Name: Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Aprenda a criar um modelo in vitro da barreira hematoencefálica tumoral usando células murinas e humanas para testar a entrega de fármacos ao sistema nervoso central. Este método permite quantificar e visualizar a passagem de compostos terapêuticos antes de testes pré-clínicos.

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Esta pesquisa foi apoiada por concessões das organizações finlandês de câncer, Jane & Aatos Erkko Foundation e Sigrid Juselius Foundation (a paixao e V.L.J.), o Swiss National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility conceder n: P300PB_164732, a S. K.), a Fundação de pesquisa de Orion (a S.K.), a Maud Kuistila Memorial Foundation (de S.K.) e a Academia da Finlândia (VILJAA 2017, conceder n: 314 498). A unidade de imagem Biomedicum (Helsínquia) é reconhecida por fornecer a microscopia facilidade do núcleo de imagem.

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Os autores não têm nada para divulgar.

O surgimento do conceito de variabilidade de tumor interpatient rejuvenescido a pesquisa sobre o câncer personalizado medicina21. Esta variabilidade é também uma marca registrada de Neoplasias do sistema nervoso central. Devido à imprevisibilidade do tumor, resposta à quimioterapia adiciona o efeito de abrigo do BBB para a entrega da droga e completamente constitui maiores desafios na assistência ao paciente22. A fim de desenvolver terapias mais eficazes, muitas vezes é necessário grandes bibliotecas de tela de novas moléculas. Para avaliar a eficácia antitumoral e a capacidade dos novos contatos terapêuticos para chegar ao local do tumor, a melhor opção é o estudo pré-clínicos em células derivadas de paciente implantado no vivo em avatares pacientes murino. Devido a prática (recursos financeiros, de tempo, humanos e instalações) e razões éticas (o princípio do 3R ao usar animais de laboratório), o desenvolvimento de uma plataforma de triagem em vivo em grande escala tais muitas vezes não é possível e, portanto, os ensaios cell-based continuam a ser um modelo de escolha23. A razão principal para a seleção de estabeleceu linhas celulares e evitar as células primárias é facilitar a reprodutibilidade e reduzir o uso de animais de laboratório, que são a principal fonte para o isolamento e o estabelecimento de culturas primárias de murino. Os métodos de apresentar aqui, cumprindo firmemente com a 3R, poderiam descartar eficientemente nanopartículas de uma ainda mais investigação pré-clínica sobre o critério de sua incapacidade de atravessar o modelo BBTB. Como um prova de princípio, descreveremos aqui as conclusões obtidas durante o desenvolvimento e validação do BBTB. Fomos capazes de confirmar os resultados in vitro in vivo, por exemplo, ao avaliar a difusão passiva de um 376 Da sódio-fluoresceína.
O protocolo descrito neste documento descreve a preparação de células endoteliais, cocultured com astrócitos para formar uma sangue-cérebro tumor barreira-interface em uma configuração in vitro. Uma vez estabelecido um contato físico entre esses tipos de duas células, a camada de células endoteliais apresenta semelhanças com o BBB (por exemplo, uma célula superfície expressão de proteínas de junção apertada e relativamente baixa permeabilidade). Curiosamente, a mímica BBTB murino parecia fornecer valores de permeabilidade at-Fl particularmente semelhantes aos obtidos com o mouse em vivo BBB permeabilidade medições24. Portanto, o desempenho de imita o BBTB será vinculado diretamente à escolha das células usados para formar a barreira. As células endoteliais bEND3 se originam do cérebro e são sabidas para ser bem sucedido na formação barreiras quando cocultured com astrócitos25. No entanto, temos vindo a utilizar o imortalizado de astrócitos HIFko26 para gerar a mímica BBTB. Devido à sua falta de hypoxia-inducible factor, não produzem estes astrócitos VEGF-A, que é por excelência na estabilização a mímica BBTB descrita aqui. Astrócitos foram identificados como moduladores da permeabilidade do BBB, por exemplo através da liberação de VEGF-A, em resposta ao neuroinflammation27. Ativação dos receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFRs) é um regulador chave da permeabilidade vascular endotelial/tanto em vitro28 e29de in vivo. Portanto, suplementos de VEGF-A no meio de ativam o VEGFR2 sobre as células endoteliais, que induz a fosforilação de proteínas de junção aderente como VE caderina30. A perda de contatos de célula-célula endotelial gera altamente permeáveis dos vasos sanguíneos. Da mesma forma, tanto a propriedade mitogênico forte e composição desconhecida do fetal bovino sera usado em ensaios de cultura a célula causam grandes questões na reprodutibilidade de estabilização e ensaio de barreira.
Células endoteliais da veia umbilical humana (HX) são por vezes utilizadas para formar o BBB em vitro31; no entanto, significativamente diferem as células endoteliais microvascular do cérebro, tais como a célula D3/hCMEC linha32, em termos de expressão gênica e formadoras de barreira Propriedades. No entanto, a permeabilidade relativamente mais elevada valores obtidos com as células de HuAR2T crescidas sozinhos em comparação com o bEND3 foram reduzido por coculturing-los com astrócitos primários humanos. Embora as células endoteliais são necessários para formar a parede celular, é claro que os astrócitos têm um papel igualmente importante para a formação de BBTB e estabilização.
Quando esferas de paciente-derivado glioma foram adicionadas a esta equação, a mímica BBTB de rato recapitulada algumas das características de xenografts murino, tais como a difusão de drogas através da vasculatura cerebral e o direcionamento de célula de tumor. A imita BBTB discutida aqui conseguiram, por exemplo, espelhando o comportamento in vivo quando nós selecionados vários nanopartículas com diâmetros diferentes. Para ilustrar o paralelismo entre os modelos in vitro e in vivo, usamos o silicato de mesoporos descrito anteriormente nanopartículas33 com célula-penetrante propriedades34 conjugada com o peptídeo tumor-direcionamento CooP na sua surface20. As CooP-direcionamento casas de peptídeos às células do tumor invasivo através da ligação específica ao inibidor crescimento mamário-derivado (MDGI). Vários tipos de câncer, incluindo gliomas, são superexpressão MDGI em comparação com o tecido normal,35, que torna o CooP um moiety tumor-direcionamento muito eficiente capaz de aumentar a entrega de uma carga de20. As nanopartículas usadas aqui foram mostradas anteriormente para se espalham o parênquima cerebral (27547955), e quando acrescida com Taxol, estes nano-cargas foram bem sucedidos em reduzir o crescimento de glioma em modelos pré-clínicos36. A adição de resíduos de polietileno glicol (PEG) na superfície das nanopartículas também manteve sua carga estática para valores positivos (em torno de + 4 mV), permitindo melhor interação com o neurovascular unidade37 e também aumentar sua estabilidade em circulação. Nos dados apresentados, 3 kDa de PEG foi conjugado com NP110s, enquanto NP350s foram revestidas com kDa 10 de PEG. No entanto, aumentado-peso molecular PEG também resultou em um aumento significativo do diâmetro de nanopartículas, portanto, suas capacidades físicas para cruzar o BBB. Portanto, verificamos se as dimensões físicas das partículas impediram sua passagem através do BBTB e se estas observações podem ser espelhadas em vivo.
Em conformidade com as observações anteriormente publicadas, observamos que NP110s extravasado através a BBTB in vitro e o BBB de ratos rolamento tumores intracranianas, enquanto NP350s retidos no lado luminal de imitar o BBTB e nos vasos sanguíneos dos ratos. Estes resultados semelhantes sugerem fortemente que o modelo BBTB previu a capacidade in vivo de nanopartículas para atravessar o BBB e chegar ao cérebro.
A relevância dos modelos de celulares do BBB é frequentemente discutida, até mesmo para a central entrega de nanopartículas38. Mostramos aqui que primário astrócitos e células endoteliais, ambos considerados como as mais relevantes ferramentas in vitro, podem ser substituídas por células imortalizadas e/ou comercialmente disponíveis, garantindo a reprodutibilidade e maior escalabilidade. A próxima geração da in-vitro BBB imita poderia ser desenvolvida, incorporando os dispositivos microfluídicos, permitindo neurovascular maravilhosamente formado unidades estruturalmente semelhantes a real BBB12,14. No entanto, tais modelos são atualmente inadequados para o rastreio da elevado-produção de moléculas entregado aos gliomas, devido a limitações técnicas no seguimento do entrega14. É realmente difícil capturar a complexidade fisiológica do BBB em um prato, e a eventual falta de algumas proteínas/receptores, conhecido por ser expressa pelo BBB, poderia comprometer a interpretação dos resultados. Outro argumento refere-se a grande variabilidade na expressão gênica entre condições in vivo e in vitro, bem como da linha de uma célula para outra, especialmente considerando as células endoteliais. No entanto, pode também ser alegado que a unidade neurovascular não é uma entidade uniforme dentro do cérebro de39. Investigação científica em biologia atingiu uma humana era onde o bem-estar animal, responsabilidade ética e o custo de utilização de vidas animais são sempre considerados antes de projetar um experimento. Portanto, para oferecer suporte a substituição de animais, um número crescente de estudos recentes mostra que a consciência das limitações dos modelos e a seleção cuidadosa dos modelos de celular para estabelecer a barreira — com destaque para os astrócitos — garante um correspondência entre os resultados obtidos em um prato e em animal modelos40. Com a metodologia descrita aqui, temos um passo para reduzir o número de animais utilizados para fins de transcytosis BBB para terapêutica potencial de rastreio.

