Um trabalho-economia e repetível Touch-Force sinalização mutante Screen Protocol para o estudo de Thigmomorphogenesis de uma planta modelo Arabidopsis Arabidopsis thaliana
August 6th, 2019
Uma máquina de carregamento suave de força de toque é construída a partir de escovas de cabelo humano, braços robóticos e um controlador. As escovas do cabelo são conduzidas por braços robóticos instalados na máquina e movem-se periodicamente para aplicar a toque-força em plantas. A força dos toques de cabelo acionado por máquina é comparável à dos toques aplicados manualmente.
Construímos uma máquina automática de força de toque para observar a morfogênese do sinal da planta. Os braços robóticos que instalei com escovas de cabelo humanas para aplicar força de toque suave nas plantas. Em comparação com o toque humano do dedo, a máquina automática de toque de cabelo humano pode oferecer mais economia de mão-de-obra, um carregamento uniforme de força de toque.
O tempo necessário para uma rodada de carregamento de força pode ser restringido em vários minutos. Em comparação com várias horas de toque de dedo e um toque de cotonete, a máquina robótica pode melhorar em grande parte a pesquisa de resposta mercantilista da planta. Ao aumentar a eficiência e a população de plantas tratadas, prevemos que a máquina de toque automático será aplicada em quatro telas mutantes sinalizadoras e nos estudos de resposta mercantilista em plantas e animais.
Para começar, teste a taxa de germinação de cada genótipo após a nutrição de sementes em uma placa de ágar de 8% com meio MS por sete dias. De acordo com a taxa de germinação, prepare as sementes quatro a cinco vezes mais do que o número desejado de plantas a serem produzidas. Mergulhe as sementes em água fria em tubos plásticos de 1,5 mililitro e cubra com papel alumínio para manter no escuro.
Armazene a quatro graus celsius para imbibição de sementes. Cinco a sete dias após a imbibição, selecione o solo apropriado para o crescimento das plantas. Evite grandes aglomerados e use um garfo para misturá-los de forma homogênea.
Prepare 24 copos plásticos de 207 mililitros com diâmetro superior da aro de 7,4 centímetros. Faça três furos redondos na parte inferior dos copos para fins de irrigação. Encha esses copos de plástico com solo misto.
Deixe o solo acumular cerca de um centímetro mais alto que a borda do copo e use uma régua para achatar a superfície do solo empilhado suavemente. Transfira 24 xícaras para uma bandeja de plástico. Defina a intensidade leve da câmara de crescimento entre 180 e 240 microeínsteinos por segundo por metro quadrado, que é maior do que a radiação ativa fotossintética para o rápido crescimento das plantas.
Defina a condição de luz para ser 24 horas constante. Coloque a temperatura da câmara de crescimento em 23,5 acres ou menos 1,5 graus celsius e umidade entre 35 e 45% Adicione 2,5 litros de água em cada bandeja. Deixe que o solo absorva a água dos orifícios localizados na parte inferior dos copos e espere que a superfície do solo caia até o nível da borda do copo.
Duas horas depois, semeie de três a quatro sementes em um único local e quatro pontos distribuídos uniformemente dentro de um copo. Coloque uma tampa de plástico transparente acima de cada bandeja e deixe as sementes germinarem por uma semana. Em seguida, remova a tampa e deixe as mudas crescerem por mais uma semana.
Irrigar plantas com 1,5 litros de água a cada dois dias após a germinização das sementes. Nove a dez dias após a semeadura de sementes, remova os brotos extras diminuindo. Use uma tesoura minúscula para cortar as calhas e evite retirar toda a planta do solo diretamente.
Três a quatro indivíduos de plantas de tamanho semelhante em cada xícara. Para instalar escovas de cabelo sensíveis ao toque nos braços robóticos, primeiro use cola para fixar uma camada de cabelo humano uniformemente em uma régua de aço de 330 milímetros de comprimento. O comprimento do cabelo é de 126 milímetros.
Com dois grampos de metal, coloque as réguas de aço nos braços robóticos. No painel de controle, defina a altura dos braços da máquina ao longo da dimensão vertical pressionando Jog F plus para levantar e Jog R menos para baixar os braços e pincéis robóticos. Mantenha a ponta das escovas de cabelo 5 centímetros mais baixa que a borda do copo.
