Name: Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo duplo de ligadura cecal e punção com infecção intranasal em camundongos para estudar imunossupressão induzida por sepse e infecções secundárias. Este protocolo auxilia pesquisadores a compreender mecanismos de infecção hospitalar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de subsídios à saúde R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 para M. W. As instalações da Universidade de North Dakota Core foram apoiadas por subsídios NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Este trabalho foi apoiado igualmente pelo programa chave da Fundação Nacional da ciência da natureza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (centro de saúde rural, Universidade de Dakota do Norte) por fazer o vídeo.

Todos os métodos aqui descritos foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade de Dakota do Norte (IACUC).
1. ligadura e punção cecal
Nota: fêmeas C57BL/6 camundongos (peso, 18-22 g; idade, 6-8 semanas) são divididos aleatoriamente em seis grupos: grupo controle (Ctrl), grupo de infecção (SA para S. aureus), dois grupos Sham, e dois grupos CLP. CTRL animais são deixados sem cirurgia e lesões secundárias infecção. Os animais SA são submetidos à infecção pulmonar por S. aureus sem a operação. Os animais operados por Sham passam pela mesma laparotomia com uma exposição do cálio (exceto que o cálio não é ligado nem perfurado). Oito camundongos por grupo são usados para análise de sobrevida, e três a cinco camundongos são usados para avaliação da inflamação em vários timepoints.
<ol><li>Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e materiais por autoclavagem por 20 min. Limpe e desinfete a tabela de funcionamento com limpezas do desinfetante. Para estabelecer condições estéreis durante a cirurgia, cubra os campos operativos inteiros com as cortinas cirúrgicas estéreis apropriadas, e desgaste uma tampa do cabelo, uma máscara cirúrgica, uns óculos protetores, um vestido cirúrgico, e umas luvas estéreis.</li>
	<li>Pesar e anestesiizar o rato usando 0,1 ml/mouse de cetamina (80 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) mistura via intraperitoneal administrado. Com o polegar eo dedo indicador da mão esquerda formando uma posição em forma de U, aproximar o pescoço do mouse de trás suavemente e suavemente, em seguida, segure o pescoço imediatamente atrás das orelhas para que a cabeça do mouse é altamente contido. Use um mindinho para segurar a perna direita do mouse para trás e usar os dedos do meio e anel (todos os dedos da mão esquerda) para segurar o corpo.</li>
	<li>Verifique a intensidade da anestesia por pinça do dedo do pé até nenhuma flexão da extremidade.</li>
	<li>Raspar os quadrantes inferiores do abdômen usando uma navalha elétrica e desinfectar a área com iodo.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre a superfície estéril em uma posição supina, com a cabeça orientada para longe do operador. Drape o rato com a toalha estéril com furo sobre a incisão cirúrgica planeada para manter campos estéreis.</li>
	<li>Faça uma incisão longitudinal da pele (aproximadamente 0,5 cm de comprimento) com um bisturi no abdômen mais baixo esquerdo. Use tesouras pequenas para estender a incisão (1-2 cm). Cuidado: tenha cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal.</li>
	<li>Faça a incisão intramuscular para obter acesso na cavidade peritoneal e permitir a exposição do cálio com o intestino adjacente.</li>
	<li>Isolar o cálio no lado esquerdo do abdômen (na maioria dos casos, isso é feito usando fórceps anatômico sem corte) e removê-lo em um drapejar estéril, deixando os intestinos pequenos e grandes na cavidade peritoneal. Cuidado: Evite danificar os vasos sanguíneos mesentéricos.</li>
	<li>Ligate o ceco na posição longe do ponto de origem 25% para criar uma infecção prolongada com mortalidade relativamente baixa. PRECAUÇÃO: Certifique-se de que não ligadura a válvula ileocecal.</li>
	<li>Perfure o cálio com uma agulha de 21 G 1 1/2 por punção única através de e-through (dois furos) a meio caminho entre a ligadura e a ponta do cálio na área menos vascularizada. Cuidado: Certifique-se de não perfurar os vasos sanguíneos.</li>
