulos vermelhos.

No final da centrifugação, colete a camada de plasma superior, deixando 0,5 mililitros restantes acima do casaco buffy, e armazene a quatro graus Celsius para uso posterior. Em seguida, colete a camada de casaco buffy em um tubo limpo de 15 mililitros cheio de PBS a 15 mililitros, e gire a 250 vezes G em uma centrífuga de cultura de tecido padrão por 10 minutos para coletar o PBMC. No final da centrifugação, cuidadosamente pipeta fora do supernante e flick o tubo para resuspend a pelota.

Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos ACK ao tubo para remover quaisquer glóbulos vermelhos restantes do PBMC. Incubar o PBMC no gelo por 10 minutos. Encha o tubo com PBS a 15 mililitros e gire a 250 vezes G em uma centrífuga de cultura de tecido padrão por 10 minutos para coletar o PBMC.

Pipeta cuidadosamente fora do supernasal e flick o tubo para soltar a pelota. Resuspense a pelota em 300 microliters de FBS. Para preparar as células tumorais YUMM1.7 por grupo de tratamento, primeiro resuspencou a pelota de células tumorais em FBS em 2,5 milhões de células por 300 microliters.

Com as luzes da capa da cultura tecidual apagadas, adicione 8-metoxipsoralen para uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro à suspensão celular tumoral YUMM1.7. Em seguida, misture as células, enrole o recipiente de células em papel alumínio e incubar a 37 graus Celsius por 20 minutos. Para pré-revestir uma placa de cultura de tecido de 12 poços, adicione um mililitro de FBS a um poço para cada grupo de tratamento de cinco camundongos, e leve à geladeira a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Após 20 minutos, sob uma capa de cultura tecidual, remova fbs dos poços, e adicione 300 microliters de células tumorais expostas à metoxipsoralen por poço. Em seguida, exponha a placa contendo células ao ultravioleta pré-aquecido Uma fonte de luz para irradiação total de quatro joules por centímetro quadrado. Para coletar células tumorais tratadas com 8 metoxipsoralen/UVA de cada poço, gire a placa e a pipeta cuidadosamente para garantir a recuperação completa das células.

Para realizar a transimmunização da passagem da placa para cada grupo de tratamento de cinco camundongos, combine 300 microliters do PBMC apropriado e 300 microliters de 8 células tumorais tratadas com metoxipsoralen/UVA em um tubo cônico de 1,5 mililitro e misture as células. Em seguida, abra os grampos de tubo de entrada e saída da placa ti. Use uma seringa de 10 mililitros para encher a tubulação de TI com FBS, fechando os grampos à medida que a tubulação é preenchida para reter FBS dentro da tubulação.

Desconecte a seringa. Coloque uma ponta de pipeta P1000 com segurança na entrada da placa DE TI. Segure a placa em um ângulo de 45 graus e encha a placa lentamente com PBMC e mistura de células tumorais, evitando bolhas.

Retire a ponta da pipeta da entrada antes de liberar o êmbolo da pipeta. Devolva as células restantes ao tubo cônico de 1,5 mililitro. Incubar a tubulação cheia de FBS, a placa ti cheia de células e o tubo cônico de 1,5 mililitro contendo as células restantes na incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, solte os grampos e esvazie a tubulação de TI pela gravidade. Em seguida, insira uma ponta de pipeta P1000 com o êmbolo pressionado na porta da placa para remover as células da placa de TI. Segure a placa em um ângulo de 45 graus e encha a ponta da pipeta P1000.

Coloque as células de volta em seu tubo cônico original de 1,5 mililitro. Para executar a placa TI, conecte o tubo de saída à placa e fixe a placa TI no sistema de execução da placa. Em seguida, usando uma seringa de um mililitro, elas desenhem os 600 microliters de PBMC e mistura de células tumorais a partir do tubo cônico de 1,5 mililitro.

Coloque a seringa no tubo de entrada com o grampo aberto e encha lentamente até que o fluido atinja a extremidade da tubulação. Conecte a extremidade livre do tubo de entrada à placa TI e continue carregando suavemente o volume restante. Feche o grampo de entrada quando terminar.

Desprender a seringa de um mililitro e conecte a tubulação de entrada à bomba de seringa. Fixar a tubulação de saída a um tubo cônico limpo de 1,5 mililitro para coleta celular. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,09 mililitros por minuto.

Incline a placa de TI aproximadamente 30 graus em direção ao lado da bomba de seringa usando uma plataforma de execução de placa TI. Solte cuidadosamente o grampo na tubulação de entrada. Inicie a bomba de seringa, observando cuidadosamente como a placa de TI preenche.

