Name: Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda ensaios de ubiquitinação e deubiquitinação in vitro para estudar modificações pós-traducionais em histonas nucleossomais. Este método permite identificar domínios enzimáticos e desenvolver triagens para inibidores moleculares.

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Agradecemos a Diana Adjaoud pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (2015-2020), o genoma Quebec (2016-2019) e o genoma do Canadá (2016-2019) para E.B.A. E.B.A. é um estudioso sênior do Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). A L. M e a N.S.K. têm uma bolsa de doutoramento da FRQ-S. A H. B teve uma bolsa de doutoramento do Ministério do ensino superior e da investigação científica da Tunísia e da Fundação Cole.

1. GSH-agarose afinidade purificação do GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 ubiquitin ligase Complex
<ol><li>Use a construção de expressão de bactérias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) para transformar bactérias BL21 (DE3) (ver tabela de materiais)23. Esta construção permite a expressão do domínio RING1B murino 1-159 fundido ao domínio BMI1 1-109 com tag de GST no backbone de pGEX-6P-2.</li>
	<li>Realize uma cultura de início noturno inoculando RIL-bactérias expressando GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) em 20 mL de caldo LB na presença de 100 μg/mL de ampicilina e 50 μg/mL de cloranfenicol. Incubar agitando a 37 ° c durante a noite. No dia seguinte, adicione a cultura de arranque a um balão de 1 L contendo 500 mL de caldo fresco LB (1/26 diluição) com ampicilina e incubar a cultura na coqueteleira a 37 ° c durante 2 a 4 h.</li>
	<li>
Durante o tempo de incubação, medir o OD em 600 nm com um espectrofotômetro. Quando a cultura de bactérias atinge 0,6 unidades de OD a 600 nm, tome uma alíquota de 1 mL em um tubo de 1,5 mL como a amostra não induzida. Adicionar 400 μM de isopropílico β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) à cultura 1 L para induzir a expressão protéica. Incubar bactérias a 25 ° c por 6 h para a noite.
	<ol>
<li>Centrifugue as alíquotas de 1 mL em 14.000 x g por 30 s, descarte o sobrenadante, resuma a pelota em 200 μL de tampão da amostra de Laemmli, e mantenha para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul da indução da proteína.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira a cultura de bactérias induzidas do balão para uma garrafa de centrifugação limpa e gire para baixo a 3.500 x g durante 15 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e ressuscita o pellet com 40 mL de PBS frio e gire para baixo a 3.500 x g por 15 min a 4 ° c.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e congele o pellet em-80 ° c ou prossiga para a próxima etapa. Se as proteínas forem induzidas com o peso molecular esperado, avance para o passo seguinte.</li>
	<li>Ressuscita as bactérias pellet em 25 mL de gelo-frio lise tampão a (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm pmsf, 0,5 mm DTT, e 1/100 anti-protease cocktail contendo AEBSF, aprotinina, Bestatina, e-64, Leupeptina, e Pepstatin A). Certifique-se de que todas as bactérias pellet é ressuscipended. O PMSF e o coquetel antiprotease devem ser recém-adicionados ao tampão de Lise, apenas no momento da lise das bactérias. Atenção: Mantenha sempre a amostra no gelo. Nota: Lysozyme em 100 μg/mL pode ser adicionado para aumentar a Lise das bactérias.</li>
	<li>Incubar o lisado de bactérias no gelo por 15 min. Use um sonicador de sonda e proceda em 70% de amplitude de saída para 30 s (4 – 5x) e, em seguida, centrifugue a 21.000 x g por 20 min a 4 ° c. Atenção: Durante a sonicação, mantenha sempre as amostras no gelo.</li>
	<li>Durante o tempo de centrifugação, tomar 500 μL embalado GSH-agarose grânulos (50% chorume) em um tubo de 15 mL e adicionar 10 mL de tampão a sem PMSF e anti-proteases. Misture brevemente e gire a 2.500 g por 3 min a 4 ° c, repita este passo de lavagem mais duas vezes e mantenha as contas no gelo.</li>