	<li>Retire a agulha. Retire suavemente uma pequena quantidade de fezes dos orifícios de penetração para garantir a perfuração de espessura total. PRECAUÇÃO: Tome cuidado para não obstruir a continuidade intestinal durante o procedimento.</li>
	<li>Substitua o cálio na cavidade abdominal.</li>
	<li>Feche o abdômen em duas camadas com 4-0 suturas cirúrgicas de nylon. Feche a musculatura abdominal aplicando suturas de funcionamento simples e feche a pele aplicando suturas interrompidas simples. Limpe a pele com iodo.</li>
	<li>Injete 1 ml de solução de soro fisiológico normal (ns) pré-aquecido (37 ° c) 0,9% na parte traseira por via subcutânea para substituir a terceira perda de espaço e coloc a em uma almofada morna para recuperar.</li>
	<li>Retorne os ratos na gaiola em uma sala temperatura-controlada (22 ° c) com 12 h ciclos claros/escuros e livre o acesso à comida e à água. Monitore os ratos a cada 0,5 horas por pelo menos 2 h, em seguida, a cada 6 h para pelo menos 2 d, então a cada 12 h por 3 dias, ou eutanizar-los quando moribundo para a análise de sobrevivência. Nota: a analgesia pré e pós-operatória (buprenorfina, 50 μg/kg por via subcutânea a cada 12 h) é recomendada para 24 h antes da cirurgia até 48 h após a cirurgia9,10.</li>
</ol>2. infecção pulmonar secundária por S. aureus
Nota: excepto para os grupos CTRL e SA, os ratos sobreviventes aos 3 dias após o CLP nos grupos Sham e CLP devem ser administrados intranasalmente com 30 μL de uma suspensão bacteriana ou NS, respetivamente. Os ratos sobreviventes do grupo SA devem ser instilados intranasalmente com a suspensão bacteriana.
<ol><li>Anestesiar o rato, injetando intraperitonealmente 100 μL de solução de cetamina (45mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e aguarde até que o rato Respire lentamente. O ângulo de punção entre a agulha e a parede abdominal é inferior a 30 ° para a injeção lenta.</li>
	<li>Com a ajuda de uma micropipeta, lentamente e intranasal incutir com 30 μL de 1 x 107 colônia formando unidade (CFU) de S. aureus para ser aspirado em inalação. Segurando o mouse por suas orelhas em uma posição vertical, lentamente, solte 2-3 μL de suspensão bacteriana em ambas as narinas de cada vez. Ajuste a taxa de liberação para permitir que o mouse inspire sem formar bolhas e caindo fora.</li>
	<li>Levante o mouse para cima e para baixo, com a cabeça para cima e cauda para baixo, para ajudar as bactérias entram na traquéia. Mova o mouse para cima rapidamente e fortemente, enquanto movê-lo suavemente e lentamente para aumentar a gravidade. Repita a instilação sobre 15x até que todas as bactérias estejam inaladas, que devem tomar 10-15 minutos para cada rato.</li>
	<li>Coloque o mouse em suas costas e cabeça para cima na cama angular (cerca de 35 °) e ver o mouse até que sua respiração retorna ao normal e é completamente recuperado da anestesia e procedimentos.</li>
	<li>Coloque o mouse de volta na gaiola em uma sala com temperatura controlada (22 ° c) com 12 h de luz/ciclos escuros e acesso ilimitado à comida e água.</li>
	<li>Verifique as condições do mouse a cada 2 h para o primeiro dia e cada 12 h depois de 4 dias após a cirurgia. Eutanizar-los quando moribundo para a análise de sobrevivência ou 24 h após a infecção para a avaliação da inflamação.</li>
</ol>3. parâmetros analisados
<ol><li>Sobrevivência dos ratos<ol>
<li>Monitore os ratos por 7 dias. Eutanizar quando moribundo e gerar curvas de sobrevivência usando métodos de Kaplan-Meier11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagens bacterianas<ol>
<li>24 h após a injeção de SA, colher o sangue, fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), e fluido de lavagem peritoneal (PLF) dos camundongos. Posteriormente, adicione 100 μl dos diluentes às placas de ágar nutriente e cultive-as a 37 ° c por 24 h para determinar a contagem de colônias bacterianas11,12,13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citocinas Nota: as concentrações pró-inflamatórias de citocinas de IL-1 β, IL-6 e TNFα no soro e no BALF de camundongos devem ser avaliadas utilizando kits ELISA de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Revele a placa de 96 bem ELISA com 100 μL/poço da solução de trabalho diferente do anticorpo da captação para funcionar as normas na duplicata e nas amostras no Triplicate. Sele a placa e deixe-a durante a noite a 4 ° c.</li>
