Name: Medição direta do KDM1A Target Engagement usando imunoensaios baseados em Quimiosonda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprenda a medir o engajamento do alvo KDM1A usando imunoensaios baseados em quimiosonda em amostras de células e tecidos. Este método permite quantificar diretamente a ocupação do alvo por inibidores.

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Este estudo foi financiado pela ORYZON Genomics. S.A., Hoffman-la Roche, e parcialmente apoiada pelo programa de colaboração CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.

<ol><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li>
<li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1%3A+biologic+roles+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-1001%2C+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor%2C+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li>
<li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li>
<li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-Specific+Histone+Demethylase%2C+LSD1%2C+%28KDM1A%29+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601(2015).</li>
<li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22HemaSphere%22%5BJournal%5D)">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54(2018).</li>
<li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li>
<li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RN-1%2C+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor%2C+increases+%CE%B3-globin+expression%2C+F+reticulocytes%2C+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li>
<li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li>
<li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+LSD1%2FMAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).</li>
<li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li>
<li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li>
<li>Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).</li>
<li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).</li>
<li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li>
<li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li>
<li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+%28LSD1%29+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000(2017).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-2001%3A+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).</li>
</ol>

A autora Tamara Maes é diretora executiva e acionista, e os autores Cristina Mascaró e Raquel Ruiz Rodriguez são funcionários da ORYZON Genomics S.A. ORYZON Genomics S.A. desenvolve inibidores da KDM1A e detém patentes abrangendo compostos e métodos utilizados Neste artigo.

O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A usando um romance KDM1A com base na captura de quimiosonda ELISA. O método foi validado em linhagens de células humanas cultivadas e amostras ex vivo de humano, rato e rato e babuíno (incluindo PBMCs, pulmão, cérebro, pele, tumores), mas pode ser prontamente aplicada a outras espécies em que o anticorpo KDM1A resumos alvo e catalítico Centro são conservadas. Como OG-881 é um quimioprobe baseado na atividade, a qualidade da am...

