Name: Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a detectar ácido iofenóxico no soro de mangustos usando LC-MS/MS e precipitação proteica. Este método valida a ingestão de iscas vacinais contra raiva em animais silvestres.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa de pesquisa intramural do departamento de agricultura dos EUA, serviço de inspeção de saúde animal e vegetal, serviços de vida selvagem, programa nacional de gestão da raiva e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemanha).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do USDA National Wildlife Research Center o protocolo de pesquisa aprovado QA-2597.
Nota: o seguinte protocolo descreve o procedimento de análise para detectar o ácido metil-iofenoxico no soro de mangusto. Este método é a versão final de um processo iterativo que começou com a análise do ácido etil-iofenoxico no soro do Mongoose. Durante a avaliação inicial do ácido etil-iofenoxico foram feitas modificações menores nos métodos, resultando no protocolo final apresentado abaixo. Os resultados representativos incluem aqueles obtidos durante ambas as iterações.
1. preparação de soluções e normas
<ol><li>Compre-me-IPA e et-IPA.</li>
	<li>Para A fase móvel A, prepare 1 L de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em água, combinando 1 mL de ácido fórmico com 1 L de água ultrapura (≥ 18 MΩ). Para a fase móvel B, prepare 1 L de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em acetonitrila (ACN) combinando 1 mL de ácido fórmico com 1 L de ACN.</li>
	<li>Para diluente, prepare 200 mL de 0,5% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) na ACN, combinando 1 mL de TFA com 200 mL de ACN.</li>
	<li>Prepare soluções de ações do IPA concentrado de me-IPA e et-IPA na ACN em concentrações de aproximadamente 1.000 μg/mL.<ol>
<li>Pesar aproximadamente 10 mg de me-IPA em um microbalança e gravar a massa para ± 0, 1 mg. transferir quantitativamente o me-IPA para um balão volumétrico de 10 ml classe a usando 45 ml ACN. SONICATE 1 min para dissolver todos os sólidos e, em seguida, trazer para o volume com ACN.</li>
		<li>Transferência ~ 8 mL de cada estoque para âmbar 8 mL frascos de vidro com poli-tetrafluoroetileno (PTFE)-tampas forrado. Armazene à temperatura ambiente (RT). Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para o estoque 25x-7 me-IPA (tabela 1), prepare um estoque de me-IPA na ACN em aproximadamente 200 μg/ml. Exemplo: Transfira 1 mL do estoque concentrado do me-IPA da etapa 1.4.2 para um balão volumétrico de 5 mL de classe A usando uma seringa de vidro de 1.000 μL. Diluir ao volume com a ACN. Transfira o estoque para um frasco de vidro âmbar de 8 mL com tampa revestida com PTFE. Loja em RT.</li>
	<li>Prepare as seis ações adicionais 25x me-IPA descritas na tabela 1. Para cada estoque, combine os volumes indicados usando um pipetador de repetição em um frasco de vidro âmbar âmbar de 8 ml com tampa revestida com PTFE. Armazene cada estoque em RT.</li>
	<li>Para o estoque substituto 25x, prepare um estoque substituto de me-IPA na ACN em aproximadamente 10 μg/mL do estoque concentrado preparado na etapa 1.4.2. Transfira 0,100 mL do estoque concentrado de me-IPA para um balão volumétrico de 10 mL de classe A usando uma seringa de vidro de 100 μL e, em seguida, diluir em volume com a ACN.<ol>
<li>Transfira ~ 8 mL para um frasco de vidro âmbar de 8 mL com tampa revestida com PTFE. Armazene no RT. Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare os estoques de 4x contendo ambos os analitos em frascos de amostrador automático de vidro com rosca de 2 mL, conforme descrito na tabela 2.<ol>