	<li>Após a centrifugação bacteriana do lisado, colete o sobrenadante e transfira-o em um tubo cónico de 50 ml. Tome uma alíquota de 100 μL como um lisado total e adicione 100 μL do amortecedor da amostra de 2x Laemmli para a análise do azul de SDS-PAGE e de Coomassie.</li>
	<li>Filtre o lisado através do filtro da seringa do pore de 0,45 μm e misture-o com os grânulos de GSH. Incubar a 4 ° c com agitação por 5 h. Gire para baixo os grânulos em 2.500 x g por 3 minutos, remova, e excepto o sobrenadante como o fluxo completamente. Lave as esferas ligadas às proteínas-GSH 6 vezes (5 mL cada) com o tampão a contendo o cocktail antiprotease e o PMSF.</li>
	<li>Após a última lavagem, transfira as contas juntamente com 10 mL de tampão em uma coluna de cromatografia vazia, adicione 1,5 mL de tampão a contendo 25 mm de glutationa, e colete a eluição por gravidade em 1,5 ml de microtubos. Repita o procedimento de eluição 4 vezes. Nota: A solução em estoque de glutationa é preparada a 200 mM de concentração em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5</li>
	<li>Tome uma alíquota de 10 μL de cada uma das 4 eluições e adicione 10 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli. Estas amostras serão usadas para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul para determinar a presença e a pureza das proteínas purificadas. Nota: Após a última eluição, manter as contas em buffer a 4 ° c para reciclagem e uso futuro.</li>
	<li>Escolha as frações eluidas que mostram quantidades razoáveis de proteínas purificadas para uma análise mais aprofundada. Faça pequenas alíquotas da preparação. Armazene as proteínas purificadas em-80 ° c. Normalmente, a concentração proteica irá variar de 0,5 μg a 2 μg por μL e as amostras podem ser armazenadas neste estado.</li>
	<li>
Opcional: Concentre a amostra ou altere o buffer usando uma unidade de filtro centrífugo 10K</li>
</ol>2. purificação do complexo de Deubiquitinase BAP1/DEUBAD (ASXL2)
<ol><li>Use pET30a +-his-BAP138 e PDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 construções bacterianas da expressão para transformar BL21 (de3) bactérias RIL para a produção de his-BAP1 e de MBP-deubad respectivamente.</li>
	<li>Realize duas culturas de partida durante a noite separadas incubando his-BAP1 e MBP-DEUBAD (ASXL2) expressando bactérias em 20 ml de caldo lb de meio de ampicilina contendo 50 μg/ml de cloranfenicol e o antibiótico correspondente para cada plasmídeo, 100 μg/ mL de canamicina ou 100 μg/mL de ampicilina, respetivamente. Coloque na coqueteleira a 37 ° c.</li>
	<li>Execute as etapas 1.3 – 1.6.</li>
	<li>
Ressuscita as pelotas de bactérias em 25 mL de tampão de Lise gelo-frio B (50 mM TRIS pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-Mercaptoetanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF e 1/100 anti-protease cocktail). Misture volumes iguais do his-BAP1 com os lisados de MBP-DEUBAD e incubar no gelo por 15 min. SONICATE e depois centrifugar o lisado como indicado no protocolo 1 (passo 9).
	<ol>
<li>Durante a centrifugação, prepare 500 μL de grânulos de agarose de NI-NTA (50% de chorume) lavando-os três vezes com tampão B sem PMSF e coquetel antiprotease.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a centrifugação bacteriana do lisado, colete o sobrenadante e transfira-o em um tubo cónico de 50 ml. Tome uma alíquota de 100 μL como um lisado total e adicione 100 μL do amortecedor da amostra de 2x Laemmli para a análise do azul de SDS-PAGE e de Coomassie.</li>
	<li>
Filtre o lisado através do filtro de seringa de poros de 0,45 μm e misture-o com os grânulos NI-NTA. Incubar a 4 ° c com agitação por 5 h. Gire para baixo os grânulos em 2.500 x g por 3 minutos, remova, e excepto o sobrenadante como o fluxo completamente.