O demetilase específico 1 de lysine (KDM1A)1 é um demetilase envolvido no controle da transcrição do gene. Esta proteína emergiu como um alvo farmacológico candidato2 em Oncologia; incluindo leucemia mielóide aguda3 (AML), síndrome de mielodisplasia (MDS)4, mielofibrose (MF)5,6, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC)7; em doença falciforme (SCD)8,9, e em doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer (AD), esclerose múltipla (MS); e na agressão10.
A maioria dos compostos inibidores da KDM1A no desenvolvimento clínico são derivados da ciclopropilamina e inibem a proteína por ligação covalente ao seu cofator11de flavina-dinucleotídeo (FAD). A inibição da KDM1A induz alterações na expressão gênica, mas essas alterações variam enormemente nos tecidos, tipos de células ou casos de doença. A inibição da KDM1A também altera as marcas de histona12, mas essas mudanças são geralmente produzidas localmente em um local específico no genoma, e são novamente, altamente tecido e células específicas.
O protocolo foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A em amostras biológicas e foi otimizado para o uso com inibidores derivados da ciclopropilamina. O ensaio é baseado na tecnologia ELISA e analisa, em paralelo, total e livre (ou seja, não acoplado por inibidor) KDM1A em um extrato de proteína nativa de uma amostra biológica em um ensaio de fase sólida. Como primeiro passo, a amostra biológica é lisada na presença da quimiosonda seletiva biotinilada KDM1A og-88113,14, derivada do inibidor seletivo KDM1A Ory-1001 (iadademstat), um potente inibidor da KDM1A em clínica desenvolvimento para o tratamento da doença oncológica. O chemoprobe tem um IC50 para KDM1A de 120 nanômetro e inclui um metade obrigatório do FAD lig a um polietileno biotinylated glicol (PEG)-cauda. A quimiosonda liga-se exclusivamente à KDM1A livre, mas não à KDM1A associada ao inibidor na amostra. Após a ligação do chemoprobe, os KDM1A que contêm complexos na amostra são capturados em placas do de microtitulação com a superfície revestida estreptavidina para determinar o KDM1A livre, ou em placas revestidas com um anticorpo KDM1A monoclonal da captação para determinar o KDM1A total. Após a lavagem, ambas as placas são incubadas com um anticorpo de detecção KDM1A, lavadas novamente, e incubadas com um anticorpo de IgG anticoelho conjugado HRP secundário para detecção usando um substrato luminescente e quantificação por medição relativa de luz (RLU) num luminômetro (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figura 1. Esquema de ELISA enzima lig o ensaio immunoabsorvente do chemoprobe para o acoplamento do alvo KDM1A: A) determinação do total KDM1A usando o sanduíche ELISA e B) determinação do KDM1A livre usando o quimioprobe Elisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Uma curva padrão é incluída em ambas as placas ELISA para verificar a linearidade de cada ensaio. A determinação do engajamento alvo de KDM1A em cada amostra é então calculada como um valor relativo para a amostra pré-dose ou tratada pelo veículo.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 X Comprimidos Inibidores de Protease</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td></td></tr><tr><td>96 bloco de armazenamento de poços profundos</td><td>VWR</td><td>#734-1679</td><td></td></tr><tr><td>96 placas ELISA de 96 poços Adesivo</td><td>Nunc</td><td>#436110</td><td></td></tr><tr><td>Filme preto adesivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>#6050173</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo película transparente</td><td>VWR</td><td>#60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Sonda KDM1A biotinilada OG-881</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>Albumina</td> de soro bovino NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td># 3117057001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23208)Ensaio</td><td></td></tr> de <tr><td>proteína de Bradford</td><td>BioRad</td><td>#500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise celular 10X</td><td>Cell Signaling</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para placas de 96 poços</td><td>Hettich</td><td>Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td>Thermo Scientific</td><td>#156499</td><td></td></tr><tr><td>Comprimento total, enzimaticamente ativo humano Recombinante LSD1 / KDM1A</td><td>Active Motif</td><td>#31426</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5 Project</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Luminol-Enhacer e Solução de Peróxido (Substrato Quimioluminescente)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#37074</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Infinite 200-Tecan</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de captura monoclonal de camundongo Anti-KDM1A (epítopo N-terminal)</td><td>Abcam</td><td>#ab53269</td><td></td></tr><tr><td>Agulha G18 gauge blunt</td><td>BD</td><td>#303129</td><td></td></tr><tr><td>ORY-1001 (iadademstat)</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>Tubos</td> de separação NA <td></td></tr><tr><td>PBMC 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#163288</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de separação PBMC 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227288</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Rotamax 120</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 20</td><td>Sigma</td><td>#P7949</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção monoclonal de coelho Anti-KDM1A (epítopo C-terminal)</td><td>Sinalização celular</td><td>#672184BF-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário Burro conjugado com peroxidase Burro Anti-coelho IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>#31458</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de espectrofotômetro 1.5</td><td>Deltalab</td><td>#302100</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro para cubeta</td><td>GE Healthcare</td><td>GeneQuant 1300</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin</td><td>Promega</td><td>#Z704A</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>#303172</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 1 água ultrapura</td><td>Millipore Milli-Q</td><td>Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassónico</td><td>VWR</td><td>USC200T</td><td></td></tr></tbody></table>

medição direta do kdm1a target engagement usando imunoensaios baseados em quimiosonda

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

A avaliação do engajamento alvo, definida como a interação de um fármaco com a proteína para a qual foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de fármacos ou em projetos de pesquisa básica. No Epigenetics, o acoplamento do alvo é avaliado o mais frequentemente pela análise de marcadores do proxy em vez de medir a União do composto ao alvo. Os leituras biológicos a jusante que foram analisados incluem a modulação da marca do histona ou as mudanças da expressão de Gene. KDM1A é uma desmetililase de lisina que remove grupos metilo de mono e H3K4 dimetilizados, uma modificação associada ao silenciamento da expressão gênica. A modulação dos marcadores do proxy é dependente do tipo e da função da pilha da make-up genética das pilhas investigadas, que pode fazer a interpretação e a comparação do Cruz-caso completamente difícil. Para contornar estes problemas, um protocolo versátil é apresentado para avaliar os efeitos da dose e a dinâmica do acoplamento direto do alvo de KDM1A. O ensaio descrito faz uso de uma quimiosonda KDM1A para capturar e quantificar a enzima desinibida, pode ser amplamente aplicada a células ou amostras de tecido sem a necessidade de modificação genética, tem uma excelente janela de detecção, e pode ser usado tanto para pesquisa básica e análise de amostras clínicas.