<li>Por exemplo, para preparar o estoque 4x-7, para um frasco de 2 mL, adicione 0,20 mL do estoque 25x-7 me-IPA da etapa 1,5 usando um pipetador de repetição com uma ponta de capacidade de 0,5 mL. Adicione 0,20 mL do estoque de 25 x et-IPA substituto da etapa 1,7 usando uma pipeta de repetição com 0,5 mL de ponta de capacidade.</li>
		<li>Adicionar 0,85 mL de ACN utilizando uma pipeira de repetição com 1 mL de ponta de capacidade. Tampe o frasco com firmeza e inverta 5x para misturar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a curva padrão em frascos de amostrador automático de rosca de 2 mL, conforme descrito na tabela 3.<ol>
<li>Por exemplo, para preparar o padrão 7 (STD 7), para um frasco para injetáveis de 2 mL, adicione 0,20 mL do estoque 4x-7 da etapa 1.8.2 usando um pipetador de repetição com 0,5 mL de ponta de capacidade. Adicionar 0,60 mL de água de DI ultrapura utilizando um pipetador de repetição com 1 mL de ponta de capacidade. Tampe o frasco com firmeza e inverta 5x para misturar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da amostra
Cuidado: o pessoal que executa este procedimento deve ter recebido a série cheia de profilaxia da pre-exposição da raiva e ter um Titer documentado do anticorpo da raiva acima de 0,5 UI de uma facilidade médica designada da saúde ocupacional federal. O pessoal deve usar casacos de laboratório e proteção ocular em todos os momentos durante a realização da extração. Cuidado: execute as etapas 2.3 − 2.6 em um gabinete de biossegurança de classe II.
<ol><li>Para cada amostra, prepare um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 200 − 300 mg de NaCl. organize os tubos em um rack de plástico 80-position. Reserve para uso na etapa 2,6. Nota: uma colher micro (ou outro dispositivo de medição pequeno) é recomendada para um grande número de amostras.</li>
	<li>Para cada amostra, rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: um como "A" e o outro como "B". Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.</li>
	<li>Coloc os seguintes materiais e equipamento necessários para a extração do soro em um armário da Biossegurança da classe II: tubos do microcentrifugador (nos cremalheiras) preparados nas etapas 2,1 e 2,2, um misturador do vortex, pipetador da repetição com 0,5 ml e 5 pontas da capacidade de ml, deslocamento de ar de 100 − 1000 μl Pipetar com 1.000 μL de pontas, recipientes com cerca de 100 mL cada um de água DI diluente e ultrapura, e um contentor de resíduos de risco biológico.</li>
	<li>Retire as amostras de soro do armazenamento congelado e aqueça a RT no gabinete de biossegurança. Vortex misturar cada amostra de soro antes da amostragem.</li>
	<li>Usando um pipetador de repetição com 0,5 ml de ponta de capacidade, dispense 0, 50 ml de soro de mangusto no tubo "a" e adicione 0, 50 ml de 25x de estoque substituto. Em seguida, adicione 0,950 mL de diluente ao tubo "A" utilizando um pipetador de repetição com 5 mL de ponta de capacidade. Tampão firmemente e mistura do Vortex para 10 − 15 s.</li>
	<li>Dispense o NaCl pre-pesado da etapa 2,1 no tubo "A" e A mistura 3x do Vortex para 8 − 12 s. Limpe as superfícies exteriores da cremalheira do frasco contendo o tubo "A" que usa o isopropanol de 70% (v/v). Nota: a cremalheira das amostras pode agora ser removida do armário da Biossegurança da classe II.</li>
	<li>Tubo de centrifugação "A" a 12.000 x g durante 1 min para separar as fases aquosa e ACN. Pipetar 0,80 mL da fase superior da ACN para o tubo "B" utilizando uma pipeta de deslocamento aéreo de 100 − 1000 μL. Transfira a solução remanescente no tubo "a" para resíduos perigosos e elimine o tubo vazio num contentor de resíduos bioperigosos.</li>
	<li>Retire a ACN e a TFA do tubo "B" com um caudal suave de gás N2 num banho de água de 45 ° c.</li>