	<ol>
<li>Lave os grânulos 6 vezes (5 mL cada) com tampão B contendo 20 mm 1,3-diaza-2,4-ciclopentadieno (imidazol). Nota: fazer uma solução de estoque de 2 M imidazol em pH 7,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a última lavagem, transfira os grânulos com 10 mL de tampão para uma coluna de cromatografia vazia, adicione 1 mL de tampão B contendo 200 mm de imidazol e colete a eluição por gravidade em microtubos de 1,5 ml contendo 10 ΜL de dtt (500 mm) e 2 ΜL de EDTA (500 mm , pH: 8). Repita o procedimento de eluição 4 vezes. Tome 10 μL de cada fração de eluição e adicione 10 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli para análise de SDS-PAGE e de azul de Coomassie. Pool as frações eluída desejadas. Nota: Mantenha as contas em buffer a 4 ° c para reciclagem e uso futuro.</li>
	<li>
Diluir o complexo eluído 3 vezes com tampão C (50 mM TRIS pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF e 1/100 inibidor de protease cocktail) antes da incubação com os grânulos de agarose de amilose.
	<ol>
<li>Prepare grânulos de agarose de amilose (500 μL embalados) lavando-os 2 vezes com o tampão C sem adicionar PMSF e coquetel antiprotease. Adicionar os grânulos à eluição diluída e incubar durante a noite a 4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugador em 2.500 x g por 3 minutos e mantenha o fluxo completamente. Lave as esferas de proteínas-limites com 5 mL de tampão C (5 – 6x).</li>
	<li>Mantenha o complexo purificado his-BAP1/MBP-deubad nos grânulos do Agarose do amilose no tampão D (50 milímetros HEPES pH 8,0, 50 milímetros NaCl, 10% glicerol, e 1 milímetro DTT) e armazene em-80 ° c. Tome 20 μL da fração de grânulos (50% de solução de grânulos) e adicione 20 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli para a análise de SDS-PAGE e de azul de Coomassie.</li>
</ol>3. purificação dos Nucleosomos de células HEK293T
<ol><li>Cultura HEK293T células em completo Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 5% recém-nascido bezerro soro (NBS), 2 mM L-glutamina, e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Placa em torno de 12 x 106 HEK293T células em 20 ml de mídia completa por prato de cultura de 15 cm um dia antes do transfection (10 pratos foram usados). Antes do transfection, mude o meio da pilha a 12 ml do meio soro-livre e transfecção as pilhas com 21 μg de pcdna-Flag-H2A usando 63 μl do tais (PEI) em 1 mg/ml36. Mude para o meio completo 12 h mais tarde.</li>
	<li>Três dias após a transfecção, lave as células com 15 mL de PBS gelado (duas vezes) e colá-las em 3 mL de PBS gelada usando um raspador de células. Centrifugador a 2.100 x g durante 8 min a 4 ° c. Descarte o PBS e prossiga para a etapa de Lise ou congele o pellet celular em-80 ° c.</li>
	<li>Ressuscita o pellet celular em cerca de 10 volumes de buffer e (50 mm Tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm PMSF, 1/100 inibidor de protease cocktail, e 20 mm de N-METILMALEIMIDA (nem)) e incubar no gelo por 20 min. adicionando N-methylmaleimide (NEM) é crítico para inibir DUBs que copurify com nucleosomes.</li>
	<li>
Após a centrifugação em 3.000 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuscitem a pelota da cromatina em 10 volumes de tampão e. misture por inversão e centrifugador em 3.000 x g por 5 min.
	<ol>
<li>Repita a etapa de lavagem outra vez usando buffer e e duas vezes usando buffer F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm CAcl2, 0,3 M de sacarose, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, e 1/100 inibidor de protease cocktail). Cuidado: o pellet flutuará durante as lavas e centrifugação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspender a cromatina em tampão F de 5 ml e tratar a pelota com nuclease Micrococcal (mnase) (3 U/ml por 10 min à temperatura ambiente). Nota: A reação pode ser auxiliada pela mistura usando um homogeneizador dounce.</li>
	<li>
Após a incubação, tomar uma alíquota de 40 μL da mistura para análise de fragmentos de DNA nucleossomal. Misture esta alíquota com 40 μL de fenol/clorofórmio e 20 μL de tampão de carregamento de ADN 6x, vortex, gire a 18.000 x g durante 2 min e carregue o ADN num gel de agarose a 2%.
