Name: Estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a usar espectroscopia vibracional SFG para analisar interfaces de polímeros e biomacromoléculas com seletividade interfacial. Esta técnica óptica não invasiva revela estruturas moleculares em diferentes tipos de interfaces.

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Este estudo foi apoiado pelo programa de desenvolvimento chave do estado para a pesquisa básica de China (2017YFA0700500) e a Fundação Nacional da ciência natural de China (21574020). Os fundos de pesquisa fundamentais para as universidades centrais, um projeto financiado pelo programa de desenvolvimento acadêmico prioritário das instituições de ensino superior de Jiangsu (PAPD) e o centro nacional de demonstração de Engenharia Biomédica experimental Educação (Universidade do sudeste) também foram muito apreciados.

1. SFG experimental
<ol><li>Use um sistema comercial degradam SFG (tabela de materiais), que fornece um feixe de 1064 nm fundamental com uma largura de pulso de ~ 20 PS e uma freqüência de 50 Hz, com base em um Nd: YAG laser.</li>
	<li>Converta o feixe de 1064 nm fundamental em um feixe de 532 nm e um feixe de 355 NM usando módulos de segundo e terceiro harmônicos. Orientar diretamente o feixe de 532 nm como um feixe de luz de entrada e gerar o outro feixe de entrada Mid-Infrared (IR) cobrindo a faixa de freqüência de 1000 a 4000 cm-1 através da geração óptica paramétrica (OPG)/Optical amplificação paramétrica (OPA)/ processo de geração de frequência de diferença (DFG).</li>
	<li>Defina os ângulos de incidente de duas vigas de entrada para ser 53 ° (IR) e 64 ° (visível), respectivamente, versus a superfície normal.</li>
	<li>Para detectar as estruturas interfaciais do polímero (relação da película/carcaça ou película/a outra relação média), use o SSP (feixe s-polarizado da soma-freqüência, feixe visível s-polarizado e feixe infravermelho p-polarizado) e combinações da polarização do PPP.</li>
	<li>Para detectar as estruturas secundárias de proteínas interfaciais e estruturas de água ao redor do DNA, além de SSP e PPP, utilizaram-se combinações de polarização quiral spp e PSP.</li>
	<li>Para garantir que as amostras não foram danificadas, controlar as energias de pulso infravermelho e visível para ser ~ 70 e ~ 30 mJ, respectivamente. Um esquema do processo de SFG com o diagrama de nível de energia foi mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra o sistema SFG em nossa sala limpa.</li>
</ol>2. coeficientes de Fresnel
<ol><li>Use prismas de ângulo reto como substratos para todos os experimentos discutidos aqui. Existem duas interfaces para uma película de polímero sobre o substrato sólido, ou seja, a superfície do polímero no ar e interface de polímero/substrato. Ambos podem gerar sinais de SFG desde que a simetria da inversão é quebrada em ambas as relações. Conseqüentemente, um espectro coletado de SFG é interferido um. Entretanto, os coeficientes locais do campo ou os coeficientes de Fresnel nas duas relações podem ser ajustáveis variando os ângulos do incidente ou a espessura de película uma de cada vez ou simultaneamente31,32. Isto fornece a oportunidade para que nós sonhe o sinal vibracional de SFG de somente uma relação. Aqui, o filme de PHEMA no prisma de CaF2 foi tomado como um exemplo9.</li>
	<li>Como mostrado na Figura 3, empregar a geometria de prisma de ângulo reto para detectar os sinais SFG gerados a partir do filme PHEMA inferior. A intensidade de saída do SFG no modo refletido é expressa como <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">1 onde <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> denota o tensor de susceptibilidade não linear de segunda ordem eficaz. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;">consiste em três partes, a saber, a relação do prisma/polímero, a relação do meio do polímero/fundo (o meio inferior inclui o gás, o líquido ou o sólido.) e o fundo objetos, segundo as indicações da seguinte equação. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq3.jpg" style="opacity: 0.9;">2 Aqui o meio inferior poderia ser ar, água ou qualquer outra coisa. F representa o correspondente coeficiente de Fresnel responsável pela correção de campo local.</li>
	<li>Aplique um modelo de filme fino para calcular os coeficientes de Fresnel neste caso. Aqui somente os procedimentos de cálculo breves são apresentados.<ol>