	<li>Adicionar 0,250 mL de ACN ao tubo "B" utilizando um pipetador de repetição, mistura Vortex para 4 − 5 s e, em seguida, centrifugar brevemente (2 − 4 s) a 12.000 x g para recolher o líquido na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 0,750 ml de água de di ultrapura ao tubo "B" usando um pipetador da repetição com ponta da capacidade de 5 ml, mistura do Vortex para 4 − 5 s, e centrifugue então por 1 minuto em 12.000 x g para esclarecer a amostra.</li>
	<li>Transfira 0,75 mL do sobrenadante para um frasco para injetáveis de amostrador automático utilizando uma pipeta de deslocamento de ar 1.000 μL. Descarte as pontas da pipeta no recipiente de resíduos de risco biológico.</li>
	<li>Frascos de amostrador automático Cap de forma segura e analisar por LC-MS/MS (seção 4). Transfira a solução remanescente no tubo "B" para resíduos perigosos e elimine o tubo vazio num contentor de resíduos bioperigosos. Elimine todos os resíduos bioperigosos por autoclavagem ou incineração.</li>
</ol>3. amostras de controle de qualidade
Cuidado: siga as instruções de advertência descritas na seção 2.
Nota: o procedimento a seguir descreve o número mínimo de amostras de controle de qualidade (QC) necessárias para uma análise. As repetições em cada nível são recomendadas se o soro suficiente do Mongoose do controle está disponível.
<ol><li>Prepare quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 200 − 300 mg de NaCl. Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.</li>
	<li>Para cada amostra de QC, rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: um como "A" e o outro como "B". Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.</li>
	<li>Repita o passo 2,3.</li>
	<li>Remova o soro do Mongoose do controle do armazenamento congelado e aqueça-o ao RT no armário do biossegurança. Vortex misturar o soro de controle antes da amostragem.</li>
	<li>Dispense 0, 50 ml de soro de Mongoose de controle nos quatro tubos de "a" de 1,5 ml usando um pipetador de repetição com uma ponta de capacidade de 0,5 ml.</li>
	<li>Fortifique cada uma das quatro amostras do QC conforme especificado na tabela 4 usando um pipetador de repetição com 0,5 ml de ponta de capacidade. Tampão cada amostra do QC firmemente e mistura do Vortex para 10 − 15 s.</li>
	<li>Realize o procedimento de extração conforme descrito nas etapas 2.6 − 2.12.</li>
</ol>4. análise LC-MS/MS
<ol><li>Configure o LC-MS/MS com todos os parâmetros descritos na tabela 5. Ligue a LC-MS/MS e permita que a coluna atinja 70 ° c antes de definir a vazão para 0,800 mL/min.</li>
	<li>Configure uma sequência no software de aquisição de dados (tabela de materiais) para injetar a curva padrão antes e depois de cada lote constituído por amostras de controle de qualidade e amostras desconhecidas.</li>
	<li>Injete todos os padrões e amostras e adquira cromatogramas de íons MRM usando parâmetros listados na tabela 5.</li>
	<li>Após a conclusão da sequência, desligue a LC-MS/MS e elimine todos os frascos para amostradores automáticos como resíduos perigosos.</li>
</ol>5. quantificação do
<ol><li>Use o software de análise de dados para gerar uma curva de calibração de respostas relativas versus concentrações relativas para me-IPA usando et-IPA como padrão interno. Calcule as respostas relativas da transição do quantificador MRM para me-IPA (556,6 → 428,7) dividida pela transição de MRM para et-IPA (570,7 → 442,7). Construa uma curva de calibração de 7 níveis usando uma função quadrática de segunda ordem que é ponderada 1/x e ignora a origem.</li>
	<li>Calcule a concentração sérica (soroC) de me-IPA usando a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> onde oinstrumento c é a concentração determinada pelo instrumento a partir da curva de calibração em unidades de μg/mL, 1,25 é o <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> fator de diluição, vfinal é o volume amostral final (1,0 ml), e osoro v é o volume sérico em ml ( 0, 50 mL nominal).</li>
</ol>