		<li>Lave a placa três vezes com 255 μL/tampão de lavagem do poço (1X PBS, 0, 5% Tween-20).</li>
		<li>Para bloquear a ligação não específica, adicione 200 μL/diluente de poço. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 1 h.</li>
		<li>Prepare a solução padrão: 8 2-Dobre diluições seriais de 1000 pg/mL.</li>
		<li>Adicionar 100 μL/poço de normas ou amostras aos poços adequados e 100 μL/poço de diluente aos poços em branco. Selar a placa e incubar em RT por 2 h ou durante a noite a 4 ° c.</li>
		<li>Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.</li>
		<li>Adicione 100 μL/poço da solução de trabalho diferente do anticorpo da deteção aos poços apropriados. Selar a placa e incubar em RT para 1 h.</li>
		<li>Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.</li>
		<li>Adicionar 100 μL/poço de solução de HRP diluída a todos os poços. Selar a placa e incubar em RT por 30 min.</li>
		<li>Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.</li>
		<li>Adicionar 100 μL/solução de TMB bem diluída. Incubar a placa longe da luz em RT por 15 min.</li>
		<li>Adicionar 50 μL/solução de paragem de poços (1 M H3po4). Leia a absorvência em 450 nanômetro com um leitor da placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometria de fluxo<ol>
<li>Obter o número total de células de BALF. Lyse os eritrócitos usando ACK lise buffer e lave 2x usando PBS.</li>
		<li>Analise então as suspensões da único-pilha pelo fluxo citometria como descrito previamente11. Para coloração superficial, neutrófilos de manchas (CD11b + GR-1 +) com anticorpos APC anti-mouse CD11b e anti-mouse GR-1 (ly-6G/ly-6C). Colete um mínimo de 3 x 104 células ao vivo, não-detritos para análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Delano, M. J., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system%27s+role+in+sepsis+progression%2C+resolution%2C+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome.</a> Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).</li>
<li>Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).</li>
<li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li>
<li>Reinhart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+Sepsis+as+a+Global+Health+Priority+-+A+WHO+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).</li>
<li>Boomer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+patients+who+die+of+sepsis+and+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure.</a> JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).</li>
<li>Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+immunosuppression%3A+from+cellular+dysfunctions+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34 (3), 250-260 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+Modulates+ROS+and+Impacts+Inflammatory+Response+via+IL-17+Signaling+in+Polymicrobial+Sepsis+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice.</a> PLoS Pathogens. 12 (7), 23(2016).</li>
<li>Pu, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+Deficiency+Intensifies+Inflammasome+Activation+and+Pyroptosis+in+Pseudomonas+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis.</a> Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).</li>
<li>Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).</li>
<li>Chin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+approach+to+eradicate+multidrug+resistant+bacterial+infections+while+mitigating+drug+resistance+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset.</a> Nature Communications. 9 (1), 917(2018).</li>
<li>Nascimento, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-33+contributes+to+sepsis-induced+long-term+immunosuppression+by+expanding+the+regulatory+T+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population.</a> Nature Communications. 8, 14919(2017).</li>
<li>Deng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+investigation+on+the+turning+point+of+over-inflammation+to+immunosuppression+in+CLP+mice+model+and+their+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics.</a> International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros de interesse.