<li>Para a interface prisma/polímero, use <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq4.jpg" style="opacity: 0.9;">3 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq5.jpg">4 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq6.jpg">5 O significado de cada parâmetro mostrado é apresentado abaixo.<ol>
<li>
ωi denota a frequência do feixe.</li>
			<li>
tp e ts denotam os coeficientes de transmissão globais e podem ser expressos <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">6 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq8.jpg">7</li>
			<li>
tP12 e tS12 denotam os coeficientes de transmissão linear do feixe luminoso na interface prisma/polímero.</li>
			<li>
rP23 e rS23 denotam os coeficientes de reflexão linear do feixe luminoso na interface polímero/meio.</li>
			<li>
α representa a diferença da fase entre um feixe reflexivo e seu feixe reflexivo secundário depois que se propaga através da película fina do polímero e reflete então para trás, que pode ser expressado como <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq9.jpg" style="opacity: 0.9;">8</li>
			<li>
λ representa o comprimento de onda do feixe de luz e d é a espessura da película do polímero.</li>
			<li>
Φ1 e φ2 representam os ângulos do incidente na relação do prisma/polímero e na relação do polímero/meio respectivamente.</li>
			<li>
n1 e n2 representam os índices refrativos do filme prisma e polímero, respectivamente.</li>
			<li>
n . º 12 representa os índices refrativos das camadas interfaciais do polímero para o prisma/polímero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para a interface de polímero/meio, use <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq10.jpg">9 <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq11.jpg">10 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq12.jpg">11<ol>
<li>
Δ representa a diferença de fase dos campos elétricos leves em duas interfaces.</li>
			<li>Porque a largura de pulso para nossos feixes de entrada é ~ 20 picosegundo, o erro do atraso de tempo associado com o efeito da dispersão pode ser negligenciado.</li>
			<li>A expressão de tal diferença de fase para a saída SFG, a entrada visível e os feixes infravermelhos de entrada pode ser escrito separadamente como <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq13.jpg">12 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq14.jpg">13 <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq15.jpg">14 
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>A partir da discussão acima, para o prisma-polímero filme-médio (1-2-3) sistema, expressar o total de coeficientes de Fresnel para o prisma/polímero e polímero/médio interfaces como as seguintes equações, para SSP e PPP polarização combinações . Naturalmente, ambas as interfaces são consideradas azimuthally isotropic.<ol>
<li>Para a interface prisma/polímero, as expressões dos coeficientes de Fresnel total para as combinações de polarização SSP e PPP são apresentadas da seguinte forma.<ol>
<li>Para SSP, a equação é <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq16.jpg">15</li>
			<li>E para PPP, a equação é <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq17v3.jpg" style="opacity: 0.9;">16 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq18v3.jpg" style="opacity: 0.9;">17 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq19v3.jpg" style="opacity: 0.9;">18 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq20v3.jpg" style="opacity: 0.9;">19 
			 </li>
			<li>
t10 e t01 denotam os coeficientes de transmissão linear nas interfaces ar/prisma e prisma/ar respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para a interface polímero/médio, as expressões dos coeficientes de Fresnel totais para as combinações de polarização SSP e PPP são descritas a seguir.<ol>
<li>Para SSP, a equação é <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq21.jpg" style="opacity: 0.9;">20</li>
			<li>Para PPP, as equações são <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq22v3.jpg" style="opacity: 0.9;">21 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq23v3.jpg" style="opacity: 0.9;">22 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq24v3.jpg" style="opacity: 0.9;">23 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq25v3.jpg" style="opacity: 0.9;">24 
			    