Pressione o Inc F plus ou R menos para pré-correr a máquina de um a dois ciclos para garantir que todos os indivíduos da planta estejam sendo tocados. Antes do experimento oficial, use uma escala eletrônica para medir a força de toque. Ajuste a altura dos braços da máquina para manter a força de toque entre um a dois mililitros.
Em seguida, defina a posição inicial dos braços da máquina ao longo da dimensão horizontal manualmente. Deixe os escovas de cabelo pendurados na borda de cada bandeja. Pressione Jog F plus ou Jog R menos para mover o braço da máquina horizontalmente pouco a pouco para ter certeza de que nenhuma planta está sendo tocada antes do início do experimento de toque.
Coloque a escova de cabelo viajando distância na dimensão horizontal para 365 milímetros pressionando o botão de viagem. Press Inc F plus ou R menos para mover os braços da máquina para obter uma distância completa de viagem e garantir que todas as plantas tratadas estão sendo tocadas. Em seguida, pressione o botão de velocidade automática para definir a velocidade de movimento ao longo do eixo x dos braços da máquina a 5000 milímetros por minuto.
Pressione o botão de ciclo menor para definir o tempo de toque em 20 ensaios, o que equivale a 40 toques por rodada. Defina o intervalo de repetição da rodada de toque em 480 minutos por dia pressionando o botão de período principal que permite que escovas de cabelo toquem nas plantas por três rodadas por dia com um intervalo de oito horas. A máquina iniciará uma nova rodada de toque automaticamente quando a contagem regressiva virar zero.
Defina o ciclo principal em 12 ensaios para permitir que a máquina toque nas plantas por 12 rodadas dentro de um período de quatro dias. Pressione o botão iniciar para iniciar o programa predefinido. Ajuste e calibrar as escovas e as pontas dos cabelos para a mesma altura todos os dias durante todo o período de toque.
Para acompanhar o dia de aparafusamento de cada planta dentro de um experimento tocante, observe o primeiro tronco inflorescente de cada planta todos os dias. Meça o comprimento e regise a duração do crescimento quando atingir um centímetro, o que significa que passou da fase vegetativa para a fase reprodutiva. A medida do raio de roseta, tire fotos de toda a bandeja do topo.
Use um software de processamento de imagem para medir a distância do centro de rosetas até a ponta da folha mais longa com a borda do copo como uma régua. Para medir a área de roseta, primeiro, remova a inflorescência sem afetar o resto dos órgãos de roseta. Tire fotos do topo de cada planta junto com uma régua de escala colocada nas proximidades.
No software de processamento de imagem, meça a área horizontal de superfície bidimensional das folhas de roseta. Neste experimento, o tratamento manual de toque de algodão foi comparado com o tratamento de toque de cabelo impulsionado por máquina no controle do tipo selvagem Columbia zero plantas. O parafuso atrasou 1,7 dias após o tratamento contínuo de toque de cotonete.
Da mesma forma para o toque de cabelo automático impulsionado pela máquina, observou-se o parafuso atrasado. A análise de riscos univariados de Cox mostra que o risco de aparafusamento das plantas no grupo de toque é de 31% e 52% em comparação com as plantas do grupo controle, respectivamente. No entanto, esse atraso não foi observado em mutantes insercionais tDNA, NKK um e NKK dois.
O modelo de riscos proporcionais de Cox univariado mostra que apenas o tipo selvagem Columbia zero apresentou uma diferença significativa entre as plantas de controle e toque com um HR estimado de 41. Para alterações morfológicas, a planta do tipo selvagem Columbia zero mostrou um raio de roseta significativamente menor e comprimento de folha mais curto após três dias de toque de cabelo automático constante e repetitivo. A área projetada de roseta foi alterada de 20 para 16 centímetros quadrados após 13 dias de toque.
Para garantir que o carregamento da força de toque não leve ao ferimento, a força de toque apropriada precisa ser definida cuidadosamente. Um conjunto de condições adequadas de crescimento são necessárias para produzir uma planta de Arabidopsis adequada para ensaio de resposta ao toque. Por exemplo, 24 horas de intensidade de luz entre 180 e 240 microeínsteis por metro quadrado por segundo são necessárias para observar a morfogênese do sinal.