<ol><li>Nel, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mongoose+rabies+in+southern+Africa%3A+a+re-evaluation+based+on+molecular+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology.</a> Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).</li>
<li>Zieger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phylogeography+of+rabies+in+Grenada%2C+West+Indies%2C+and+implications+for+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251(2004).</li>
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<li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+of+oral+rabies+vaccination+in+wild+carnivores+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States.</a> Virus Research. 111, 68-76 (2005).</li>
<li>Blanton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+of+small+Asian+mongoose+%28Herpestes+javanicus%29+against+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).</li>
<li>Vos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+vaccination+of+captive+small+Indian+mongoose+%28Herpestes+auropunctatus%29+against+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies.</a> Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).</li>
<li>Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ONRAB%C2%AE+bait+matrix+flavor+preference+by+mongoose+%28Herpestes+auropunctatus%29+in+Puerto+Rico%3A+Implications+for+Oral+Rabies+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Caribbean+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination.</a> Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).</li>
<li>Ortmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+studies+with+the+oral+rabies+virus+vaccine+strain+SPBN+GASGAS+in+the+small+Indian+mongoose+%28Herpestes+auropunctatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus).</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 90(2018).</li>
<li>Linhart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+evaluation+of+baits+for+delivering+oral+rabies+vaccines+to+raccoons+%28Procyon+lotor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor).</a> Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).</li>
<li>Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rhodamine+B+as+a+biomarker+for+raccoons%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Wildlife+Interactions%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons.</a> Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).</li>
<li>Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+potential+techniques+for+identifying+individual+stoats+%28Mustela+erminea%29+visiting+control+or+monitoring+stations%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations.</a> New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).</li>
<li>de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+iophenoxic+acid+to+assess+bait+uptake+by+European+badgers%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Vertebrate+Pest+Management%22%5BJournal%5D)">Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers.</a> Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).</li>
<li>Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfadimethoxine+and+rhodamine+B+as+oral+biomarkers+for+European+badgers+%28Meles+meles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles).</a> Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).</li>
<li>Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iophenoxic+Acid+as+a+Long-Term+Marker+for+Wild+Boar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).</li>
<li>Creekmore, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+baits+and+baiting+strategies+for+delivering+oral+vaccine+to+mongooses+in+Antigua%2C+West+Indies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies.</a> Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).</li>
<li>Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+baiting+system+for+delivery+of+an+oral+plague+vaccine+to+black-tailed+prairie+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs.</a> Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).</li>
<li>Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Rhodamine+B+as+a+biomarker+for+oral+plague+vaccination+of+prairie+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs.</a> Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).</li>
<li>Johnston, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+significance+of+tetracycline+stability+in+rabies+vaccine+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits.</a> Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).</li>
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</ol>