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de calcular os coeficientes de Fresnel usando o modelo imprensado, plotar-los como uma função da espessura do filme, como mostrado na Figura 4. Nota: neste caso, existe uma faixa de espessura para coletar o sinal SFG da interface do CaF2 Prism/PHEMA com contribuição negligenciável da outra interface, que é de cerca de 150 nm. Similarmente, uma espessura apropriada pode ser escolhida para a deteção da relação média de PHEMA/Bottom com contribuição negligenciectable da relação de CaF2 Prism/PHEMA.</li>
</ol>3. combinação da polarização de CHiral SFG
<ol><li>Para a interface aquiral normal, comumente, use C∞ v simetria em termos de Ensemble média33,34. Com a operação de simetria de inversão, os componentes do tensor de susceptibilidade não linear de segunda ordem diferente de zero podem ser deduziram, que são cxxz, cXzX, cZxx, cYYZ, cYZY, czyy e czzz (o os termos existentes podem ser ainda mais reduzidos se uma interface isotrópica for assumida, o que significa que x e y são os mesmos). No entanto, para a interface quiral, a situação será diferente. A interface quiral possui a simetria C ∞, apenas a operação de simetria de rotação é permitida. Neste caso, além dos termos aquiral normais, mais susceptibilidades não lineares de segunda ordem será diferente de zero, que pode ser denominado como os termos quirais, a saber, cZYX, cZXY e cyzx a consideração de não-eletrônico Ressonância. Portanto, usando as combinações de polarização PSP, PPS e spp , os espectros quiral SFG podem ser coletados33,34.</li>
</ol>4. preparação da amostra
<ol><li>Preparação do filme PHEMA<ol>
<li>Dissolva o pó de PHEMA (veja a tabela de materiais) no etanol anidro para preparar a solução com 2 WT% e 4 WT% respectivamente.</li>
		<li>Antes da deposição dos filmes PHEMA, mergulhe os prismas do ângulo reto do CaF2 no solvente de tolueno em primeiro lugar e depois lave-os com etanol e água ultrapura (18,2 MΩ · cm).</li>
		<li>Em seguida, expor os substratos (CaF2 prismas de ângulo reto) ao plasma de oxigênio para remover possíveis contaminantes orgânicos por limpador de plasma (ver tabela de materiais).<ol>
<li>Primeiro ligue o limpador de plasma e colocar os substratos nele.</li>
			<li>Em seguida, ligue a bomba de vácuo para aspirar o limpador. Introduza o oxigénio.</li>
			<li>Finalmente, definir 4 minutos para a limpeza. Depois disso, preserve os substratos limpos para a preparação sequencial do filme PHEMA.</li>
			<li>Em seguida, prepare os filmes PHEMA sobre os prismas CaF2 por um spin-Coater (ver tabela de materiais). Ajuste as espessuras da película pela concentração da solução e pela velocidade da rotação.<ol>
<li>Imobilize o CaF2 prisma no disco de sucção de spin-Coater.</li>
				<li>Soltar uma gota da solução PHEMA preparada antes para os substratos limpos em 1.500 RPM por 1 min (espessura de filme 2 WT% para 100 nm e 4 WT% para 200 nm).</li>
			</ol>
</li>
			<li>Anneal todas as películas preparadas de PHEMA em um forno do vácuo em 80 ° c durante a noite.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de fibroína de seda (SF) Nota: adotou-se o protocolo sugerido por Kaplan et al.35 .<ol>
<li>Coloque 7,5 g de casulos de seda de B. Mori na solução aquosa de carbonato de sódio a ferver (na2co3, 0, 2 M) (3 L) durante 30 min. Retire o SF fibroso para um recipiente limpo.</li>
		<li>Lave o SF fibroso obtido com água deionizada por três vezes agitação, a fim de remover as moléculas de sericina e deixar apenas as moléculas SF na amostra fibrosa.</li>
		<li>Seque a amostra fibrosa de SF em um forno a vácuo a 60 ° c durante a noite.</li>
		<li>Em seguida, dissolver a amostra de SF fibrosa degomado em uma solução aquosa de brometo de lítio (LiBr, 9,3 M) (1 g de SF foi resolvido em ~ 4 ml de solução de libr.) e incubar-lo a 60 ° c por 2 h agitação.</li>
		<li>Dialyze a solução SF contra a água deionizada (3.500 da diálise sacos) por 3 dias para remover o LiBr dissolvido. Mude a água deionizada nova três vezes todos os dias. Armazene finalmente a solução processada SF em 4 ° c para uns experimentos mais atrasados de SFG.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do duplex do oligonucleotide da curto-corrente<ol>
<li>Encomende a amostra de oligonucleotídeo com a sua 3 '-End modificada pelo colesterol-trietileno glicol (Chol-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3 ') de uma corporação comercial (ver tabela de materiais), bem como a complementar. Para cada uma das vertentes, dissolver 10 nmol do pó da amostra em 0,5 ml de água ultrapura. Em seguida, misture-os para formar a solução de oligonucleotídeo duplex (10 nmol/mL).</li>
		<li>Misture 2 mg de 1,2-Dipalmitoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 2 mg de DPPC deuterado (d-DPPC) e dissolva-os em 1 mL de clorofórmio para preparar a solução lipídica.</li>
		<li>Preparação do DPPC &amp; monocamada d-DPPC por uma calha Langmuir − Blodgett (LB)<ol>
<li>Prenda o prisma do CaF2 do direito-ângulo a um suporte caseiro da amostra com um rosto prisma mergulhado perpendicularmente no ambiente aquoso da calha lb.</li>
			<li>Depois, injete a solução lipídica mista preparada antes na superfície da água até que a pressão superficial tenha atingido um certo valor abaixo de 34 mN · m− 1.</li>
			<li>Após os níveis da pressão de superfície fora, use duas barreiras do Teflon para comprimir o monocamada do lipido em uma relação de 5 milímetros/minuto até que uma pressão de superfície de 34 MN · m− 1 estêve alcançada.</li>
			<li>Levante o prisma com uma monocamada lipídica para fora da água a uma taxa de 1 mm/min verticalmente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparação da outra monocamada lipídica<ol>
<li>Para facilitar a montagem do oligonucleotide duplex e as moléculas lipídicas através da interação hidrofóbica (colesterol e uma cadeia alquil lipídica), misture a solução de oligonucleotídeo duplex com a solução lipídica em uma proporção molar de 1:100 (oligonucleotídeo para lipídico).</li>
			<li>Injete a solução misturada do oligonucleotide do lipido e do duplex na superfície da água em um recipiente caseiro do Teflon até que uma pressão de superfície de 34 mN · m− 1 estêve alcançada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Finalmente, coloque a monocamada lipídica na parte inferior do prisma em contato com a monocamada lipídica com oligonucleotídeos duplex inseridos na superfície da água para formar a amostra final para a medida do SFG.</li>
	</ol></li>
	<li>Equação de Lorentz<ol>
<li>Use a equação de Lorentz para ajustar os espectros de SFG para extrair a informação vibracional para um modo vibracional específico . <img alt="Equation 26" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq26.jpg" style="opacity: 0.9;">25 onde <img alt="Equation 27" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq27.jpg"> representa a intensidade do modo vibracional QTH , <img alt="Equation 28" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq28.jpg"> representa a freqüência ressonante, <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq29.jpg"> denota a meia largura ao meio máximo (hwhm) e <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq30.jpg"> representa a freqüência de digitalização do feixe de ir incidente.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Não temos nada a revelar.