Como o modelo padrão-ouro para a pesquisa de sepse, o CLP tem uma combinação de três insultos, incluindo trauma tecidual causado pela laparotomia, necrose devido à ligadura do cálio, e infecção como resultado de vazamento microbiano que causa peritonite com translocação de bactérias no sangue8. Portanto, o CLP imita a complexidade da sepse humana melhor do que muitos outros modelos. No entanto, uma das principais limitações do modelo CLP atual é a incapacidade de refletir a fase mais prolongada da...

A sepse inicia uma complexa interação de processos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios do hospedeiro e é caracterizada por uma resposta hiperinflamatória e subsequente disfunção imunológica1,2. A sepse representa uma prioridade de saúde global e provoca um elevado número de óbitos em unidades de terapia intensiva (UTI)3. Estima-se que a incidência de sepse exceda 30 milhões casos em todo o mundo por ano, com taxas de mortalidade tão elevadas quanto 30%, apesar dos avanços na gestão da UTI4,5. Em 2017, a Organização Mundial de saúde adotou uma resolução para melhorar a prevenção, o diagnóstico e a gestão desta doença mortal5. No entanto, estudos recentes têm ilustrado que a morte não resulta da infecção primária em pacientes sépticos graves, mas sim da infecção nosocomial secundária (particularmente pneumonia) causada pela imunossupressão6,7 . Portanto, compreender os mecanismos de por que os pacientes sépticos desenvolvem infecção secundária e descobrindo tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários. Nisto, um modelo duplo, igualmente sabido como um modelo da dobro-batida, para estudar o fenômeno imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis protracted é descrito.
Como modelo experimental padrão-ouro em pesquisa sobre sepse polimicrobiana, a ligadura e punção cecal (CLP) é uma cirurgia caracterizada por ligadura e perfuração de caqui, que contribui para a peritonite polimicrobiana e a sepse8,9 . O processo fisiopatológico e os perfis de citocinas, juntamente com a cinética e a magnitude, são semelhantes aos da sepse clínica. A posição da ligadura, o tamanho da agulha utilizada para a punção e o número de punções cecais são fatores importantes que impactam a mortalidade após o CLP.
A pneumonia nosocomial é a principal causa de mortalidade entre pacientes criticamente enfermos com sepse. O principal tipo de organismos causadores de sepse grave inclui Staphylococcus aureus (20,5%), espécies de Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente e. coli, 16,0%) e fungos (19%). Entretanto, estudos recentes sugerem uma incidência crescente de organismos gram-positivos, que agora são quase tão comuns quanto as infecções Gram-negativas3.
O método descrito neste protocolo envolve o CLP, realizado como o "primeiro hit" para induzir a peritonite polimicrobiana subletal, que manifesta uma condição de imunossupressão. O procedimento também envolve a subsequente instilação intranasal de S. aureus como o "segundo hit" para fornecer uma plataforma de pesquisa clinicamente relevante.

<table><tbody><tr><td>21 G 1 &frac12; Agulha</td><td>BD</td><td>BD305167</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>101201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>Biolegend</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos&nbsp;</td><td>Harlan (Indianápolis)</td> <td>C57BL / 6NHsd</td><td></td></tr><tr><td>Luz de mesa</td><td>Fornecimento Geral</td><td>Fornecimento</td><td></td>Geral</tr><tr><td>Toalhetes desinfetantes</td><td>Clorox</td><td>B07NV5JMCS</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Fornecimento geral</td><td>Fornecimento geral</td> Kits <td></td></tr><tr><td>ELISA (mouse IL-1 e beta, IL-6 e TNF e alfa ;)</td><td>Invitrogen</td><td>88-7013, 88-7064 e 88-7324</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Dynarex</td><td>B003U463PY</td><td>PVP Toalhetes de</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Cetamina FORT DODGE</td><td>NDC 0856-2013-01 Injeção de</td><td>cloridrato de amina</td></tr><tr><td>Escala de laboratório</td><td>Fornecimento</td><td>Geral Fornecimento</td><td></td>Geral</tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>Genética molecular, pó</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>ErgoOne</td><td>7100-1100</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal</td><td>Fornecimento geral</td><td>Fornecimento geral Toalha</td><td></td></tr><tr><td>poliforrada</td><td>CardinalHealth, Conversores</td><td>3520</td><td>Campo cirúrgico, estéril, apenas para uso único</td></tr><tr><td>Sutura de seda, 4-0</td><td>DAVIS & GECK</td><td>1123-31</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas para pequenos animais</td><td>Fornecimento</td><td>Geral Suprimentos</td><td></td>Gerais</tr><tr><td>Tesouras para cirurgia de pequenos animais</td><td>Suprimentos Gerais</td> Suprimentos <td>Gerais</td><td></td></tr><tr><td>Pinças cirúrgicas para pequenos animais</td><td>Suprimentos</td><td>Gerais Suprimentos</td><td></td> Gerais</tr> <tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>13301</td><td></td></tr><tr><td>Almofada quente</td><td>Fornecimento Geral</td><td>Fornecimento</td><td></td>Geral</tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>7361-61-7</td><td></td></tr></tbody></table>

projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

A sepse, uma infecção grave e complicada e com risco de vida, caracteriza-se por um desequilíbrio entre respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórios em múltiplos órgãos. Com o desenvolvimento de terapias, a maioria dos pacientes sobrevive à fase hiperinflamatória, mas progride para uma fase imunossupressora, o que aumenta o surgimento de infecções secundárias. Conseqüentemente, a compreensão melhorada da patogénese que subjacente infecções hospital-adquiridas secundárias na fase imunossupressores durante o sepsis é da importância tremenda. Relatado aqui é um modelo para testar os resultados infecciosos, criando infecções de golpe duplo em camundongos. Um procedimento cirúrgico padrão é utilizado para induzir a peritonite polimicrobiana por ligadura cecal e punção (CLP) e seguida por infecção intranasal de Staphylococcus aureus para simular pneumonia ocorrendo na supressão imune que é freqüentemente observada em pacientes sépticos. Este modelo duplo pode refletir o estado imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis prolongado e susceptibilidade à infecção secundária da pneumonia nosocomial. Assim, este modelo fornece uma abordagem experimental simples para investigar a fisiopatologia da pneumonia bacteriana secundária induzida por sepse, que pode ser utilizada para a descoberta de novos tratamentos para sepse e suas complicações.