Autores AV e SO são funcionários em tempo integral de um fabricante de isca de vacina oral raiva.

O método de LC-MS/MS desenvolvido para os estudos utilizou a seletividade da monitoração múltipla da reação para quantificar com precisão o me-IPA e o et-IPA no soro do Mongoose. A seletividade da detecção de MS/MS também permitiu um protocolo simples de limpeza que dependesse unicamente de acetonitrila para precipitar proteínas do soro antes da análise.
Os ácidos iofenóxicos são solúveis em ACN, mas são praticamente insolúveis em água. Para excluir a água da extração da ACN, foi adicionado cl...

O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos (EUA), esta atividade de gestão é coordenada pelo USDA/APHIS/Wildlife Services programa nacional de gestão da raiva (NRMP)4. Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. Pesquisa em vacinas contra a raiva e vários tipos de isca para mangustos tem sido conduzido com resultados promissores sugerindo um programa ORV para mangustos é possível5,6,7,8.
O monitoramento do impacto da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração na soroprevalência de anticorpos RV. No entanto, essa estratégia pode ser desafiadora em áreas com programas ativos de ORV de vida selvagem ou em áreas onde o VD é enzoótico e níveis de fundo de anticorpos neutralizantes RABV (RVNA) estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incluído na isca ou a matriz de isca externa pode ser útil.
Vários marcadores biológicostêm sido utilizados para monitorizar a captação de iscas em numerosas espécies, incluindo guaxinins (Procyon lotor)9,10, Estats (Mustela arminho)11,12, texugos europeus ( Meles) 13, javalis selvagens (Sus scrofa)14, pequenos mangustos indianos15 e cães da pradaria (cynomysludovicianus)16,17, entre outros. Nos EUA, as iscas operacionais de ORV freqüentemente incluem um biomarcador de tetraciclina a 1% na matriz de isca para monitorar a captação de iscas18,19. Entretanto, os inconvenientes ao uso do tetraciclina incluem uma preocupação crescente sobre a distribuição dos antibióticos no ambiente e que a deteção do tetraciclina é tipicamente invasora, exigindo a extração ou a destruição do dente do animal para obter o osso amostras20. A rhodamina B foi avaliada como um marcador em uma variedade de tecidos e pode ser detectada usando luz ultravioleta (UV) e fluorescência no cabelo e bigodes10,21.
O ácido iofenoxico (IPA) é um pó branco, cristalino que tem sido utilizado para avaliar o consumo de iscas em coiotes (Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, Red Fox (VulpesVulpes)24, guaxinins 9 anos de , 25, javali14, cervos vermelhos (Cervus elaphus scoticus)26, Badgers europeus12 e furões (M. furo)27, entre várias outras espécies de mamíferos. Os tempos de retenção do IPA variam por espécies de menos de duas semanas em alguns marsupiais28,29, para pelo menos 26 semanas em ungulados26 e mais de 52 semanas em cães domésticos (Canis lupus familiaris)30. Os tempos de retenção também podem ser dependentes da dose31. O ácido iofenoxico liga-se fortemente à albumina sérica e foi historicamente detectado pela medição dos níveis de iodo no sangue32. Esta aproximação indireta foi suplantada por métodos da cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) para medir diretamente concentrações do ácido iophenoxic com deteção UV33, e eventualmente com cromatografia líquida e espectrometria maciça (LCMS) 34,35. Para este estudo, foi desenvolvida uma cromatografia líquida altamente sensível e seletiva com método de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) que utiliza o monitoramento de múltiplas reações (MRM) para quantificar dois análogos do ácido iofenoxico. Nosso objetivo foi usar este método LC-MS/MS para avaliar a capacidade de marcação de 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido propanoico (metil-IPA ou me-IPA) e 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido butanóico (etil-IPA ou et-IPA) e quando entregues em um ORV isca para Mongooses em cativeiro.
Os Mongooses foram capturados vivos em armadilhas da gaiola iscas com as salsichas fumadas comercialmente disponíveis e o óleo de peixes. Mongooses foram alojados em individuais 60 cm x 60 cm x 40 cm gaiolas de aço inoxidável e alimentados com uma ração diária de ~ 50 g alimento de gato seco comercial, suplementado duas vezes por semana com uma coxa de frango disponível comercialmente. A água estava disponível ad libitum. Nós entregamos dois derivados de IPA, de ethyl-IPA e de methyl-IPA, aos mangustos cativos em baits do placebo ORV. Todas as iscas foram compostas de um blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm com revestimento externo (doravante "matriz de isca") contendo ovo de frango em pó e gelatina (tabela de materiais). As iscas continham 0,7 mL de água ou derivado do IPA e pesaram aproximadamente 3 g, dos quais ~ 2 g foi a matriz de isca externa.