Para investigar as informações estruturais a partir de um nível molecular, a SFG tem suas vantagens inerentes (ou seja, sensibilidade monocamada ou submonocamada e seletividade interfacial), que pode ser aplicada para estudar várias interfaces, como o sólido/sólido, sólido/ líquido, sólido/gás, líquido/gás, líquido/líquido interfaces. Embora a manutenção do equipamento e o alinhamento ótico sejam ainda demorados, o retorno é significativo em que a informação detalhada do nível molecular nas superfícies e nas relações pod...

O desenvolvimento da espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (SFG) pode ser datado de volta ao trabalho realizado por Shen et al. há trinta anos1,2. A singularidade da seletividade interfacial e da sensibilidade da submonocamada faz com que a espectroscopia vibracional SFG seja apreciada por um grande número de pesquisadores nas áreas de física, química, biologia e ciência dos materiais, etc3,4 ,5. Atualmente, uma ampla gama de questões científicas relacionadas a superfícies e interfaces estão sendo investigadas usando o SFG, especialmente para interfaces complexas com relação a polímeros e biomacromoléculas, como as estruturas da cadeia e o relaxamento estrutural no interfaces de polímeros enterradas, as estruturas secundárias proteicas e as estruturas de água interfacial9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.
Para superfícies e interfaces de polímeros, as amostras de película fina são geralmente preparadas por spin-coating para obter as superfícies ou interfaces desejadas. O problema surge devido à interferência do sinal das duas interfaces dos filmes preparados, o que leva à inconveniência para analisar os espectros coletados do SFG27,28,29. Na maioria dos casos, o sinal vibracional apenas a partir de uma única interface, quer filme/substrato ou filme/o outro meio, é desejável. Na verdade, a solução para este problema é muito fácil, ou seja, para maximizar experimentalmente os campos de luz na interface desejável e minimizar os campos de luz na outra interface. Assim, os coeficientes de Fresnel ou os coeficientes de campo local precisam ser calculados por meio do modelo de filme fino e ser validados em relação aos resultados experimentais3,9,10,11, 12,13,14,15,30.
Com o fundo acima na mente, algumas relações do polímero e as biológicas podiam ser investigadas a fim compreender a ciência fundamental do nível molecular. A seguir, tomando três questões interfaciais como exemplos: sondagem de superfície poli (2-hidroxietil metacrilato) (PHEMA) e interface enterrada com substrato9, formação de fibroína de seda (SF) estruturas secundárias sobre a superfície de POLIESTIRENO (PS) e estruturas de água em torno do modelo de curto-cadeia de oligonucleotídeo duplex16,21, vamos mostrar como a espectroscopia vibracional SFG ajuda a revelar as estruturas de nível molecular interfacial em conexão com a ciência subjacente.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)&nbsp;</td><td>Avanti Lipídios Polares, Inc.</td><td>850355P-1g</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td>&ge; 99,7%</td></tr> <tr><td>CaF2 prisma</td><td>Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10005817</td><td>&ge; 96,0%</td></tr> <tr><td>DPPC deuterado (d-DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860345P-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Forno eletromagnético</td><td>Zhejiang Supor Co., Ltd</td><td>C21-SDHCB37</td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett (LB) através de</td><td>KSV NIMA Co., Ltd.</td><td>KN 2003</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de lítio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20056926</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de síntese Milli-Q</td><td>Água ultrapura</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Chengdu Mingheng Science & Technology Co., Ltd</td><td>PDC-MG</td><td>Limpeza por plasma de oxigênio</td></tr><tr><td>Poli (2-hidroxietil metacrilato) (PHEMA)</td> <td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>192066 MSDS</td><td>Mw = 300 000</td></tr><tr><td>Poliestireno</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>330345 MSDS</td><td>Mw = 48 kDa e Mn = 47 kDa</td></tr><tr><td>Casulos</td><td></td><td></td> de seda <td>de Bombyx mori</td></tr><tr><td>Fita complementar única de oligonucleotídeo</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H03596</td><td>5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'Fita</td></tr> <tr><td>única de oligonucleotídeo</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H04936</td><td>&nbsp; 3&cent;-end modificado por colesterol-trietilenoglicol(Chol-TEG) (5&cent;-GCTTCCGAAGGTCGA-3&cent;)</td></tr><tr><td>Reagente químico anidro Co. de Sinopharm do carbonato de sódio</td><td>, Ltd</td><td>10019260</td><td>&ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Instituto de</td><td>Microeletrônica da Academia Chinesa de Ciências</td><td>KW-4A</td><td>Para a preparação de filmes ploymer&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfilador de passo</td><td>Veeco</td><td>DEKTAK 150</td><td>Para a medição da espessura do filme Sistema de</td></tr><tr><td>espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (SFG)</td><td>EKSPLA</td><td></td><td>Um sistema SFG de picossegundo comercial</td></tr></tbody></table>

estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Como espectroscopia óptica não linear de segunda ordem, a espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (SFG) tem sido amplamente utilizada na investigação de várias superfícies e interfaces. Esta técnica ótica não invasora pode fornecer a informação local do molecular-nível com monoolayer ou sensibilidade do submonolayer. Nós estamos aqui fornecendo a metodologia experimental em como detectar seletivamente a relação enterrada para macromoléculas e biomacromoléculas. Com isto na mente, as estruturas secundárias interfaciais do fibroína e das estruturas de água de seda em torno do duplex modelo da curto-corrente do oligonucleotide são discutidas. O primeiro mostra uma sobreposição da cadeia de cadeia ou o efeito de confinamento espacial e o último mostra uma função de proteção contra os íons Ca2 + resultantes da superestrutura da coluna quiral da água.

Na parte do coeficiente de Fresnel da seção do protocolo, nós mostramos que, teoricamente, é praticável detectar seletivamente somente uma única relação em uma vez. Aqui, experimentalmente, confirmamos que essa metodologia está basicamente correta, como mostra a Figura 5 e a Figura 6.
A Figura 5 mostra a estrutura de PHEMA interfacial enterrada após a intrusão da água com uma película do hidrogel do ~ 150...

Sendo utilizado de forma abrangente, a espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (SFG) pode ajudar a revelar a ordem conformacional da cadeia e a mudança estrutural secundária acontecendo em interfaces de polímero e biomacromolécula.

Estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Espectros vibracionais de geração de frequência soma são equipados para investigar interfaces com seletividade interfacial. No entanto, o método de coeficiente fresnel pode ajudar a resolver o efeito de interferência quando existe outra interface. A principal vantagem do SFG é a seletividade interfacial e a sensibilidade da submonolar.Esta técnica óptica não invasiva é adequada para investir várias interfaces, como redes de líquido sólido, sólido-sólido, líquido-líquido, gás sólido e gás líquido. Sugerimos que os iniciantes obtenham muita prática operando o sistema SFG com a ajuda de especialistas em óptica e do SFG. Não há atalhos.O SFG não tem sido geralmente reconhecido como técnica poderosa, por isso gostaríamos de atrair mais interesse do público e incentivar mais pesquisadores a aplicar essa técnica. Para começar, prepare cerca de cinco milileiros de uma solução de dois ou 4% por peso de metacrilato poli-2-hidroxietila ou PHEMA em etanol anidro. Mantenha a solução no laboratório três dias antes do uso.Em seguida, mergulhe quatro prismas de fluoreto de cálcio de grau IR em tolueno anidra analítica por pelo menos 12 horas. Em seguida, mergulhe os prismas em 30 milileiros de etanol e limpe as superfícies com algodão desengordurante por cerca de 10 minutos. Enxágüe o prisma com água ultra pura por dois minutos e seque-os com gás nitrogênio.Em seguida, coloque os prismas em um limpador de plasma de oxigênio e evacue a câmara. Trate os prismas com plasma de oxigênio por quatro minutos e mantenha-os na câmara até que sejam usados. A preparação do filme deve ocorrer dentro de uma hora após o tratamento plasmá-plasmá-lo.Neste estudo, para detectar seletivamente a interface da barreira é de grande importância escolher a espessura adequada do filme de acordo com o resultado calculado do modelo de coeficiente fresnal. Quando estiver pronto para preparar os filmes DA PHEMA, fixe um prisma limpo em um suporte prisma em um revestimento de giro e aplique uma gota da solução de PHEMA no etanol ao prisma. Execute o revestr de giro a 1.500 RPM por um minuto para preparar o filme PHEMA.Cubra prismas tratados com plasma adicional com PHEMA da mesma forma. Anneal os filmes em um forno a vácuo definido para 80 graus Celsius por pelo menos 10 horas. Para realizar o experimento coloque a face revestida do PRISMA do PRISMA em água deionizada.Aguarde de 10 a 20 minutos e, em seguida, avalie a estrutura phema interfacial nas interfaces de água e prisma com alguma espectroscopia de geração de frequência. Durante o funcionamento do sistema FGS, não deixe o feixe de luz entrar diretamente em seus olhos. Para começar a preparar a solução de fibroina de seda aqueça três litros de carbonato de sódio aquoso molar de 0,02 molar à ebulição.Ferva 7,5 gramas de casulos de seda Bombyx mori nesta solução enquanto mexe por 30 minutos. Transfira a matéria fibrosa para um recipiente limpo e mexa-a em dois a três litros de água desionizada por oito a 10 minutos três vezes para lavar as moléculas de sericina indesejadas. Seque a matéria fibrosa em um forno a vácuo a 60 graus Celsius por pelo menos 15 horas.Em seguida, dissolva um grama de fibroin de seda seca e degummed em quatro mililters de 9,3 brometo de lítio aquoso molar. Mexa a solução a 60 graus Celsius por duas horas. Em seguida, coloque a solução de fibroin de seda em um saco de diálise dalton 3.500.Dilínio a solução contra um litro de água deionizada por três dias, trocando a água três vezes por dia. Uma vez que a diálise esteja completa, armazene a solução de fibroine de seda a quatro graus Celsius. Em seguida, use os métodos descritos anteriormente para limpar um prisma de flúor de cálcio e cobri-lo com um fino filme de poliestireno de uma solução de poliestireno de 3,5% por peso.Coloque o prisma revestido de poliestireno em contato com a solução de fibroina de seda e examine a interface de fibroin de seda de poliestireno com espectroscopia SFG. Para começar a preparar o duplex oligonucleotídeo, dissolva 10 