A linearidade da determinação KDM1A total e livre.
Uma série padrão foi preparada conforme descrito na etapa 5.3.2., usando 0 a 2500 PG de enzima recombinante humana KDM1A de comprimento total. Os valores de RLU de rKDM1A total e livre foram avaliados para verificar a linearidade (Figura 2a e 2B). Os dados são representados como média a partir de 3 experimentos com ...

Aqui, apresentamos um protocolo para medir KDM1A engajamento alvo em uma célula humana ou animal, tecido ou amostras de sangue tratadas com inibidores da KDM1A. O protocolo emprega a marcação do chemoprobe da enzima livre de KDM1A e a quantificação direta da ocupação do alvo usando immunoensaios quimioprobe-baseados e pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos.

Medição direta do KDM1A Target Engagement usando imunoensaios baseados em Quimiosonda

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

A avaliação do engajamento-alvo, ou seja, a interação de uma droga com a proteína para a que foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de medicamentos, ou em projetos básicos de pesquisa. A principal vantagem desta técnica é que permite a medição direta do efeito da dose e a dinâmica do engajamento do alvo KDM1A, em vez de medições de efeitos a jusante, como marcas de histona e expressão. Essa técnica pode ser aplicada em pesquisas básicas e também em ensaios clínicos, em CNS oncológico ou outras doenças sujeitas ao tratamento com inibidor de KDM1A para estudar farmacodinâmica.Esta técnica é baseada em uma quimioterapia desenvolvida para estudar ORY-1001, iadademstat, mas pode ser realmente usada para outros inibidores de KDM1A e a estratégia pode ser aplicada a outros alvos. O procedimento será demonstrado por Raquel Ruiz, gerente de operações da plataforma de descoberta PK/PD do meu laboratório. Durante o tratamento celular com ORY-1001 o composto se liga à proteína KDM1A presente no núcleo.Para iniciar este procedimento, recupere uma alíquota de uso único de 10 microliteres de 20 mililitros biotiniled sonda OG-881 solução de estoque da geladeira e deixe-a aquecer à temperatura ambiente por 10 minutos. Usando um micropipet com pontas de filtro, diluir em série a solução de estoque para preparar a solução de trabalho de dois micromolares. Em seguida, dissolva um comprimido de inibidor de protease em um mililitro de PBS em um tubo de microcentrifuuge.Para cada mililitro do volume desejado de 1x tampão de lise celular com o quimióbio, misturar 100 microliters de tampão de lise celular de 10x obtidos comercialmente, 150 microliters do inibidor de protease de 10x, 12,5 microliters das duas soluçãos de trabalho micromolar OG-881 e 737,5 microliters de água dupla destilada tipo 1. As células são lísedas em 1x tampão de lise na presença da quimioterapia que se liga a qualquer proteína KDM1A livre. Para se preparar a partir de tecidos, use uma argamassa e pilão que são refrigerados em gelo seco para pulverizar e homogeneizar um pedaço cúbico de centímetro de tecido congelado.Aliquotar o tecido em frascos de uso único, certificando-se de transferir aproximadamente 40 miligramas de pó de tecido para cada frasco, evitando descongelar o tempo todo. Armazene as amostras a 80 graus Celsius até que estejam prontas para o processo. Para se preparar a partir de pelotas celulares, resuspenha a pelota de aproximadamente 10 milhões de células em 200 microliters de 1x tampão de lise celular contendo 25 nanomolar OG-881.Vórtice cada amostra brevemente e mantê-los no gelo por cinco minutos. Usando um sonicator, sonicate as amostras com três pulsos a 45 kilohertz durando 20 segundos cada. Coloque as amostras no gelo por 20 segundos entre os pulsos.Mantenha as amostras no gelo por mais cinco minutos. Em seguida, o vórtice brevemente e centrífuga as amostras a 14.000 vezes G por 10 minutos em uma centrífuga que é pré-refrigerado a quatro graus Celsius. Usando um micropipet de um mililitro, transfira cada supernacido em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.Deixe os tubos no gelo por duas horas antes de processar. Em seguida, quantifique a proteína nativa usando o ensaio de Bradford, conforme descrito no protocolo de texto. Uma placa total é revestida com anticorpo anti-KDM1A.Placa livre é revestida com streptavidin. O lysato celular é então adicionado às duas placas e o complexo KDM1A é capturado diretamente ou através da quimioterapia. As placas são lavadas e incubadas com o anticorpo de detecção anti-KDM1A e um anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rabanete.Finalmente, substrato luminescente é adicionado e gerado sinal. Para o total de KDM1A ELISA, prepare 10 mililitros de anticorpo de captura KDM1A em PBS para uma concentração final de dois microgramas por mililitro para cada placa. Transfira 100 microliters para cada poço da placa.Para o KDM1A ELISA gratuito, prepare 10 mililitros de streptavidina na PBS como uma concentração de 10 microgramas por mililitro para cada placa. Transfira 100 microliters para cada poço da placa. Em seguida, selar cada placa com filme adesivo e incubar durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, retire as placas da geladeira e deixe que elas se equilibrem à temperatura ambiente por aproximadamente 