Nós oferecemos 16 mangustos cativas et-IPA em três concentrações: 0,14% (2,8 mg et-IPA em ~ 2 g de matriz de isca; 3 machos [m], 3 fêmeas [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 3M, 3F) e 1,0% (7,0 mg de etil-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 2m , 2f). A dose global de 2,8 mg corresponde a uma taxa de dose de 5 mg/kg27,36 e baseia-se num peso médio de mangusto de 560 g em Porto Rico. Nós selecionamos 1% como a concentração a mais elevada como a pesquisa sugere a aversão do gosto a alguns biomarcadores pode ocorrer em concentrações > 1% em algumas espécies37. Nós oferecemos somente a dose de 1% no bloco de bolha como a floculação impediu o soluto de dissolver-se no solvente suficientemente para ser incorporado uniformente na matriz da isca. Um grupo controle (2m, 1f) recebeu iscas cheias de água estéril e sem IPA. Nós oferecemos iscas para mangustos na parte da manhã (~ 8 a.m.) durante ou antes da alimentação de sua ração de manutenção diária. Restos de isca foram removidos após aproximadamente 24 horas. Foram coletadas amostras de sangue antes do tratamento, um dia após o tratamento e, em seguida, semanalmente até 8 semanas após o tratamento. Nós Anestesiaram mangustos pela inalação do gás do isoflurano e coletamos até 1,0 ml do sangue inteiro pelo punção venosa da veia craniana oca como descrita para furões38. Nós centrifugados amostras inteiras do sangue, sera transferido aos cryovials e armazenamos-os em-80 ° c até a análise. Nem todos os animais foram amostrados durante todos os períodos de tempo para minimizar os impactos do sangue repetido se baseia na saúde dos animais. Os animais de controle foram amostrados no dia 0, depois semanalmente por até 8 semanas após o tratamento.
Nós entregamos o me-IPA em três concentrações: 0, 35% (0,7 MGS), 0, 7% (1,4 MGS) e 0,14% (2,8 MGS), todos incorporados na matriz da isca, com 2 machos e 2 fêmeas por o grupo do tratamento. Dois machos e duas fêmeas receberam iscas cheias de água estéril e sem IPA. Os tempos de oferecimento da isca e a anestesia do Mongoose são descritos acima. Nós coletamos amostras de sangue antes do tratamento no dia 1, e então semanalmente até 4 semanas após o tratamento.
Foram testados dados de concentração sérica para normalidade e médias estimadas para concentrações séricas de IPA de diferentes grupos de tratamento. Utilizou-se um modelo linear misto para comparar as concentrações médias de et-IPA sérica agrupadas em indivíduos. O tipo da isca (matriz/bloco de bolha) era um efeito fixo além do que o dia experimental, visto que a identificação animal era um efeito aleatório. Todos os procedimentos foram executados utilizando software estatístico comum (tabela de materiais) e a significância foi avaliada em α = 0, 5.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila, grau Optima</td><td>Fisher</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td></td></tr><tr><td>C18 coluna, 2,1 x 50 mm, 2,5-&micro; m tamanho de partícula</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td>186003085</tr><tr><td>ESI Source</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G1958-65138</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etil-iofenóxico, 97</td>% <td>Sigma Aldrich</td><td>N / A</td><td>Lote MKBP5399V</td></tr><tr><td>ácido fórmico, grau LC / MS</td><td>Fisher</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>Software LCMS</td><td>Agilent</td><td>MassHunter Aquisição de dados e análise</td><td></td>quantitativa</tr><tr><td>Ácido metil-iofenóxico, 97% (p / p)</td> <td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N / A</td><td>Lote PR0709514717</td></tr><tr><td>Balança microanalítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP6U</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>MS / MS</td><td>Agilent</td><td>G6470A</td><td></td></tr><tr><td>N-Evap</td><td>Organomation</td><td>115</td><td></td></tr><tr><td>Iscas orais para vacina anti-rábica</td><td>IDT Biologika, Dessau Rossleau, Alemanha</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propil-iofenóxico, 99 % (m/m)</td><td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N/A</td><td>Lote PR100612108RR</td></tr><tr><td>Pipettor de repetição</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de frasco de amostrador automático com tampa de rosca,</td><td>Agilent</td><td>5190-7024</td><td></td>revestido com PTFE</tr><tr><td>Cloreto de sódio, certificado ACS grau Fisher</td><td></td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de software estatístico</td><td>SAS Institute, Cary, Carolina do Norte, EUA N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 Series</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de Vórtice</td><td>Glas-Col</td><td>099A PV6</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipetador de 0,2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.413</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipetador de 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.421</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>14-666-325</td><td></td></tr><tr><td>1250-& Micro; Ponteiras de pipeta com capacidade L</td><td>GeneMate</td><td>P-1233-1250</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras pipetadoras de 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.43</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de amostrador automático âmbar com tampa de rosca de 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipetador de 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.456</td><td></td></tr><tr><td>Rack de tubo de microcentrífuga de 80 posições</td><td>Fisher</td><td>05-541-2</td><td></td></tr><tr><td>Frascos âmbar de 8 mL com Tampas revestidas com PTFE</td><td>Wheaton</td><td>224754</td><td></td></tr><tr><td>70% (v/v) isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A459</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L pipeta de deslocamento de ar</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de análogos de ácido iofenoxico em pequeno mangusto indiano (herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