nanomoles do oligonucleotídeo de uma única cadeia em 0,5 mililitros de água ultrapura. Faça o mesmo pelo oligonucleotídeo de cortesia.Combine as soluções para obter uma solução de oligonucleotídeo de 10 nanomoles por mililitro duplex. Em seguida, combine dois miligramas de DPPC, dois miligramas de DPPC desuterado, e um mililitro de clorofórmio para obter a solução lipídica. Em seguida, limpo e plasma tratam um prisma de flúor de cálcio como descrito anteriormente.Conecte este prisma ao porão amostra de um cocho Langmuir-Blodgett. Encha o cocho com água deionizada e baixe uma face do prisma no cocho a um milímetro por minuto. Injete vários microliters da solução lipídica na superfície da água e espere que a pressão da superfície se estabilize a cerca de 12 mililitros por metro.Em seguida, comece a comprimir a monocameira lipídica a cinco milímetros por minuto. Quando a pressão da superfície atingir 34 mililitros por metro, levante o prisma do cocho a um milímetro por minuto. Em seguida, prepare 500 microliters de uma mistura da solução de oligonucleotídeo duplex e da solução lipídica em uma relação molar de um a 100.Em seguida, substitua o cocho Langmuir-Blodgett por um recipiente de politefluoretileno cilíndrico cheio de água deionizada. Injete a mistura lipídica de oligonucleotídeo na água até que a pressão da superfície atinja 34 mililitros por metro. Coloque a face revestida de monótona lipídica do prisma em contato com a mistura de oligonucleotídeo lipídida para formar a amostra final.Avalie os sinais vibracionais de água quiral e aquiral com espectroscopia FSG. Neste primeiro exemplo, a interface entre os hidrogéis PHEMA e o prisma do flúor de cálcio mostrou picos claros e acentuados no espectro SFG. Isso foi atribuído à interface suave entre o flúor de cálcio e o hidrogel.A interface entre o hidrogel e a água circundante tinha características mais amplas e menos intensas porque as moléculas de água podiam se difundir na maior parte do hidrogel. Aqui, quando a concentração de fibroina de seda estava acima da concentração crítica sobreposta, havia estruturas secundárias quirais detectadas na interface de poliestireno da solução, a menos que o metanol fosse adicionado como um agente indutor. Abaixo da concentração crítica sobreposta, os sinais de SFG quiral foram detectados mesmo sem adicionar metanol indicando que estruturas secundárias ordenadas formavam-se desassistecidos na interface de poliestireno da solução.No oligonucleotídeo duplex ancorado amostra de bicamada lipídica variando a concentração de íons de cálcio não teve efeito significativo no sinal de água quiral que corresponde principalmente à hidratação posterior da coluna quiral no sulco menor. Em contraste, a concentração de cálcio efetuou fortemente os sinais de água aquirais que correspondem principalmente à camada de água ao redor da cadeia duplex e da bicamada. Sobre tudo isso sugeriu que a coluna quiral da camada de água poderia proteger o oligonucleotídeo de íons de cálcio.Calcular o coeficiente fresnel e escolher uma espessura de filme apropriada pode resolver problemas de interferência. Se multi-reflexão e refração forem consideradas a distribuição de campo elétrico correta nas interfaces podem ser ajustadas. Existem métodos alternativos que podem ser usados para preparar filmes finos com espessuras desejadas, como o revestimento de passos e a deposição de vapor químico.A detecção das estruturas superficiais e interfaciais relacionadas à adesão, redução, atrito e outras propriedades pode ajudar os pesquisadores a entender os mecanismos subjacentes e desenvolver novos materiais funcionais. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas onde interfaces variadas precisam ser investigadas. No entanto, o meio que você deseja que os feixes de luz se propagam deve ser transparente.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a estrutura e a dinâmica da água interfacial na escala atômica, em termos de imagem de resolução submolecular, manipulação molecular e espectroscopia vibracional de ligação simples.