45 minutos. Lave cada placa três vezes com tampão de lavagem, certificando-se de tocar a placa em toalhas de papel após cada etapa de lavagem para remover qualquer solução residual. Adicione 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço de ambas as placas.Feche as placas com filme adesivo e incubar em temperatura ambiente por duas horas. Enquanto isso, diluir os extratos de proteína nativas obtidos anteriormente com PBS para a concentração apropriada e estabelecer a placa para preparar uma curva padrão usando rKDM1A humano como descrito no protocolo de texto. Após a conclusão da incubação de duas horas, descarte o tampão de bloqueio e lave as placas com tampão de lavagem, certificando-se de tocar a placa em toalhas de papel após cada etapa de lavagem para remover qualquer solução residual.Transfira as amostras diluídas apropriadas para um bloco de armazenamento de poços profundos refrigerado 96 após a distribuição da placa encontrada na tabela dois do protocolo de texto. Mantenha este bloco no gelo enquanto tubos 100 microliters por poço no total e livre placas ELISA seguindo a distribuição da placa encontrada na tabela três do protocolo de texto. Incubar em temperatura ambiente por uma hora, depois descartar as amostras e lavar as placas cinco vezes com tampão de lavagem.Prepare 20 mililitros de anticorpo de detecção anti-KDM1A de coelho no bloqueio de buffer a uma concentração de 0,125 microgramas por mililitro. Adicione 100 microliters da solução de anticorpos de detecção a cada poço de ambas as placas, exceto aqueles correspondentes aos controles negativos. Cubra as placas com filme adesivo e incubar em temperatura ambiente por uma hora.Depois disso, descarte a solução de anticorpos de detecção e lave as placas seis vezes com tampão de lavagem. Prepare 25 mililitros de anticorpo anti-coelho de cabra secundário, HRP, para uma diluição de 1 a 5.000 no tampão de bloqueio. Adicione 100 microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço das placas de microtítiter e incubar à temperatura ambiente por uma hora.30 minutos antes do término desta incubação, misture partes iguais de melhorador de luminol e solução de peróxido em uma garrafa âmbar sob condições de luz macia. Deixe essa mistura em temperatura ambiente. Quando a incubação de uma hora estiver completa, descarte a solução secundária de anticorpos e lave as placas seis vezes com tampão de lavagem.Em seguida, pipet 100 microliters da solução de trabalho luminol para cada poço das placas, certificando-se de pipet muito lentamente para evitar a formação de bolhas. Use um temporizador para controlar o tempo entre a adição da solução e a medição de luminescência das placas e mantenha este tempo constante para obter uma boa reprodutibilidade entre ensaios. Feche as placas com filme adesivo e centrífuga a 500 vezes G e à temperatura ambiente por 45 segundos para eliminar quaisquer bolhas restantes.Incubar as placas em um agitador de pratos a 100 rpm por um minuto. Em seguida, remova a película adesiva e insira a placa em um leitor de microplacão e deixe-a por três minutos para estabilizar a temperatura a 25 graus Celsius. Leia as unidades relativas de luminescência de cada ensaio de placa ELISA.Salve e copie os valores brutos de RLU dos arquivos de planilha de dados brutos para análise posterior. Neste estudo, um novo ELISA baseado em captura de quimioterapia KDM1A é usado para medir diretamente o engajamento do alvo KDM1A em células e amostras de tecido. Os valores RLU de rKDM1A total e livre são avaliados para verificar a linearidade.Os valores RLU de KDM1A total e gratuito detectados em PBMCs humanos de três voluntários independentes são então sobrepostos na curva padrão. As células AML são cultivadas seguindo as recomendações do provedor e são tratadas com qualquer veículo ou ORY-1001 em diferentes concentrações. O extrato de proteína nativa é obtido na presença de 25 milimônios OG-881 chemoprobe e 0,5 microgramas de proteína total é usado para realizar a análise do engajamento-alvo.KDM1A total e gratuito são então determinados e as porcentagens de engajamento-alvo de ORY-1001 para KDM1A são calculadas em relação ao veículo. O engajamento direcionado de KDM1A responsivo em PBMCs e no tratamento pulmonar de ratos com ORY-1001 por gavage oral, calculado relativo o grupo de veículos é mostrado aqui. A incubação ex vivo com 25 ory-1001 nanomolar de extratos de proteína pulmonar dos animais tratados com veículos, produz TE completo, no entanto, mas não aumenta ainda mais o TE em amostras de ratos tratados por quatro dias com 30 microgramas por quilograma ORY-1001, confirmando que o KDM1A já estava totalmente inibido in vivo.Este protocolo avalia o engajamento de alvos do KDM1A medindo KDM1A gratuito e total. Lembre-se que requer extração de proteína nativa. Esta técnica pode ser usada em amostras de diferentes espécies para avaliar um inibidor específico, também para testar novos inibidores.A quimioterapia utilizada neste estudo também pode ser aplicada para quimioproteômica para estudar o interajoo KDM1A. Lembre-se de trabalhar com segurança e respeito em todas as medidas preventivas ao manusear amostras biológicas e compostos bioativos como o inibidor KDM1A.