	<ol>
<li>Quando o DNA é predominantemente um fragmento de 147 BP correspondente a mononucleossomas, pare a reação adicionando EDTA de 5 mM na concentração final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a centrifugação a 21.000 x g durante 20 min a 4 ° c, incubar a fração de cromatina solúvel com resina anti-Flag durante a noite a 4 ° c. Lave as contas com 6x tampão G (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 5 mm EDTA, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 inibidores da protease cocktail).</li>
	<li>Transfira as contas com 5 mL de tampão G para uma coluna de cromatografia vazia. Elute os nucleossomos grânulos-limitados com 200 μg/ml do peptide da eluição da bandeira. Utilize um tampão de eluição composto por tampão G contendo 200 μg/ml peptídeos de eluição de sinalizador (ver tabela de materiais) e 1/5 (vol: Vol) 1 M Tris, pH 8,0. Elute os nucleossomos 3x com 260 μl tampão da eluição da bandeira (2 h cada eluição).</li>
	<li>Teste as 3 eluições tomando uma alíquota para a extração do fenol-clorofórmio e carregue o ADN em um gel do agarose de 2%. Tome 10 μL de cada fração de eluição e adicione 10 μL de tampão de amostra de Laemmli 2x para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul e carregue cada eluição para a deteção ocidental do borrão de H2A. Armazene a eluição em-80 ° c. Em geral, a purificação de células humanas produz menos quantidade de proteínas do que a das bactérias, com concentrações variando de 0,1 a 0,5 μg/μL.</li>
</ol>4. nucleosome Ubiquitinação ensaio usando BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase Complex
<ol><li>Centrifugue os nucleosomos através dos filtros centrífugos do pore 0,5 mL de 10K para mudar o substrato do amortecedor da eluição ao amortecedor H da reação (25 milímetros Tris, pH 7,5; 10 milímetros MgCl2, e 5 milímetros ATP). Alternativamente, os nucleossomos disponíveis comercialmente podem ser usados para o ensaio. Nota: A alteração da solução de suspensão do substrato para o tampão de reação assegura a reprodutibilidade e previne a potencial inibição da ligase E3 por compostos presentes na mistura de eluição da bandeira.</li>
	<li>Incubar 1 μg dos nucleossomas em 40 μL de volume total de tampão H. Adicione o UB ativando enzyme (UBE1) (250 NG), UB (50 ng/μL) e E2 UB-conjugating enzimas (672 NG), e 1 μg de BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase complexo. Incubar a reacção durante 3 h a 37 ° c com agitação ocasional. Nota: Vários controles podem ser conduzidos em paralelo, incluindo omitindo, E1, E2, E3, ATP e ubiquitina. Isto assegura a especificidade para a reação do ubiquitinação.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 40 μl do amortecedor da amostra de 2x Laemmli e analise o histona H2A K119 ubiquitinação por SDS-PAGE e por blotting ocidental, de acordo com procedimentos padrão. Use anticorpos anti-H2A ou H2A K119ub (ver tabela de materiais).</li>
</ol>5. in vitro Nucleossomal H2A ensaio DUB usando BAP1/DEUBAD
<ol><li>Utilize os nucleossomas purificados para o ensaio de deubiquitinação in vitro. Ressuscita 100 – 500 ng de nucleossomas em 40 μL de tampão I (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL e 1 mm DTT). Adicionar 1 μg de BAP1 bactérias-purificada his-BAP1 e MBP-DEUBAD. Realize a reação de deubiquitinação por 3 h a 37 ° c com agitação ocasional.</li>
	<li>Pare a reacção in vitro adicionando 40 μL de 2x tampão de Laemmli e analise por immunoblotting.</li>
</ol>

<ol><li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+ubiquitin+chains%3A+E2+enzymes+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li>
<li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li>
<li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Ligases%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li>
<li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li>
<li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense%3A+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li>
<li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li>
<li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li>
<li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li>
<li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li>
<li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li>
<li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li>
<li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li>
<li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li>
<li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%3A+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li>
<li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li>
<li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma%2C+lung+adenocarcinoma%2C+meningioma%2C+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li>
<li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li>
<li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li>
<li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li>
<li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li>
<li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li>
<li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li>
<li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2%2B+flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385(2018).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAP1%2FASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li>
<li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li>
<li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li>
<li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li>
<li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%2FASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292(2016).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Existem várias vantagens de estabelecer ensaios de ubiquitinação e deubiquitinação robustos in vitro para proteínas de interesse. Esses ensaios podem ser usados para: (i) estabelecer condições ideais e definir o requisito mínimo para essas reações, (II) determinar as constantes enzimáticas e bioquímicas, (III) definir os papéis de cofatores ou inibidores que podem impactar essas reações, (IV) identificar interfaces de interação, (v) testar o impacto de mutações artificiais ou associadas à doença e (vi) estabelecer condiç...