Sondagem da Estrutura e Dinâmica da Água Interfacial com Microscopia de Tunelamento de Varredura e Espectroscopia

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

A fixação covalente de moléculas de sondas às pontas de cantilever da microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica essencial para a investigação de suas propriedades físicas. Isso nos permite determinar a força de alongamento, a força de dessorção e o comprimento dos polímeros através da espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM com alta reprodutibilidade.

Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de força atômica e da espectroscopia no infravermelho em nanoescala para avaliar o desempenho da espectroscopia no infravermelho fototérmico em nanoescala na caracterização de amostras tridimensionais multipoliméricas.

Avanços em Espectroscopia de Infravermelho em Nanoescala para Explorar Sistemas Poliméricos Multifásicos

Uma estrutura de imagem hiperespectral rápida e multimodal foi desenvolvida para obter imagens de geração de soma e frequência vibracional de banda larga (VSFG), juntamente com modalidades de imagem de segunda geração harmônica (SHG) de campo claro. Devido à frequência do infravermelho ser ressonante com vibrações moleculares, o conhecimento microscópico estrutural e morfológico mesoscópico é revelado de amostras permitidas por simetria.

Imagem Química Hiperespectral Não Linear Multimodal Usando Microscopia de Geração de Soma e Frequência Vibracional de Varredura de Linha

Aqui, apresentamos o protocolo para estudar a flexibilidade local e a dinâmica de biomoléculas usando anisotropia de fluorescência resolvida no tempo no nível de molécula única no modo de microscopia confocal.

Anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de moléculas únicas para caracterizar a flexibilidade local em biomoléculas

Este protocolo fornece instruções detalhadas e exemplos para preparação de amostras, aquisição de dados e análise de dados para caracterizar polímeros sintéticos com dispersão variável e grupos finais usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Método MALDI-ToF MS para a Caracterização de Polímeros Sintéticos com Dispersão Variável e Grupos Finais

Aprenda a usar espectroscopia vibracional SFG para analisar interfaces de polímeros e biomacromoléculas com seletividade interfacial. Esta técnica óptica não invasiva revela estruturas moleculares em diferentes tipos de interfaces.

Estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma (Vídeo) | JoVE Journal

Estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma

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