A unidade neurovascular é composta de neurônios, astrócitos e o BBB, formado pela intrincada conexões entre pericitos, astrócitos, células endoteliais e a membrana basal associada, formando o cérebro microvasculatura1. Esta apertado parede celular formada pelos navios contínuos, nonfenestrated finamente regula o movimento de íons e moléculas (incluindo hormônios, nutrientes ou medicamentos), mas também de células1em circulação. O transcytosis notavelmente baixa através do BBB de moléculas de alto peso molecular, tais como anticorpos terapêuticos, conjugados de drogas ou nanocompounds, restringe dramaticamente os avanços na descoberta de drogas para doenças neurológicas, incluindo maligno gliomas2. Na verdade, oralmente ou por via intravenosa entregues quimioterapias alcançar o parênquima cerebral frequentemente em inadequadamente baixas concentrações para induzir um efeito antitumoral ou são simplesmente incapazes de atravessar o BBTB para alcançar as células neoplásicas3. Vários estudos pré-clínicos e clínicos não tem lidado com a questão de penetração de BBTB mas tentaram perturbar o BBTB transitoriamente, por exemplo, usando o ultra-som focalizado4,5, ou para contorná-la pelo direto em situ entrega de drogas6. No entanto, nenhuma destas técnicas foram capazes de neutralizar a expansão do tumor inevitável ou ter uma recaída. Portanto, ao desenvolvimento de novas terapias antiglioma, a difusão através da BBTB deve ser considerada como um dos aspectos críticos para o sucesso na entrega dos agentes terapêuticos7.
Devido à complexidade das interacções célula dentro do BBTB, estudos in vivo em animais de laboratório parecem ser a escolha óbvia quando estudando a passagem das moléculas do sangue para o cérebro. No entanto, alta escala métodos in vivo são relativamente complexos para estabelecer e, portanto, não permitem o rastreio da elevado-produção de moléculas em um tempo razoável a um custo razoável. Ainda mais importante, experimentação animal tem de seguir a orientação ética 3R definida como i) refinam, ii) reduzir e, de relevância para o contexto atual, iii) substituir pelos protocolos alternativos (por exemplo, nos métodos de vitro/in silico). Portanto, recriando a BBTB in vitro aparece como uma possibilidade interessante e atraente, mas também constitui uma tarefa complexa, desafiada por várias limitações. Muitas tentativas de recriar este complexo compartimento com culturas primárias de células ou linhas de células de caninos, suínos, origem murino e até mesmo humana foram publicados (como comentado por reis et al.8 e Helms et al.9). Estes modelos incluem microfluidic tridimensional sistemas10, BBB-em-um-microplaqueta11,12, e multidões de variantes baseadas sobre as culturas co clássicas em insere sistemas. No entanto, sistemas microfluídicos e chip atuais são ou não adequados para estudos de validação droga rápida, alta produtividade13,14 ou são atualmente incompatível com estudos de entrega da droga para tumores cerebrais. Além disso, a revisão de 155 modelos publicados usando células primárias, células-tronco pluripotentes inducible (iPSC) ou linhas de células comerciais todas as inserções co cultivadas na mostraram uma tendência para interstudy discrepância em suas medições e/ou conclusões8. Esta falta de reprodutibilidade interlaboratorial poderia ser correlacionada com as condições de cultura i) não normalizada, por exemplo com o revestimento opcional com proteínas da matriz da membrana basal no vaso cultura celular, ii) um aumento do número de subcultura e uso de soro contendo mídia, os dois principais pilotos de modificações genéticas e fenotípicas da célula linhas15, ou iii) a dificuldade reproducibly recriar o equilíbrio certo entre o Ralevic e endoteliais componentes em um prato. Embora o uso de células imortalizadas ou célula comercial linhas para estabelecer um modelo in vitro de BBB carece de algumas das propriedades em relação aos modelos similares que usam apenas as células primárias, no método descrito, mostramos que a combinação certa de células exposições um muito desempenho comparável à publicação de estudos em outros modelos de referência16,17. Eventualmente, a falta de um modelo robusto e reprodutível para estudar a passagem de compostos terapêuticos alvejando tumores cerebrais através da BBTB motivou-na desenvolver os métodos descritos aqui.
Desde que o objetivo era usar o modelo para prever a entrega em vivo de nanopartículas em modelos animais pré-clínicos, nós primeiro validado o modelo BBTB, utilizando pastilhas contendo células endoteliais murino em contacto com astrócitos murino. Além disso, nós também aperfeiçoamos o modelo para usar certas linhas de células humanas. Uma vez estabilizado, as barreiras de célula são transferidas para culturas com esferas de glioblastoma paciente-derivado ou linhas de células de glioma comercial. Posteriormente, o transcytosis de nanopartículas e direcionamento de células do tumor podem ser visualizados por microscopia confocal e quantificada através da recolha de amostras ao longo do tempo. Importante, resultados obtidos usando a BBTB imita podem confiantemente prever o comportamento das nanopartículas em vivo, suportando o uso do prior BBTB imitar a validação pré-clínica.