A ubiquitinação é uma das modificações pós-translacionais mais conservadas e é fundamental para uma grande variedade de organismos, incluindo leveduras, plantas e vertebrados. A ubiquitinação consiste na fixação covalente da ubiquitina, um polipeptídeo de aminoácido 76 altamente conservado, para direcionar proteínas e ocorre em três etapas sequenciais envolvendo três enzimas, ou seja, E1-ativando, E2-conjugating e E3 ligase1, 2,3. Esta modificação pós-translacional desempenha papéis centrais em um amplo espectro de processos biológicos. De fato, as ligases da E3, que proporcionam a especificidade da reação, constituem uma grande superfamília de enzimas e são as enzimas mais abundantes do sistema de ubiquitina4,5,6. Os efeitos a jusante do ubiquitinação da proteína dependem da natureza da modificação: monoubiquitination, multimonoubiquitination, e polyubiquitination linear ou ramificado. O monoubiquitination é associado raramente com a degradação degradação, mas preferivelmente esta modificação é envolvida em mediar vários eventos de sinalização. A poliubiquitinação envolve o N-terminal ou os resíduos de lisina na própria molécula de ubiquitina, e o destino de uma proteína policuquitinada depende de qual resíduo está envolvido na extensão da cadeia de ubiquitina. Há muito se sabe que a poliubiquitinação mediada pela lisina 48 de ubiquitina induz a degradação degradação. Pelo contrário, a poliubiquitinação via lisina 63 da ubiquitina é frequentemente associada à ativação proteica7,8,9. Semelhante a outras importantes modificações pós-translacionais, a ubiquitinação é reversível e a remoção de ubiquitina de proteínas é assegurada por proteases específicas denominadas deubiquitinases (DUBs), que surgiram como importantes reguladores dos processos celulares 2. º , 10. importante, muitos dubs são altamente especializados, e regulam, através deubiquitinação, substratos específicos, indicando que um equilíbrio fino entre ubiquitinação e deubiquitinação é crítico para a função protéica. E3s e dubs, junto com a maquinaria da degradação do Proteassoma e os fatores acessórios, formam o sistema do Proteassoma de ubiquitin (UPS, com > 1200 genes) que regula as vias de sinalização principais, diversas de que são associadas com o crescimento e a proliferação da pilha, determinação de destino celular, diferenciação, migração celular e morte celular. É importante ressaltar que a desregulação de várias cascatas de sinalização envolvendo a ubiquitinação promove atumorigênese e as doenças neurodegeneradas5,11,12,13, a 14.
A ubiquitinação desempenha papéis penetrantes na biologia da cromatinae nos processos dependentes de DNA15,16,17. Por exemplo, a monoubiquitinação da histona H2A em lisina 119 (doravante H2A K119ub) é uma modificação crítica pós-translacional envolvida na repressão transcricional e no reparo do DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub é catalisada pelo complexo repressivo Polycomb 1 (PRC1), que desempenha um papel fundamental na manutenção da informação epigenética e é altamente conservado da Drosophila para o ser humano. O PRC1 canônico é constituído, notavelmente, pelos RING1B e BMI1, que são o núcleo do complexo de ligase da ubiquitina E3, responsável pelo evento de ubiquitinação22,23. Na Drosophila, a monoubiquitinação H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub em mammalianos) é revertida pelo Dub Calypso, que interage com o adicional sexo Comb (ASX) formando o polycomb-REPRESSIVE Dub (PR-Dub) complexo24. O ortólogo de mamíferos de Calypso, BAP1, é um supressor de tumor suprimido ou inativado em várias malignidadeshumanas 25,26,27,28, 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33. BAP1 regula os processos dependentes de DNA no núcleo e apoptose mediada por sinalização de cálcio no retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monta complexos proteicos multisubunitários contendo reguladores de transcrição notavelmente ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (asxls), três ortologues de ASX38,43. Asxls use o domínio do adaptador deubiquitinase (deubad), também denominado domínio asxm, para estimular BAP1 atividade Dub35,36,44. Assim, ASXLs desempenham papéis importantes na coordenação da atividade BAP1 DUB na cromatina e, mais amplamente, sua função supressor tumoral.