Uma vez que a placa de TI esteja completamente preenchida, incline-a aproximadamente 30 graus na direção oposta à medida que esvazia. Quando todas as células do líquido estiverem no tubo de coleta cônica de 1,5 mililitro, pare a bomba. Para lavar a placa de TI, desconecte o tubo de entrada da bomba de seringa e conecte-a a uma seringa de um mililitro cheia com 600 microliters de FBS.

Encha até que o FBS esteja totalmente carregado. Em seguida, desconecte a seringa e conecte a tubulação à bomba de seringa. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,49 mililitros por minuto.

Solte o grampo de entrada e execute a placa de TI, recolhendo a lavagem no mesmo tubo cônico de 1,5 mililitro. Bata ou toque na placa de TI suavemente o tempo todo para ajudar a desprender e eludir quaisquer células aderentes à medida que a placa esvazia. Desconecte a coleção de tubo cônico de 1,5 mililitro da configuração da placa TI.

Gire o tubo de coleta no microfuge de bancada a 250 vezes G por oito minutos e descarte o supernascer. Para realizar a co-incubação noturna de PBMC com antígeno, primeiro resuspend o PBMC e a pelota de células tumorais em dois mililitros de RPMI claro suplementado com soro de rato 15%. Em seguida, as células de placa em um prato estéril não-tecido de 35 milímetros e incubam durante a noite sob condições padrão de cultura tecidual.

No dia seguinte, desprende cuidadosamente todas as células aderentes do fundo do prato com um raspador de cultura de tecido. Gire o prato enquanto raspa para garantir a coleta uniforme da célula. Colete as células em um tubo de 15 mililitros.

Adicione dois mililitros de PBS ao prato, e repita o passo de raspagem, coletando as células no mesmo tubo. Enxágüe a lousa de 35 milímetros com um mililitro de PBS e adicione a lavagem ao mesmo tubo. Gire a 250 vezes G em uma centrífuga de cultura tecidual padrão por 10 minutos para coletar as células.

Pipeta cuidadosamente fora do supernante, em seguida, flick o tubo para resuspend a pelota. A terapia mostrou redução do crescimento do tumor YUMM1.7 em mais de 100 camundongos tratados versus controle, como observado nos dados cumulativos de crescimento tumoral de nove experimentos independentes realizados ao longo de dois anos. As curvas representativas de crescimento tumoral para animais individuais dentro de um experimento proporcionam uma sensação de variabilidade no sistema.

Quando monócitos ou plaquetas são esgotados da fração PBMC, ou quando a passagem da placa é omitida, o efeito terapêutico não é mais observado. O tratamento é ineficaz na ausência de células imunes ou de uma fonte de antígeno, ou na presença de um antígeno incompatível, como os tumores YUMM1.7 tratados usando células de carcinoma de cólon MC38. Para um desfecho imunizante, também é fundamental evitar a exposição do PBMC a 8-metoxipsoralen.

A análise facs da alteração dos marcadores indicados dos controles de IgG correspondentes em células CD11c+humanas entre PBMC recém-isolado, PBMC tratado por TI, PBMC tratado por TI sem passagem de placa, plaquetas esgotadas antes da passagem da placa, ou ambos os acima, mostrou que a ativação de DC depende da presença de plaquetas no PBMC, e na passagem da placa TI. Os DCs humanos ativados pela TI podem efetivamente processar e cruzar os antígenos de peptídeos, ou antígenos de células tumorais humanas expostas à TI para ativar linhas de células T específicas de antígenos humanos em ensaios in vitro de forma dependente de TI e plaquetas. A especificidade das respostas das células T depende da fonte dos antígenos processados.

Ao induzir imunidade anticâncer, a apoptose de cada linha celular cancerosa deve ser titulada para maximizar a imunogenicidade. Uma vez que a imunidade induzida será específica para imunizar antígenos, será possível dissecção detalhada de cada sistema. Cada câncer experimental ou clínico, e cada resposta antimicrobiana, será exclusivamente informativo.

Cada câncer humano individual tem sua própria matriz de antígenos específicos para tumores. O PhDC realiza a triagem e apresentação necessária de antígenos tumorais, sem exigir sua identificação laboratorial prévia. Por favor, tenha em mente que 8-MOP e luz UVA são cancerígenos.

Use equipamentos de proteção adequados e siga os procedimentos de segurança ao manusear 8-MOP e ao trabalhar com fontes de luz UVA.