<table><tbody><tr><td><forte>Células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>Cultivado em: DMEM (1g/L de glicose) suplementado com 10% de FBS, 5 mL de L-glutamina e 5 mL de penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>HIFko imortalizado astrócitos de camundongo</td><td>isolados no laboratório do Dr. Gabriele Bergers</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>Cultivado em: BME-1 suplementado com 5% de FBS, 5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, 3 g de D-glicose e 5 mL de penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>HuAR2T</td><td>isolado no laboratório da Dra. Dagmar Wirth</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td><td>Cultivado em: EBM-2 com</td></tr><tr><td>astrócitos primários humanos normais</td><td>SupplementMix Lonza</td><td>CC-2565</td><td>Cultivado em: ABM com SingleQuots</td></tr><tr><td>Material e reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prato de 100 mm x 17 mm, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno de 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM Basal Medium, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Para astrócitos humanos primários. ABM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. ABM-: todos os aditivos à exceção do rhEGF e da solução do</td></tr><tr><td>desprendimento da pilha de FBS Accutase Corning</td><td></td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots suplementos e suplementos</td> de <td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 dos</td> fatores de crescimento <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>para GBM + e - águia</td></tr><tr><td>média basal média</td><td>ThermoFisher científica</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>Corning Costar Placas de 6 poços tratadas com TC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell inserções de cultura de células de membrana de poliéster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>dissolver em 50 mL de BME-1 e filtro estéril antes de adicionar ao meio</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>Específico para a cultura das esferas derivadas de pacientes isoladas em nosso laboratório, pode variar para outras linhas celulares de glioma</td></tr><tr><td>EBM-2 crescimento Meio SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. EBM-: todos os aditivos, exceto VEGF-A e FBS</td></tr><tr><td>Endotelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+: contém todos os aditivos da mistura de suplementos. EBM-: todos os aditivos, exceto VEGF-A e FBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE, origem da América do Sul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>sal de sódio fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 placas de poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>poços de poliestireno preto fundo plano (com fundo micro-transparente)</td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,9 cm de lamelas redondas de borosilicato</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>um comprimido por litro de dH2O, depois esterilize a solução autoclavando</td></tr><tr><td>o bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGF Humano Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td><td>para GBM+ Médio</td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-básico (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>para GBM+ médio</td></tr><tr><td><forte>Imunofluorescência</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura de lâmina de microscópio de 24 mm x 60 mm</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 e 594 anticorpos secundários</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Claudin-5</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>diluição: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-GFAP anticorpo clone GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>diluição: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31&nbsp; anticorpo Clone MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>diluição 1/800</td></tr><tr><td>Anti-SV40 Anti-SV40 Anticorpo de antígeno</td><td>T Abcam</td><td>ab16879</td><td>diluição: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>diluição: 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquoso Montagem Média&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td><forte>Procedimentos em animais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação curva de 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G agulhas</td><td>Pinça Fina Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>(12,5 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>para dissociação de tecidos</td></tr><tr><td>Intramedic Tubo de polietileno PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Mains Powered microdrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,5 cm redondo borosilicato Lamínulas</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bulldog clamp</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica</td><td>Mustela</td><td>Frascos estéreis de dose única 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Classe</td><td></td>de dispositivos médicos</tr><tr><td>Pinça Rochester-Oschner</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td>Adaptador Estereotáxico de <td>Xilazina</td> <td>Intervet</td><td>Vnr148999</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi Sponge Points</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.Microscópio de zoom estéreo de fluorescência V16&nbsp;</td>Leitor de microplacas <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 câmera digital sCMOS</td> Centrífuga de mesa <td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320</td><td>Gato Hettich</td><td>. Nº 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 com microscópio confocal Airyscan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prever em cargas entrega vivo usando uma tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Altamente seletivo por natureza, a barreira hemato - encefálica (BBB) é essencial para a homeostase do cérebro em condições fisiológicas. No entanto, no contexto de tumores cerebrais, a seletividade molecular do BBB também protege as células neoplásicas, bloqueando a entrega de agentes quimioterápicos administrados perifericamente. O desenvolvimento de novos medicamentos (incluindo nanopartículas) alvejando tumores cerebrais malignos idealmente requer o uso de modelos animais pré-clínicos para estudar o efeito do remédio transcytosis e eficácia antitumoral. De conformidade com o princípio do 3R (refinar, reduzir e substituir) para reduzir o número de animais de laboratório na configuração experimental e realizar a seleção da elevado-produção de uma grande biblioteca de agentes antitumorais, desenvolvemos um humano in vitro podem ser reproduzido e mímico murino do tumor-barreira sangue-cérebro (BBTB) usando culturas de três camadas de células endoteliais, astrócitos e esferas de glioblastoma paciente-derivado. Para maior escalabilidade e reprodutibilidade, linhas comerciais de célula ou células imortalizadas têm sido utilizadas em condições sob medidas para permitir a formação de uma barreira que se assemelha o BBB real. Aqui descrevemos um protocolo para obter uma mímica BBTB por células endoteliais em contacto com astrócitos em densidades de célula específica em inserções de cultivo. Este mímico BBTB pode ser usado, por exemplo, para a quantificação e a imagem latente confocal da passagem de nanopartículas através das barreiras endoteliais e hamartomas, além da avaliação da célula de tumor como alvo dentro o mesmo ensaio. Além disso, mostramos que os dados obtidos podem ser usados para prever o comportamento de nanopartículas em modelos animais pré-clínicos. Em uma perspectiva mais ampla, este modelo in vitro pode ser adaptado para outras doenças neurodegenerativas, para a determinação da passagem de novas moléculas terapêuticas através do BBB e/ou ser suplementado com cérebro organoids diretamente, avaliar a eficácia de drogas.