Existem vários métodos para estudar os processos de ubiquitinação e deubiquitinação. Notavelmente, os ensaios bioquímicos usando proteínas purificadas de bactérias permanecem muito poderosos na demonstração de ubiquitinação direta ou remoção de ubiquitina de substratos específicos. Esses experimentos podem ser conduzidos para investigar uma série de parâmetros como determinar a exigência de complexos mínimos, determinar a cinética de reações, definir relações estrutura/função e compreender o impacto da patologia patológica mutações genéticas. Aqui, nós fornecemos protocolos para realizar reações de ubiquitinação e deubiquitinação em substratos de cromatina com componentes purificados. Como um sistema modelo, o ubiquitinação in vitro e o deubiquitination da proteína H2A o são apresentados. As proteínas bactérias-purificadas montadas em complexos mínimos de RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD são usadas para ubiquitinação ou deubiquitinação de H2A nucleossomal, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Contas de agarose amilose</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL filtros centrífugos 10K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>#8240</td><td></td></tr><tr><td>Contas Anti-Flag-agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A4596</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel anti-protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#P8340</tr><tr><td>BL21 (DE3) Bactérias CodonPlus-RIL</td><td>Agilent technologies</td><td>#230240</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de cromatografia vazia</td><td>Biorad</td><td>#731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo de bandeira</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F3290</td><td></td></tr><tr><td>GSH-grânulos de agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G4510</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>#CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I5513</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease microcócica (MNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N3755</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA contas de agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#88221</td><td></td></tr><tr><td>N-metilmaleimida (NEM)</td><td>Bioshop</td><td>#ETM222</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa de poros 0.45 &mu; m</td><td>Sarstedt</td> <td># 83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td> <td>Polysciences Inc</td> <td># 23966-1</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159) -Bmi1 (1-109)</td> <td>Addgene</td> <td># 63139</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Ativadora de Ub (UBE1)</td> <td>Boston Biochem</td><td>#E-305</td><td></td></tr><tr><td>UBCH5C (UBE2D3)</td> <td>Boston Biochem</td><td>#E2-627</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de ubiquitinação e deubiquitinação in vitro de histonas nucleossomal

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em várias vias de sinalização e é notavelmente envolvida na coordenação da função de cromatina e processos associados ao DNA. Esta modificação envolve uma ação seqüencial de diversas enzimas que incluem E1 ubiquitin-ativando, E2 ubiquitina-conjugating e E3 ubiquitina-ligase e é revertida por deubiquitinases (DUBs). A ubiquitinação induz a degradação de proteínas ou alteração da função protéica, incluindo modulação da atividade enzimática, interação proteína-proteína e localização subcelular. Uma etapa crítica em demonstrar a ubiquitinação da proteína ou o deubiquitination é executar in vitro reações com componentes purified. As reações eficazes do ubiquitinação e do deubiquitination podiam extremamente ser impactadas pelos componentes diferentes usados, pelos cofactores da enzima, pelas condições do amortecedor, e pela natureza do substrato.  Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a realização de reações de ubiquitinação e deubiquitinação. Nós ilustramos estas reações usando componentes mínimos do rato polycomb repressive complexo 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, uma ligase de ubiquitina E3 que monoubiquitinates histona H2A em lisina 119. A deubiquitinação da H2A nucleossomal é realizada por meio de um complexo mínimo de Policomb repressivo Deubiquitinase (PR-DUB) formado pelo deubiquitinase humano BAP1 e pelo domínio do adaptador DEUBiquitinase (DEUBAD) de seu fator ASXL2. Esses ensaios de ubiquitinação/deubiquitinação podem ser conduzidos no contexto de nucleossomas recombinantes reconstituídos com proteínas purificadas por bactérias ou nucleossomas nativos purificados de células de mamíferos. Destacamos as complexidades que podem ter um impacto significativo sobre essas reações e propomos que os princípios gerais desses protocolos possam ser rapidamente adaptados a outras ligases e deubiquitinases de ubiquitina da E3.

As proteínas GST-BMI1 e RING1B são bem produzidas em bactérias e podem ser prontamente extraídas na fração solúvel. A Figura 1a mostra uma coloração azul Coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BMI1-RING1B. As bandas GST-BMI1 e RING1B migram para o peso molecular esperado, ~ 45 kDa e ~ 13 kDa, respectivamente. Notavelmente o complexo de ligase E3 é altamente homogêneo, com níveis muito baixos de proteínas de bactérias contaminantes e/ou produtos...