Para estender-se às outras formas de carregamento de força mecânica, a máquina também pode ser modificada com bico de aspersão de água ou sopradores de vento para imitar efeitos de chuva ou vento, respectivamente no futuro.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma máquina de carga de força por toque automatizada utilizando escovas de cabelo humanas e braços robóticos para explorar a morfogênese do sinal da planta. O dispositivo permite a aplicação uniforme de força de toque nas plantas, aumentando significativamente a eficiência em comparação com os métodos manuais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Sinalização e resposta das plantas
- Automação na pesquisa biológica
- Metodologias eficientes de tratamento de plantas
Fundamentos
- Os métodos tradicionais para aplicar forças de toque nas plantas são trabalhosos e demorados.
- O desenvolvimento de sistemas robóticos pode melhorar a consistência e a velocidade experimental.
- Este estudo visa melhorar as respostas das plantas a estímulos mecânicos por meio da automação.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de uma máquina de força por toque robótica com escovas de cabelo humanas para aplicação consistente de força.
- Pesquisa focada em plantas Arabidopsis durante seus estágios de desenvolvimento.
- Abordagens tecnológicas incluem ciclos de toque automatizados e condições ambientais controladas.
Principais Resultados
- O sistema automatizado fornece forças de toque comparáveis à aplicação manual.
- Melhorias na eficiência observadas tanto no tempo de tratamento quanto nas populações de resposta das plantas.
- A implementação bem-sucedida demonstrou potencial para aplicações mais amplas em triagens de mutantes de sinalização.
Conclusões
- Este estudo destaca a eficácia da automação robótica na pesquisa de fisiologia vegetal.
- As descobertas sugerem que o toque mecanizado pode simplificar significativamente os processos de pesquisa, auxiliando em estudos genéticos e de sinalização.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automated mechanical stimulation platforms address bottlenecks in phenotypic screening for mechanotransduction pathways, enabling higher throughput and reproducibility in target validation studies. By reducing labor-intensive manual force application, the method supports scalable assessment of genetic mutants in mechanosensitive signaling networks. This positions the technology as a enabling tool for early discovery workflows focused on force-sensing mechanisms in model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of touch-force signaling mutants such as MKK1 and MKK2 to clarify mechanistic roles in mechanotransduction.
- Operational Value: Provides repeatable, quantifiable touch-force application reducing variability from manual handling.
- Predictive Value: Supports phenotypic comparison of wild-type and mutant lines under standardized mechanical stress to de-risk target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological outputs (e.g., rosette radius, bolting timing) for high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Allows unlimited touch rounds with adjustable force strength, enabling dose-response-like experimental designs.
- Assay Readiness: Compatible with alternative touch materials (e.g., animal hair, silk) and environmental simulators (rain, wind) for assay flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular mutants to organism-level phenotypic changes under mechanical stress, supporting pathway validation.
- Mechanistic De-risking: Enables statistical evaluation of touch response differences between genotypes, informing target confidence.
- Model Relevance: Uses Arabidopsis thaliana as a genetically tractable system to study conserved mechanosensitive signaling principles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a standardized mechanical stimulus for phenotypic screening of signaling mutants prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase-dependent touch signaling pathways through controlled force application and phenotypic readouts.
- Screening: Enables reproducible, high-throughput touch-force delivery for mutant screening campaigns with measurable growth and developmental outputs.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of bolting delay, rosette area, and leaf length for statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Connects molecular phenotypes (e.g., MKK1/MKK2 mutants) to whole-plant mechanomorphogenic responses, supporting target validation.
- Enterprise Reuse: Platform design allows adaptation to other mechanical stimuli (wind, rain) and model systems, supporting cross-project utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in force-sensing pathways through standardized, repeatable phenotypic assays.
- Operational Value: Increases experimental throughput by reducing touch-force application time from hours to minutes per round.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in target validation by minimizing false positives from manual force variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanosensitive targets based on reproducible phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth conditions, mechanical stimulation protocols, and image-based phenotyping.
- Needs robotic arm system, custom touch-material fixtures, and environmental control chambers for reproducible results.
- Demands standardization of touch force (1–2 mN), timing intervals, and environmental conditions across users and sites.
- Adaptation considerations include exchanging touch materials (hair, silk, cotton) and adding nozzles for rain/wind simulation.
- Practical limitations include dependency on consistent plant size and developmental stage for comparable touch response measurements.