Imagem latente confocal dos imitam murino de BBTB mostra a expressão e a localização celular da junção apertada proteínas zonula occludens-1 (ZO-1) e claudin-5 em bEND3. Os contactos entre as células endoteliais e astrócitos claramente induziram a deslocalização das ZO-1 e claudin-5 para os contatos de célula-célula endotelial em comparação com as monoculturas de bEND3 (Figura 1). Usando a mancha para visualizar os astrócitos GFAP-expressando ao cérebro-lado da membrana, é possível observar e estudar os processos hamartomas e ponta-pés entrando em contato com as células endoteliais através da membrana (Figura 1E ). Os contatos astrocyte-endothelial da pilha são conhecidos por promover e estabilizar o aperto da barreira celular e estão associados com valores mais baixos de permeabilidade dos BBB19. Em conformidade com isso, observamos uma diminuição substancial na permeabilidade de mímica BBTB o rato para o at-Fl de 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s em caso de monoculturas para 6,74 (± 3,01) x 10-6 cm/s quando co cultivadas com o hypoxia-inducible fator nocaute astrócitos (HIFko) (tabela 1). O HuAR2T imortalizado formam barreiras celulares altamente permeáveis (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabela 1). Semelhante ao modelo murino, medimos significativamente mais baixa permeabilidade do BBTB para at-Fl, nomeadamente 47,4 (± 14,32) x 10-6 cm/s, quando as células de HuAR2T foram co cultivadas com os humanos astrócitos primários (tabela 1).
Em murino e humana imita BBTB, a presença das esferas paciente-derivado glioblastoma induzido um ligeiro aumento nos valores de permeabilidade em comparação com as culturas de co astrocyte-célula endotelial sozinho (tabela 1). Este fenómeno é observado com vários, mas nem todos o paciente glioma sphere modelos. Isto pode ser devido o VEGF-A que é secretada por algumas dessas células do paciente-derivado.
Para comparar os valores de permeabilidade do imita BBTB in vitro com o BBB em vivo, nós fotografada a difusão em tempo real do at-Fl através de uma janela craniana implantado em camundongos. Usando um microscópio de fluorescência, a difusão de at-Fl de vasos sanguíneos capilares derivar os principais vasos sanguíneos pial foi gravado antes, durante e após a injeção sistêmica da sonda (Figura 2). Medições dos valores de fluorescência diferencial da circulação do sangue e cérebro do parênquima cortical ao longo do tempo nos permitiram calcular os valores aproximados da permeabilidade do mouse nude's BBB para at-Fl (5,57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tabela 1).
Para ilustrar como este mímico BBTB pode ser usado para visualização da passagem de compostos a partir para o lado do sangue para o lado do cérebro, comparou-se o transcytosis de ø 110 nm (NP110) e ø 350 nm (NP350) nanopartículas direcionamento paciente-derivado glioblastoma esferas. Os resultados obtidos in vitro foram então comparados com o transcytosis in vivo. No exemplo apresentado, nanopartículas foram revestidos na superfície com o peptídeo tumor-direcionamento CooP20 em carregado com o corante fluorescente (FITC) para facilitar a visualização. Nós rotulado as células usando a tintura dos lisossomos e counterstained com DAPI 24 h após a adição das nanopartículas FITC do lado do sangue de BBTB a imitar e adquiriu confocal micrografias em diferentes níveis (por exemplo, o lado do sangue, a membrana, o lado do cérebro, e as esferas de glioblastoma paciente) (Figura 3A). O sinal fluorescente associadas NP110 colocalized com os lisossomos nas células endoteliais, astrócitos e células tumorais. Além disso, NP110s foram detectados no meio das células endoteliais e astrócitos, passando através dos poros da membrana da inserção (Figura 3A).
A passagem do NP110s foi quantificada medindo-se a fluorescência das amostras coletadas de lado o sangue e o cérebro. Esses valores de permeabilidade foram comparados àqueles determinados para as nanopartículas de ø 350 nm (NP350). Os resultados mostram que apenas NP110 era capaz de atravessar a imita BBTB (Figura 3B). NP350 permaneceu do lado do sangue da mímica BBTB, o que resultou em valores mais baixos de permeabilidade para essas nanopartículas.
Para destacar a relevância da BBTB imita em comparação com os modelos in vivo, camundongos por via intravenosa foram injetados com nanopartículas de NP110 ou NP350 revestido com o peptídeo tumor-direcionamento CooP e conjugados com corante vermelho fluorescente (TRITC) para a deteção. Tecidos colhidos em vários pontos de tempo revelaram que após 8 h, BBB-permeável nanopartículas tem extravasado para o parênquima cerebral, enquanto o nonpermeable aqueles que ficaram na circulação principalmente foram retirados com a circulação sistêmica em vivo. Portanto, recolhidos os cérebros e quantificado o número de nanopartículas por milímetro quadrado postinjection de 8 h. Em conformidade com os resultados in vitro, NP110, mas não NP350, com sucesso extravasado para o parênquima cerebral (Figura 3). Imagens de alta ampliação da localização de nanopartículas no cérebro mostraram que NP110 era homogeneamente distribuídas no parênquima cerebral fora os capilares sanguíneos e adaptadores de rede com êxito para as células de glioblastoma implantado (Figura 3D). Apesar de exibindo o tumor mesmo direcionamento moiety (CooP), NP350 era incapaz de extravasate para o parênquima cerebral e só foi detectado dentro do lado luminal do cérebro dos vasos sanguíneos (Figura 3E), semelhantes aos resultados obtidos in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figura 1: Descrição do modelo de tumor-(BBTB) a barreira sangue-cérebro. (A) representação esquemática das posições dos diferentes tipos de células. (B) ilustração da inserção colocação sobre a tampa da placa de 6-poços e