O Mongoose indiano pequeno (auropunctatus de Herpestes) é um reservatório do vírus da raiva (rabv) em Puerto Rico e compreende sobre 70% de casos animais da raiva relatados anualmente. O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado por uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. A pesquisa em vacinas orais da raiva e em vários tipos da isca para mangustos foi conduzida com resultados prometedores. O monitoramento do sucesso da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração nos anticorpos neutralizantes da RABV (RVNA) pós-vacinação. Esta estratégia pode ser difícil de interpretar em áreas com um programa ORV de vida selvagem ativa ou em áreas onde o RABV é enzoótico e níveis de fundo de RVNA estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incorporado com a vacina ou a matriz de isca pode ser útil. Nós oferecemos 16 mangustos em cativeiro placebo ORV iscas contendo ácido etil-iofenoxico (et-IPA) em concentrações de 0,4% e 1% dentro da isca e 0,14% na matriz de isca externa. Nós também oferecemos 12 mangustos cativos ORV iscas contendo ácido metil-iofenoxico (me-IPA) em concentrações de 0, 35%, 0, 7% e 0,14% na matriz de isca externa. Nós coletamos uma amostra do soro antes da oferta da isca e então semanalmente por até oito semanas de oferta do borne. Nós extraímos ácidos iophenoxic dos soros no acetonitrila e quantificamos usando a cromatografia líquida/espectrometria maciça. Foram analisados soros para et-IPA ou me-IPA por cromatografia líquida-espectrometria de massas. Nós encontramos a habilidade adequada da marcação por pelo menos oito e quatro semanas para o et-e o me-IPA, respectivamente. Ambos os derivados IPA poderia ser adequado para avaliação de campo de captação de isca ORV em Mongooses. Devido à longevidade do marcador em soros de Mangusto, o cuidado deve ser tomado para não confundir os resultados usando o mesmo derivado IPA durante avaliações consecutivas.