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Dada a complexidade das reações de ubiquização e deubiquitina dentro das células é importante estabelecer ensaios in vitro com componentes purificados definidos. Isso ajuda a entender os mecanismos de ubiquização e desubiquização e também determinar como mutações associadas a genes que codificam as enzimas responsáveis por essa reação podem causar doenças humanas. Podemos identificar os domínios e motivos nesses componentes que impulsionam essas reações.Também podemos desenvolver ensaios de tela de alto rendimento que podem ser usados para testar inibidores de pequenas moléculas que podem ser desenvolvidos como potenciais terapêuticos. Para iniciar a lise bacteriana, adicione o TPM e o coquetel antiprotease no tampão de lise gelada A.Adicione 25 mililitros do tampão de lise A na garrafa contendo pelotas de bactérias e resuspenque a pelota. Transfira o lysato contendo bactérias em um tubo para sônicação.Use um sonicador de sonda para sonicar a amplitude de saída de 70% durante 30 segundos, quatro a cinco vezes. Em seguida, centrífuga a 21.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois de incubar o lise de bactérias com contas GSH por cinco horas de acordo com o manuscrito, transfira as contas junto com 10 mililhadores de tampão em uma coluna de cromatografia vazia.Em seguida, adicione 1,5 milileiros de tampão A contendo glutationa de 25 mililitros na coluna e colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro. Repita o procedimento de elução quatro vezes com tampão fresco A um tratamento contínuo das frações elucidadas de acordo com o manuscrito. Para começar, resuspenco as pelotas de bactérias His-BAP1 e MBP-DEUBAD em 25 mililteiros de tampão de lise gelada B.Misture 25 mililteiros de cada lise e incubar no gelo por 15 minutos.Sonicize e depois centrifufique o lise a 21.000 vezes g por 20 minutos. Após a centrifugação de lise, transfiltre o lysato através de um filtro de seringa porosa de 0,45 micrômetro em uma garrafa e misture-o com as contas nickel NTA. Incubar a quatro graus Celsius com agitação por cinco horas.Depois disso, gire as contas a 25.000 vezes g por três minutos. Use uma pipeta para salvar o supernatante em um tubo de 50 mililitros enquanto o fluxo passa. Lave as contas com cinco milileiros de tampão B, contendo 20 milimidazol, seis vezes com centrífuga de três minutos.Após a última lavagem, transfira as contas com 10 mililitros de tampão B em uma coluna de cromatografia vazia e adicione um mililitro de tampão B contendo 200 milimidazol. Colete a elução por gravidade em microtubos de 1,5 mililitro contendo DTT e EDTA. Repita o procedimento de eluição quatro vezes e acumule as frações elucidadas desejadas em um tubo de 15 mililitros.Adicione o tampão C para diluir o complexo elucido três vezes. Em seguida, transfira a elução diluída para as contas de amilolose preparadas em tubos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Pela manhã, centrifufique os tubos a 2.500 vezes g por três minutos e mantenha o supernasal em um tubo de 15 mililitros como fluxo através.Lave as contas ligadas à proteína com cinco milileiros de tampão C por cinco a seis vezes. Em seguida, adicione 500 microliters de buffer D ao complexo purificado His-BAP1/MBP-DEUBAD nas contas agarose amilose para fazer uma solução de contas de 50%. Transfira 20 microliters da solução de 50% de contas para um tubo de microcentrifuuga e adicione 20 microliters de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli para análise azul SDS-PAGE e Coomassie.Armazene a solução de contas restante a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Após a cultura das células HEK293T, placa 12 milhões de células em 20 milímetros de mídia completa em um prato de cultura de 15 centímetros, um dia antes da transfecção. Depois de um dia, sob o capô da cultura celular, aspirar mídia e fornecer com 12 mililitros de mídia livre de soro.Transfeito as células com 21 microgramas de pCDNA flat-H2A usando 63 microliters de PEI a um miligrama por mililitro. Após 12 horas, mude para meio completo. Após a colheita das células de acordo com o manuscrito, resuspenha a pelota celular em cerca de 10 volumes de tampão E contendo NEM para inibir deubiquitinases e incubar no gelo por 20 minutos.Após centrifugação a 3.000 vezes g por cinco minutos, descarte o