a técnica de semeadura para os astrócitos do lado do cérebro da inserção da'membrana s. (C) ilustração do estágio 6 placa permitindo a adesão astrocyte. (D) micrografias de imunofluorescência da junção apertada proteínas zonula occludens-1 (linha ZO-1, superior, vermelho) e claudin-5 (linha inferior, verde). A expressão da proteína é comparada com as cérebro murino microvascular células endoteliais (bEND3) cultivadas no lado de sangue do BBTB sozinho, como uma monocultura (coluna esquerda) ou com murino imortalizado HIFko astrócitos (coluna direita). Núcleo de células é counterstained com DAPI (azul). (E) Micrografia de imunofluorescência mostrando a proteína ácida fibrilar glial (GFAP, vermelho) em astrócitos HIFko cultivados ao lado de BBTB o cérebro. A imagem de alta ampliação mostra processos astrocyte e ponta-pés (setas) entrar em contato com as células endoteliais através da membrana poros (painel direito). A identidade de astrócitos o HIFko foi verificada pela mancha da imunofluorescência do simian virus 40 grande T antígeno (SV40 grande T, verde) utilizado para o immortalization das células. Células endoteliais expressam a GFAP nem o T grande SV40 e, portanto, podem ser parcialmente observadas através do transparente, em frente ao lado da membrana como DAPI somente células coradas (linhas tracejadas). Núcleo de células é counterstained com DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figura 2: Intravital determinação ao vivo do mouse permeabilidade BBB. (A) preparação do cateter implantável veia caudal. (1) ferramentas e equipamentos são os seguintes: (a) um PE20 tubo de polietileno (b) dois 25 G agulhas (c), Rochester-Ochsner fórceps e (d) um pequeno buldogue braçadeira. (2) A 25 G de agulha é removida por diversas torções usando a pinça e (3) cuidadosamente inserido no tubo. (4), do outro lado do tubo é conectado a outra agulha 25g. (B) orientação para a implantação do cateter e posicionamento para administrar a solução de sódio-fluoresceína na veia da cauda de um rato. A área de um círculo indica a área onde uma gota de cola de cianoacrilato é colocada para fixar o cateter. A pinça bulldog é usada para manipular o cateter e removida quando o cateter está segura. (C) representante imaging e quantificação método para determinar os valores de permeabilidade do sódio-fluoresceína. Antes da infusão de sódio-fluoresceína (coluna esquerda), mede-se a autofluorescência/em branco dentro de uma região de interesse (ROI) colocada sobre o cérebro (retângulo de painel superior, branco) e áreas de vaso sanguíneo (retângulo de fundo do painel, vermelho). Durante a infusão de sódio-fluoresceína (coluna direita), a intensidade da fluorescência é medida em ambos os ROIs, permitindo o cálculo da permeabilidade do BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figura 3: previsão do transcytosis intracerebral de nanopartículas através de BBB in vivo usando o modelo in vitro de BBTB. (A) representação gráfica do ensaio BBTB com imagens confocal representante obtidos nos diferentes níveis do modelo murino BBTB indicados. Nanopartículas de 110 nm de diâmetro (NP110) e conjugado com FITC (verde) foram adicionados ao sangue foram rotulados de lado das células BBTB com a sonda dos lisossomos (LT-99, vermelho).  (1) Endothelial cells, (2) Endothelial transcytosis das nanopartículas através dos poros da membrana (linha branca tracejada), astrócitos (3), e (4) paciente glioblastoma esferas são identificadas no gráfico e correspondentes micrografias confocal (à direita). Encapsulamento dos lisossomos das nanopartículas (setas) sugere transcytosis ativo através das camadas endoteliais e astrocyte do BBTB. (B) quantificação da permeabilidade de nanopartículas indicado através do BBTB in vitro (n = 6). (C) quantificação da densidade nanopartículas indicado no tecido cerebral das seções, 8 h após a infusão de veia caudal dos camundongos nus (n = 3). (D) Confocal micrografias mostrando a distribuição da ø 110 nm nanopartículas (NP110, vermelho) em cortes de tecido de cérebro murino rotulado com um anticorpo de CD31 anti-rato (verde). A seta realça o transcytosis de nanopartículas (painel esquerdo). Nanopartículas acumularam ao redor das células de tumor de cérebro (tumor, painel direito) devido a CooP-direcionamento peptídeo apresentado em sua superfície. Nenhuma orientação significativa é observada no tecido do cérebro (cérebro). (E) Confocal micrografias mostram a distribuição da ø 350 nm nanopartículas (NP350, vermelho) em cortes de tecido de cérebro murino rotulados com um anticorpo de CD31 anti-rato (verde). Setas apontam para os NP350s que foram retidos no lúmen dos vasos sanguíneos e não foram capazes de atravessar o BBB, provavelmente devido a seu diâmetro maior, em comparação com o núcleo de células NP110s. são counterstained com DAPI (azul). P &lt; 0,01. P-valores foram calculados usando um teste bicaudal, não paramétrico de Mann-Whitney U. As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murino mímico BBTB</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko como</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko como + GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilidade (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6,74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2,65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>mímica BBTB humana</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Permeabilidade (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14,32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: valores de permeabilidade de sódio-fluoresceína (at-Fl) (em centímetros por segundo) determinado em vitro nos sistemas de cultura co indicado e in vivo em camundongos NMRI. Dados de uma experiência representativa (n = 3 ratos).