Os cromatogramas de íons representativos de uma análise do me-IPA são apresentados na Figura 1. O soro do Mongoose do controle (Figura 1a) ilustra o tempo de retenção de et-IPA (analyte substituto) e a ausência de me-IPA no tempo de retenção indicado. A amostra de controle de qualidade (Figura 1b) ilustra a separação de linha de base do me-IPA do et-IPA, bem como as transições de quantificador e qual...

Nós oferecemos mangustos prisionais placebo iscas de vacina contra a raiva oral com ácido etílico ou metil iofenóxico como um biomarcador e verificado captação de isca usando uma nova cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) método.

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Delineamos um procedimento para detectar e quantificar o ácido iofenoxico no soro de mangusto. Os resultados sugerem que o ácido iofenoxico pode ser usado como um marcador biológico para verificar a absorção beta na espécie. A principal vantagem deste método é que ele permite a quantificação de análogos de ácido iofenoxico em partes por bilhão de níveis, usando uma técnica simples de executar precipitação proteica.Para a fase móvel A, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de água ultra pura. Para a fase móvel B, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de acetonitrila. Para o diluente, combine um mililitro de ácido trifluoroacético com 200 mililitros de acetonitrilo.Em seguida, pese aproximadamente 10 miligramas de metil-IPA em microequilípmo, e registe a massa para mais ou menos 0001 miligramas. Transfira quantitativamente o metil-IPA para um frasco volumoso classe A de 10 mililitros, usando quatro a cinco mililitros de acetonitrilo. Sonicate por um minuto para dissolver todos os sólidos e, em seguida, trazer a volume com acetonitrilo.Transfira aproximadamente oito mililitros de cada estoque para oito frascos de vidro âmbar mililitro com tampas forradas com

analysis-iophenoxic-acid-analogues-small-indian-mongoose-herpestes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica para detecção de antígenos do vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos infectados. O processo inclui desparafinização e tratamento com álcool, seguido de tratamento proteolítico para aumentar a acessibilidade ao antígeno. A coloração imuno-histoquímica revela precipitados vermelhos, confirmando a presença de antígenos antirrábicos na seção tecidual.

Uma coloração imuno-histoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva

O teste imunoistoquímico rápido direto (DRIT) oferece uma organização mundial para a saúde animal e organização mundial da saúde (OIE/OMS) reconhecida alternativa ao teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) para o diagnóstico de raiva. Este teste permite aplicações baseadas em campo que podem ser executadas em aproximadamente 1 h em cima das impressões do cérebro usando a microscopia de luz.

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

O objetivo deste protocolo é demonstrar técnicas de necropsia seguras em animais pequenos e grandes para obter amostras de tecido satisfatórias para o teste de raiva.

Técnicas de necropsia da raiva em animais grandes e pequenos

Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Este protocolo apresenta uma abordagem baseada em qRT-PCR para determinar o número de cópia genética do vírus da raiva (N) dentro de várias estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando transcrição in vitro.

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Este método descreve a encapsulação do antígeno da raiva em micropartículas poliméricas biodegradáveis com propriedades estruturais e materiais que permitem a liberação pulsátil após um atraso pré-determinado. A avaliação ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) do antígeno recuperado do núcleo da partícula confirma a presença de glicoproteína intacta do vírus trimérico da raiva através da fabricação de partículas.

Fabricação de Micropartículas Poliméricas Pulsáteis Encapsulando o Antígeno Rábico

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

O objetivo deste artigo é examinar o uso do teste de imunofluorescência indireta da raiva para a detecção de anticorpos IgG e IgM específicos para raiva.

Detecção de anticorpos IgG e IgM antirrábicos pelo teste de imunofluorescência indireta da raiva

Este protocolo demonstra o ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 desde a coleta do tecido até a interpretação dos resultados, incluindo atualizações nas sequências e formulações de primers para melhorar o desempenho do ensaio para alguns lyssavirus e lagomorfos não anti-rábicos. Também demonstramos a configuração do ensaio para um formato multiplexado LN34 de poço único (LN34M).

Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

Aprenda a detectar ácido iofenóxico no soro de mangustos usando LC-MS/MS e precipitação proteica. Este método valida a ingestão de iscas vacinais contra raiva em animais silvestres.

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

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