supernasce. Lave a pelota de cromatina duas vezes com 10 volumes de tampão E primeiro e depois lave duas vezes com tampão F.Resuspende a cromatina em cinco mililteiros de tampão F e trate a pelota com nuclease microcócica na concentração de três unidades por mililitro por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, transfira uma alíquota de 40 microliter da mistura para um tubo de 1,5 mililitro para análise de fragmentos de DNA nucleosômicos.Adicione 40 microliters de fenol-clorofórmio e 20 microliters de seis vezes tampão de carregamento de DNA. Vórtice e gire a 18.000 vezes g por dois minutos. Em seguida, transfira 15 microliters da fase aquosa em um gel de 2% de agarose para carregar o DNA.Depois de parar a reação e a centrifugação de acordo com o manuscrito, incubar a fração de cromatina solúvel com contas de resina anti-bandeira em um tubo de 15 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. Lave as contas seis vezes com o buffer G.Transfira as contas com cinco mililitros de tampão G em uma coluna de cromatografia vazia. Diluir os nucleossomos ligados da conta com 260 microliters de buffer G contendo 200 microgramas por mililitro de peptídeo de eluição de bandeira e um a cinco tris molares em pH oito.Elute o nucleossomo três vezes, uma hora na sala fria. Para realizar o ensaio de ubiquização, adicione primeiro um micrograma dos nucleosómos purificados em 40 microliters de tampão H.Depois disso, adicione uma mistura de solução enzimática contendo 250 nanogramas de UBE1, 672 nanogramas de enzimas conjugais UB e E2 UBting e um micrograma de BMI1-RING1B E3 ubiquitin ligase no tubo. Incubar a reação por três horas a 37 graus Celsius com agitação ocasional.Pare a reação adicionando 40 microlitadores de duas vezes o Tampão de Amostra de Laemmli e analise a ubiquitina histone H2AK119 por mancha ocidental. Para realizar o ensaio de deubiquitina in vitro, resuspenja os nucleossomos purificados em 40 microliters de tampão I e um micrograma de bactérias purificadas Contas His-BAP1/MBP-DEUBAD. Coloque o tubo em uma incubadora a 37 graus Celsius durante três horas para realizar a reação de deubiquitinação com agitação ocasional.Em seguida, pare a reação adicionando 40 microliters de duas vezes tampão Laemmli e analise por imunoblotação. Neste experimento, a coloração azul coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BM1-RING1B usando contas de afinidade GST, mostra que as bandas migram em peso molar esperado em torno de 45 kilodaltons e 13 kilodaltons, respectivamente. Da mesma forma, a purificação do complexo His-BAP1 MBP-DEUBAD também resultou em preparações homogêneas relativamente altas com bandas em torno de 90 kilodaltons e 55 kilodaltons, respectivamente.Por outro lado, a fração nucleossômica purificada é essencialmente composta por uma faixa de par de 147 bases indicando a presença de fração mononucleosômica altamente enriquecida. A coloração azul coomassie de nucleosósmos purificados mostra um padrão típico de banda das quatro subunidades histonas com quantidades estequiométricas. A ubiquiinação da histona H2A com o complexo BMI1-RING1B mostra um aumento temporal dependente da forma ubiquitinada da proteína, enquanto os níveis da forma não modificada são concomitantemente diminuídos.A reação de ubiquização é total, pois praticamente todas as proteínas H2A são transformadas em H2A K119ub. Por outro lado, foi realizado ensaio de deubiquitina. Após a incubação desses nucleosósmos com BAP1-DEUBAD foi observada uma redução temporal dependente do sinal H2A K119ub.O sucesso das reações de ubiquização e deubiquitina dependem da forma como a proteína é purificada. Precisamos de um bom rendimento e o uso de tampão para ressuspensão e purificação de proteínas deve ser compatível com reações bioquímicas. Quando este ensaio de ubiquitina e deubiquitina são bem estabelecidos podemos testar os ativadores e inibidores de afeto, bem como o impacto de mutações genéticas associadas à doença.Este método foi estabelecido pela contribuição de diversos laboratórios e são muito úteis para compreender os mecanismos de ubiquização e desubiquização. Vários produtos químicos são perigosos e precisam ser manipulados no capô. Isso inclui fenol-clorofórmio, ácidos, bases e agentes redutos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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