Direcionamento de drogas para tumores do sistema nervoso central é um grande desafio. Aqui descrevemos um protocolo para produzir um mímico in-vitro do tumor-barreira sangue-cérebro usando células murino e/ou humanas e discutir sua relevância para a previsibilidade do sistema nervoso central tumor direcionamento em vivo.

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Para desenvolver novas drogas e compostos que visam tumores no sistema nervoso central, a acessibilidade e a passagem através da barreira hematoencefálica é altamente importante. Embora a citotoxicidade dos compostos possa ser facilmente medida incubando as células com as moléculas terapêuticas, ela realmente não diz nada sobre a entrega real ao local do tumor no cérebro. Para resolver essa questão, desenvolvemos o seguinte protocolo que descreve como recriar a barreira tumoral hematoencefálica in vitro em um prato.O uso de células imortalizadas de origem murina ou humana torna este ensaio muito flexível. Ele também pode ser facilmente dimensionado para tela dezenas de compostos com alta reprodutibilidade. Além disso, este método permite tanto quantificação quanto visualização da passagem e capacidade de segmentação dos compostos antes de prosseguir com modelos pré-clínicos.Portanto, nosso método substitui parcialmente os modelos animais usando as linhas celulares pré-estabelecidas. A inclusão de células tumorais cerebrais derivadas do paciente ensaios sobre a heterogeneidade do paciente, enquanto o uso de células imortalizadas para estabelecer a barreira hematoencefálica garante a reprodutibilidade dos resultados. Ao todo, este modelo de barreira hemencefálica oferece uma ferramenta realmente interessante para avaliar a difusão da droga ou a entrega de veículos medicamentosos.A demonstração visual do método é fundamental porque a semeadura das células do lado oposto da inserção requer manipulação que não é frequentemente descrita em outros protocolos usando configuração semelhante. Por exemplo, obter a adesão de astrócitos quando a inserção é colocada de cabeça para baixo altamente se beneficia da representação visual. Sob uma capa de cultura celular estéril, lave cuidadosamente os astrócitos cultivados com cinco mililitros de PBS estéreis.Use uma bomba de vácuo para descartar suavemente o PBS e adicione dois mililitros de reagente de dissociação celular por cinco minutos para desprender as células. Em seguida, adicione 10 mililitros de cultura celular astrócito completa estéril ao vaso para inibir a atividade do reagente de dissociação celular. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir as células separadas do vaso para um tubo estéril de 15 mililitros.Centrifugar a 250 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, coloque as pastilhas. Use fórceps estéreis para colocar as pastilhas com o lado cerebral na tampa de uma placa estéril de seis poços.Quando a centrifugação estiver completa, descarte cuidadosamente o supernatante da suspensão celular e resuspenque a pelota de astrócito em um mililitro de ABM-plus, esbobinando suavemente a pelota na parede do tubo até cinco vezes. Em seguida, conte as células e ajuste a densidade de suspensão celular para 150.000 células em 400 microliters de ABM-plus por inserção. Coloque a suspensão celular no meio do lado cerebral da membrana da inserção, e espalhe-a cuidadosamente usando força capilar com uma ponta de pipeta estéril.Com o lado cerebral das pastilhas ainda para cima, coloque a placa de seis poços de volta nas pastilhas. Coloque a placa e as pastilhas, com o lado cerebral para cima, em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a adesão celular. Depois disso, reverta a placa de seis poços de volta à sua posição regular, com as pastilhas agora lado sanguíneo para cima.Adicione o meio e continue a incubação conforme descrito no protocolo de texto. Sob uma capa de cultura celular estéril, lave cuidadosamente as células endoteliais cultivadas com cinco mililitros de PBS estéreis. Use uma bomba de vácuo para descartar suavemente o PBS e adicione dois mililitros de reagente de dissociação celular por cinco minutos para desprender as células.Em seguida, adicione 10 mililitros de cultura celular endotelial completa estéril ao vaso para inibir a atividade do reagente de dissociação celular. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir as células separadas do vaso para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 250 vezes g por três minutos em temperatura ambiente.Depois disso, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota da célula endotelial em um mililitro de EBM-plus, tubondo lentamente a suspensão celular na parede do tubo até cinco vezes. Conte as células e ajuste a densidade de suspensão celular para 200.000 células em 2,5 mililitros de cultura celular endotelial desprovida de fator de crescimento endotelial sérico e vascular -A por inserção. Recupere a placa que contém as pastilhas.Descarte cuidadosamente o meio do lado do sangue e substitua-o pelos 2,5 mililitros de suspensão celular endotelial. Em seguida, devolva a placa à incubadora e deixe-a durante a noite para permitir que as células endoteliais aderam à membrana. No dia seguinte, prepare uma placa de seis poços transferindo três mililitros de ABM-menos pré-aquecidos para cada poço.Utilizando fórceps estéreis, manuseie as pastilhas para descartar cuidadosamente o meio endotelial completo do lado do sangue e coloque a inserção na nova placa contendo ABM-menos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de EBM-menos. Deixe as pastilhas na incubadora com mínima perturbação física ou variação de temperatura por cinco dias.No dia da transferência, substitua o meio. Para a imagem de imunofluorescência, coloque até quatro tampas de borossilicato estéril redondos em cada poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de poli-D-lisina. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.Enquanto isso, use uma pipeta sorológica estéril para transferir cuidadosamente as esferas tumorais do vaso de cultura celular para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar as esferas tumorais a 250 vezes g por três minutos. Descarte o supernatante e retire suavemente as esferas em um mililitro de GBM-menos.Conte as células e ajuste a densidade celular para aproximadamente 10.000 esferas ou 100.000 células por mililitro de GBM-menos. Em seguida, descarte a poli-d-lysina dos poços e enxágue os poços três vezes com PBS estéril. Semente cada poço da placa com três mililitros da suspensão esferoide tumoral, e transfira as pastilhas com o BBTB imitar para a suspensão da célula tumoral.Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir que os lados do sangue e tumor cerebral do ensaio cheguem ao equilíbrio. No dia seguinte, substitua a mídia no lado sanguíneo por EBM-menos suplementada com as moléculas, drogas ou nanopartículas de interesse. Colete as amostras ao longo do tempo para quantificação direta como descrito anteriormente.Primeiro, coletar 100 microliters do meio do sangue e dos lados cerebrais da mímica BBTB, e transferir cada um para uma placa separada de fundo plano, preto, 96 poços para medições subsequentes de fluorescência. Em seguida, prepare uma solução de 50 micromolar de fluoresceína de sódio em EBM-menos, certificando-se de preparar 2,5 mililitros por poço. Pré-aqueça esta solução a 37 graus Celsius, e substitua a mídia do lado sanguíneo das pastilhas por mídia contendo esta solução de fluoresceína de sódio.Inicie um temporizador assim que o meio for substituído. Colete cuidadosamente 100 microliters de mídia do sangue e do lado cerebral das pastilhas em cinco minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos. Transfira cada amostra para separar poços da placa preta apropriada de 96 poços.Use um leitor de placas para quantificar a fluorescência das amostras coletadas. Primeiro, diluir o corante fluorescente lysossom para a concentração de trabalho adequada em meio pré-aquecido. Adicione isso às células e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 45 minutos.Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS gelado. Descarte o PBS e adicione três mililitros de paraformaldeído 4% frio aos poços e 2,5 mililitros à pastilha. Incubar no gelo por 10 minutos.Depois disso, descarte o paraformaldeído e enxágue as células três vezes com PBS. Remova o PBS e contra-retiver os núcleos celulares usando uma solução DAPI em uma concentração final de um micrograma por mililitro em água destilada. Incubar em temperatura ambiente por sete minutos.Em seguida, remova o DAPI e lave as membranas três vezes com água destilada. Corte cuidadosamente a membrana, remova a água destilada e coloque-a em uma gota de meio de montagem em um slide de microscópio de vidro. Adicione outra gota de meio de montagem do outro lado da membrana, e cubra-a cuidadosamente com um copo de tampa borossilicato.Neste estudo, as células endoteliais foram co-cultivadas com astrócitos para formar uma interface de barreira tumoral hematoencefálica em uma configuração in vitro. A imagem confocal da mímica murine BBTB mostra a expressão e localização celular das proteínas de junção apertada zonula occludens-1 e claudin-5 em bEND3. Os contatos entre as células endoteliais e os astrócitos induzm claramente a realocação dessas duas proteínas para os contatos célula-célula endotelial em comparação com as monoculturas bEND3.Usando a coloração da imunofluorescência para visualizar os astrócitos que expressam GFAP no lado cerebral da membrana, é possível observar e estudar os processos astrócitos e os pés finais entrando em contato com as células endoteliais através da membrana. Para comparar os valores de permeabilidade do BBTB in vitro imita com a barreira in vitro hematoencefálica, a difusão em tempo real da fluoresceína de sódio é imagem através de uma janela craniana implantada em camundongos nus. Usando um microscópio estéreo de fluorescência, a difusão de fluoresceína de sódio dos capilares do vaso sanguíneo derivados dos principais vasos sanguíneos pial é registrada antes, durante e após a injeção sistêmica da sonda.A transcitose de nanopartículas que atingem esferas de glioblastoma derivadas do paciente é então comparada para ilustrar como esta mímica bbtb pode ser usada para visualizar a passagem de compostos do lado sanguíneo para o lado cerebral. O sinal fluorescente associado ao NP110 co-localiza com os lysosomos nas células endoteliais, astrócitos e células tumorais. Além disso, np110s são detectados entre as células endoteliais e os astrócitos, passando pelos poros de membrana da inserção.A passagem de NP110s é quantificada medindo a fluorescência de amostras coletadas tanto do lado do sangue quanto do cérebro, e esses valores são comparados com as nanopartículas determinadas que são 350 nanômetros. Como pode ser visto, apenas np110s são capazes de atravessar as mímicas BBTB, enquanto NP350 permaneceu no lado do sangue, resultando em valores de permeabilidade mais baixos para essas nanopartículas. Manuseie a inserção com cuidado e espalhe cautelosamente a suspensão celular de astrócito no lado cerebral da pastilha sem contato direto com a membrana.Qualquer dano da membrana resultará em vazamento. Este método pode ser adaptado para responder à questão da entrega cerebral de cargas administradas periféricas. Usando diferentes pastilhas com poros de membrana maiores, também é possível estudar extravasão celular.Esta técnica pode ser modificada usando diferentes tipos de células para imitar outras barreiras celulares. Também abre caminho para uma pesquisa mais responsável e ética, visando reduzir o número de animais de laboratório usados para validação de medicamentos anticâncicos. Lembre-se que o paraformaldeído é um químico muito tóxico e deve ser tratado de acordo.Além disso, tenha cuidado ao usar um bisturi afiado para extrair as membranas das pastilhas.