direct-measurement-kdm1a-target-engagement-using-chemoprobe-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Aqui, apresentamos um protocolo para co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para estudar simultaneamente a contribuição de domínios da proteína específica dos receptores de membrana plasmática ao recrutamento de enzima e atividade enzimática.

Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Medições de engajamento do alvo de drogas são centrais para droga eficaz desenvolvimento e validação de sonda química. Aqui, detalhamos um protocolo para medição engajamento de droga-alvo utilizando imagens de conteúdo de alta em uma adaptação de microplacas-compatível do ensaio celular mudança térmica (CETSA).

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Esses protocolos fornecem a metodologia utilizada para avaliar a atividade enzimática de membros individuais da família de proteínas metiltransferase (PRMT) nas células. Diretrizes detalhadas sobre a avaliação da atividade prmt usando biomarcadores endógenos e exógenos, anticorpos de reconhecimento de metila-arginina e compostos de ferramentas inibidoras são descritos.

Métodos Quantitativos para Estudar Proteína Arginina Metiltransferase 1-9 Atividade em Células

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.

Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Este protocolo descreve um ensaio de bloqueio para inibidores de PD-1/PD-L1 usando tecnologia de ressonância plasmônica de superfície. Ele emprega uma estratégia de imobilização em duas etapas e um sistema tampão personalizado para medir com precisão as unidades de resposta, facilitando a avaliação das taxas de bloqueio de compostos ou produtos biológicos. Além disso, suporta a identificação de alto rendimento de inibidores de PD-1/PD-L1.

Identificação de inibidores de PD-1/PD-L1 com tecnologia de ressonância plasmônica de superfície

Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.

Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas

Aprenda a medir o engajamento do alvo KDM1A usando imunoensaios baseados em quimiosonda em amostras de células e tecidos. Este método permite quantificar diretamente a ocupação do alvo por inibidores.

Medição direta do KDM1A Target Engagement usando imunoensaios baseados em Quimiosonda

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