Dependendo do delineamento experimental e dos procedimentos, os camundongos C57BL/6 foram submetidos ao CLP e, após 3 dias, foram administrados bactérias intranasalmente (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, os camundongos começaram a morrer em ~ 12 h após a indução da peritonite. Dois camundongos no grupo CLP + SA e três camundongos no grupo CLP + NS morreram antes da instilação de S. aureus intranasal. Nenhuma mortali...

Este protocolo descreve as técnicas para medir os resultados infecciosos que subjacentes infecções hospital-adquiridas secundárias na condição imunossupressores, primeiramente estabelecendo camundongos cecal da ligadura/punctura então desafiando os com infecção intranasal a criar um modelo clinicamente relevante de sepse imunossupressor.

Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Prepare o rato para a cirurgia. Raspe os quadrantes inferiores do abdômen usando uma navalha e desinfete a área com iodo. Coloque o mouse sobre uma superfície de trabalho limpa em suas costas com a cabeça apontando para longe do operador.Faça uma incisão longitudinal da pele de cerca de meio centímetro de comprimento no abdômen inferior esquerdo. Tenha cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal. Use uma tesoura pequena para estender a incisão de cerca de um a dois centímetros.Faça uma incisão intramuscular para ter acesso à cavidade peritoneal. Na maioria dos casos, o ceco está no lado esquerdo do abdômen. Isolar o ceco.Usando fórceps anatômicos, expõe suavemente e cuidadosamente o ceco através da incisão. O passo quatro é a ligadura. A posição da ligadura no ceco determina o nível de gravidade da sepse.Ligar aproximadamente 75% do ceco induz sepse grave. Ligando 50% do ceco induz sepse de nível médio. Considerando que ligar 25% ou menos do ceco resultará em sepse menor.Ligate o ceco na posição designada. Certifique-se de não ligar a válvula ileocecal. O passo cinco é perfurar o ceco.Usando uma agulha, perfure o ceco com uma única perfuração no meio da via entre a ligadura e

design-cecal-ligation-puncture-intranasal-infection-dual-model-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O modelo do rato de ligadura e punção cecal como uma ferramenta valiosa para o estudo da sepse humana.

Procedimento de punção cecal Ligadura

Sepse se refere a uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica resultante de uma infecção microbiana, e pode ser simulado por uma técnica cirúrgica chamada ligadura e perfuração cecal (CLP). Aqui nós descrevemos um método para usar CLP-induzida modelo animal para a tela ervas medicinais para agentes terapêuticos.

Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Este protocolo fornece as etapas necessárias para estabelecer e avaliar a sepse neonatal em ratos de 7 dias de idade.

Um modelo de Mouse controlado para sepse Neonatal Polymicrobial

A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Aqui, apresentamos um método eficaz e eficiente para injeções de veias da cauda de roedores usando um dispositivo de aquecimento/contenção exclusivamente projetado. Ao simplificar o início dos processos de vasodilatação e contenção, este protocolo permite injeções intravenosas precisas e oportunas de grandes grupos de animais com o mínimo de angústia.

Um dispositivo de aquecimento/contenção contemporâneo para injeções eficientes de veia de cauda em um modelo de sepse fúngica murina

Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.

Avaliação de um Biomarcador Confiável em um Modelo de Sepse de Camundongo Induzido por Ligadura Cecal e Punção

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de imunossupressão de sepse em camundongos por meio da instilação intranasal de Klebsiella pneumoniae e validamos o modelo por meio de vários indicadores.

Estabelecimento de um modelo de imunossupressão induzida por sepse em camundongos por instilação intranasal de bactérias

A recentemente desenvolvida romance de partículas de aglutinação do ensaio (PA) utilizando molécula receptora vírus permitiu uma identificação rápida e fácil de poliovírus (PV). Neste artigo, vamos mostrar o procedimento para o ensaio PA para identificação PV.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

Aprenda a estabelecer um modelo duplo de ligadura cecal e punção com infecção intranasal em camundongos para estudar imunossupressão induzida por sepse e infecções secundárias. Este protocolo auxilia pesquisadores a compreender mecanismos de infecção hospitalar.

Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

Explorar mais vídeos