predicting-vivo-payloads-delivery-using-blood-brain-tumor-barrier

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Comece com um modelo de glioblastoma em camundongos, um tumor cerebral invasivo.Na periferia do tumor, a barreira hematoencefálica (BHE) permanece intacta, com células endoteliais formando junções apertadas que regulam a entrada molecular.O mouse é equipado com uma fibra óptica montada na cabeça para fornecer luz laser.Administre um laser infravermelho de baixa intensidade, que penetra na pele e no crânio para atingir o cérebro.O laser excita o oxigênio molecular nas células cerebrais, gerando...

Ruptura da barreira hematoencefálica induzida por laser para entrega de lipossomas em um modelo de glioblastoma em camundongo

Neste vídeo, descrevemos um protocolo abrangente para estabelecer um modelo in vitro que imita a barreira hematoencefálica. O modelo promete entender a entrega de agentes terapêuticos para o tratamento de tumores cerebrais.

Barreira hematoencefálica ou modelo BBTB: uma adaptação da barreira hematoencefálica ou modelo BBB para avaliar a administração terapêutica ao tumor

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A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

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Aprenda a criar um modelo in vitro da barreira hematoencefálica tumoral usando células murinas e humanas para testar a entrega de fármacos ao sistema nervoso central. Este método permite quantificar e visualizar a passagem de compostos terapêuticos antes de testes pré-clínicos.

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